الرحم-البوقي نقل الأجنة وقطع القناة الدافقة في نموذج الفأر

Summary

يستخدم-الرحم البوقي نقل الأجنة في الرحم الوصل الأنبوبي كحاجز لمنع تدفق الجنين التي قد تحدث عند تنفيذ نقل الرحم. ويلزم الذكور أجريت لهم هذه العمليات للحصول على المتلقين pseudopregnant لنقل الأجنة. وتناقش كل من التقنيات.

Abstract

نقل الأجنة الإناث سابق للانغراس إلى بديل هو خطوة لازمة لإنتاج الفئران المعدلة وراثيا أو لدراسة الآثار المترتبة على تعديلات جينية نشأت أثناء التطور سابق للانغراس على التنمية وتعليم الكبار صحة الجنين اللاحقة. استخدام تقنية فعالة ومتسقة نقل الأجنة أمر بالغ الأهمية لتعزيز جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا وتحديد تأثير العلاجات المختلفة على معدلات البقاء على قيد الحياة لغرس والمدى. وعادة ما يتم نقل الأجنة في مرحلة الكيسة عن طريق التحويل الرحم، وأداء ثقب في جدار الرحم لإدخال ماصة التلاعب الجنين. فتحة أجريت في الرحم لا يغلق بعد أن تم سحب ماصة، ويمكن للأجنة تدفق إلى تجويف البطن بسبب الضغط الايجابي من الرحم. ثقب يمكن أن تنتج أيضا من نزيف في أن يضعف زرع، وكتل ماصة نقل ويمكن أن تؤثر الجنين دالتطور، وخاصة عندما يتم نقل الأجنة دون زونا. بالتالي، هذا الأسلوب غالبا ما يؤدي إلى انخفاض معدلات بقاء الجنين متغير جدا والشاملة. تجنب هذه الآثار السلبية، البوقي-الرحم نقل الأجنة الاستفادة من مفرق-الرحم البوقي كحاجز طبيعي أن يعرقل تدفق الجنين وتجنب ثقب في جدار الرحم. ويلزم الذكور أجريت لهم هذه العمليات للحصول على المتلقين pseudopregnant. يوصف تقنية لإجراء عملية قطع قناة المني كتكملة لنقل الجنين داخل الرحم، الأنبوبي.

Introduction

نقل الأجنة وربما كان إجراء العمليات الجراحية الأكثر شيوعا التي تؤدى في نموذج الفأر. هذه التقنية أمر ضروري للحصول على ذرية من الأجنة في المختبر تعرض لتقنيات التلاعب، وبالتالي، يشكل خطوة ضرورية لتطوير نماذج المعدلة وراثيا عن طريق الحقن pronuclear، تنبيغ lentiviral، أو تشكيل الوهم. الى جانب ذلك، هذه التقنية تسمح دراسة الآثار التنموية من الشتائم المتنوعة التي تحدث أثناء تطور سابق للانغراس. استخدام تقنيات الاستنساخ الاصطناعي ¹ أو التعرض لتركيزات غير طبيعية من المواد او نواتج ² مختلفة قد تؤثر تطور الجنين مما يؤدي إلى زرع أو المشيمة الفشل والآثار على المدى الطويل في النسل. وهناك تقنية نقل الأجنة موثوق بها وقابلة للتكرار أمر حاسم لاختبار الآثار السلبية المحتملة لعلاج تجريبي على غرس ونمو الجنين في رجل متسقةنير.

يمكن نقل الأجنة سابق للانغراس الفئران الإناث إلى المتلقي إما إلى قناة البيض عن طريق الأمبولات من 0.5 أيام تال للجماع (DPC) المتلقين pseudopregnant (نقل قناة البيض) أو ^3،4 في الرحم من 2.5 DPC pseudopregnant المتلقي (نقل الرحم) ^5،6 اعتمادا على مرحلة نموهم. الأجنة في مرحلة الكيسة الأريمية، مثل تلك المستخدمة لتوليد الفئران خيالية عن طريق الحقن للخلايا الجنينية الجذعية المحفزة أو المستحثة، وعادة ما ينقل عن طريق التحويل الرحم. يمكن أيضا نقل مثانات بلاستولية إلى قناة البيض من 0.5 DPC المتلقي، لكنه يشكل اختبارا أقل الفسيولوجية لاختلال التنموية، وذلك لأن الجنين يخضع لفترة البيات ولها 2 أيام للتعافي من الإهانة قبل أن يتم زرع مكانها. نقل الرحم ينطوي على ثقب جدار الرحم بإبرة الضيقة من أجل توليد الفتحة التي تسمح للحصول على التلاعب ماصة الجنين في تجويف الرحم. Although هذه التقنية يمكن أن تحقق نتائج جيدة، والبقاء على قيد الحياة لمدة (أي النسبة المئوية للأجنة نقل أن تتطور إلى الجرو) غالبا ما تكون منخفضة وغير متوقعة ^7،8.

ثقب في جدار الرحم يستتبع بعض الآثار الجانبية الضارة. الأولى، عضل الرحم هو نسيج أوعية دموية للغاية وثقب في كثير من الأحيان يؤدي إلى نزف صغيرة. الدم قد منع ماصة نقل الأجنة أو تغزو التجويف الرحمي يسبب الوفاة الجنينية و / أو فشل الزرع. وهذا هو ذات الصلة ولا سيما عندما يتم نقل الأجنة دون زونا، مثل خلايا الدم والحطام يمكن أن نعلق على عن Blastomeres. الثانية، وفتح يؤديها لا ختم بعد أن تم نقل الأجنة، بحيث يمكن أن تتدفق مرة أخرى من خلال فتحة ويطرد إلى تجويف البطن عندما يكون حجم كبير جدا وقد ندخل في الرحم. نقل-الرحم الجنين البوقي الموصوفة هنا الاستفادة من مفرق-الرحم الأنبوبي لتسليم EMBRيوس في الرحم من دون الحاجة إلى ثقب جدار الرحم وتجنب العواقب السلبية ⁹ بذلك.

ويتم الحصول على الإناث المتلقي pseudopregnant تستخدم لنقل الأجنة عن طريق التزاوج مع الذكور الطبيعية أجريت لهم هذه العمليات ^8. يطلب من الإفرازات المنوية التي ينتجها الذكور العقيمة لالرحم لتصبح تقبلا لنقل الأجنة. للحصول على المستلم، يتم وضع حد أقصى قدره 2 الإناث من 8 أسابيع إلى 6 أشهر من العمر مع رجل أجريت لهم هذه العمليات في فترة ما بعد الظهر. في صباح اليوم التالي، ويتم التحقق من الإناث لوجود سد الجماع المهبلي، أجمة من البروتينات متخثر من السائل المنوي من الذكور. كما يحدث التزاوج عادة خلال منتصف الليل، ويعتبر اليوم من الكشف عن المكونات المهبلي ليكون 0.5 DPC. على الرغم من أن الذكور أجريت لهم هذه العمليات يمكن شراؤها من بعض البائعين، وإجراء العمليات الجراحية الموصوفة هنا من السهل نسبيا ولا تتطلب أي أدوات إضافية مما هو مطلوب لنقل الأجنة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل بلتسفيل المساحة رعاية الحيوان واستخدام Comittees (BAACUC 11-015) وفقا لوزارة الزراعة الأميركية رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية.

1. التخدير وتسكين (المشتركة لكلا العمليات الجراحية)

1. تزن الماوس وتحميل التخدير والمسكنات التالية في اثنين 1 مل المحاقن مع الإبر 27 G:
   1. الكيتامين (0.1 ملغ / غ: 0.01 مل / غرام من حل 10 ملغ / مل) وزيلازين (0.01 ملغ / غ: 0.005 مل / غرام من حل 2 ملغ / مل).
   2. البوبرينورفين (0.1 ميكروغرام / غرام: 0.01 مل من محلول 0.01 ملغ / مل).
2. لشل حركة الماوس عن طريق التقاط القفا من عنقه أقرب إلى فكي ممكن مع الإبهام والسبابة وعقد الذيل بين القليل وخاتم الأصابع.
3. حقن الكيتامين زيلازين-خليط الغشاء البريتونى. من أجل تجنب ثقب الأعضاء الداخلية، مع الاستمرار على الماوس معرئيسها أقل قليلا من مستوى الوركين لها (الشكل 1A)
4. حقن تحت الجلد البوبرينورفين في القفا من الرقبة عقد بين الإبهام والسبابة (الشكل 1B).
5. ترك الماوس في القفص (نظيفة ودون أي حيوان آخر) على مسرح الحارة.
6. مرة واحدة وعيه، والتحقق من عدم وجود منعكس القدم الخلفية (فحصها من قبل قرصة أخمص قدميه). تطبيق مرهم العين لتجنب جفاف العين وللتحقق من عدم وجود منعكس الجفن (الشكل 1C).
7. يوفر هذا البروتوكول طائرة التخدير الجراحي مدة لا تقل عن 30 دقيقة، ما يكفي لتنفيذ الإجراءات الموضحة أدناه (البروتوكولات 2 و 3). إذا كانت هناك حاجة أوقات أطول، حقنة إضافية من الكيتامين زيلازين + مع نصف الجرعة الموصوفة في 1.1.1 يمكن تطبيقها بعد 30 دقيقة. إن التغيير في نمط التنفس لواحدة بشكل أسرع وعدم انتظام يدل على الصغرىق ق الطائرة التخدير المناسبة.

2. قطع القناة الدافقة

1. استخدام الذكور مع أداء التزاوج التي أثبتت جدواها.
2. تعقيم الأدوات الجراحية، وتنظيف الأسطح حيث سيتم إجراء الجراحة وتصفيتهم مع الايثانول 70٪.
3. أداء التخدير كما هو مفصل سابقا (بروتوكول 1)، والتحقق من فقدان ردود الفعل.
4. ضع الماوس على مسرح الحارة، وإزالة الفراء مع كليبرز الكهربائية من منطقة بطني بين خطين مستعرضة وهمية وضعت 0.5 سم و 2.5 سم فوق القضيب (الشكل 2A).
5. تطهير منطقة حلق بواسطة المسح متتابعة مع 10٪ البوفيدون اليود والايثانول 70٪.
6. ضع الماوس في موقف ضعيف مع ذيله نحو الجراح والغطاء بمنشفة العقيمة مع وجود ثقب تعريض منطقة حلق. إلقاء الضوء على منطقة العمليات الجراحية.
7. إجراء 10-15 ملم طولية incisio الجلدن في خط وسطي من البطن، وحوالي 1 سم فوق القضيب. عقد الجلد مع ملقط مسنن خلع الملابس ثم قطع مع مقص (أرقام 2A و 2B).
8. إجراء 5-10 ملم شق طولي في ألبا الخط. عقد العضلات مع ملقط مسنن microdissecting وقطع مع مقص (الشكل 2C).
9. انتزاع لوحة الدهنية الخصية من جانب واحد مع الدقيقة تشريح ملقط مسنن وتسحبه لفضح الخصية، البربخ والأسهر. يقع الأسهر الإنسي إلى الخصية وذلك عبارة عن أنبوب الحرة تمييزها بوضوح (لا تعلق على جدار الخصية مثل البربخ) مع الأوعية الدموية ممتدة على طول جانب واحد (الشكل 2D).
10. عقد الأسهر مع ملقط مسنن تشريح الصغرى، ملقط خلع الملابس اللهب حتى إلى اللون الأحمر (الشكل 2E )، ومن ثم استخدامها لخفض ويكوي الأسهر في نقطتين في آن واحد (الشكل 2F). خفض يجب إزالة جزء من حوالي 5 ملم وترك اثنين يفصل بوضوح الغايات أكتوي (الشكل 2G).
11. نقل الخصية، البربخ والأسهر يعود إلى تجويف البطن.
12. ننطلق من الخطوة رقم 9 في الخصية الأخرى.
13. خياطة العضلات مع واحد أو اثنين من غرز فراش الأفقية المصنوعة من 5/0 خياطة للامتصاص (الشكل 2H).
14. خياطة الجلد مع واحد أو اثنين كليبرز الجرح (الشكل 2I).
15. تحديد الذكور vasectomised (حلقة الأذن، الوشم إصبع ...)، نقله القفص وضعها على المسرح دافئة ومراقبة حتى يتعافى من التخدير (واعية والحفاظ على الاستلقاء القصية). A 0.5-1 الحقن تحت الجلد مل من محلول ملحي دافئ يحسن إعادةcovery. تسجيل حوادث ممكن تحدث أثناء نقل قطع القناة الدافقة، إضافة المضادات الحيوية إلى مياه الشرب.
16. مقاطع الجرح يمكن إزالتها بعد 10 يوما قطع القناة الدافقة مع مزيل الجرح مجز أو زوج من ملقط الأسنان. فإن الذكور أجريت لهم هذه العمليات تكون جاهزة للتزاوج 2 أسابيع بعد الجراحة.
17. اختبار العقم من الذكور أجريت لهم هذه العمليات عن طريق التزاوج مع الإناث الخصبة قبل استخدامه للحصول على المتلقين.

3. الرحم-البوقي نقل الأجنة

1. الماوس morulae أو مثانات بلاستولية يمكن نقلها بواسطة هذه التقنية إلى المتلقي pseudopregnant الإناث عند 2.5 DPC.
2. إعداد الجنين الزجاج التلاعب ماصة:
   1. تلميع نصائح من الشعيرات الدموية الزجاج من أجل تجنب إتلاف حامل ماصة.
   2. تخفيف جزء منتصف الزجاج الشعرية عن طريق تسخين بلهب غرامة في حين تناوب قليلاالشعرية بكلتا يديه بشكل متزامن. مرة واحدة يصبح المقطع الشعري لينة وطيعة (لون الضوء الأحمر)، سحبها بسرعة من اللهب وسحب طرفي لتضييق قطرها الخارجي إلى 130-150 ميكرون.
   3. انتظر الزجاج ليبرد ثم قطع عليه بتسجيله طفيفة الجزء الضيق مع قلم رصاص الماس نقطة، حجر جلخ أو ملف الأظافر وسحب من كلا الجانبين. يجب أن تكون نظيفة وكسر عمودي
3. تلميع غيض من قبل المشتعلة بسرعة كبيرة، وترك فتحة 100-130 ميكرون. ويمكن تخزين الماصات لاستخدامها لاحقا.
4. دافئ وسائل الاعلام التلاعب الجنين (CZBH أو M2، انظر المناقشة).
5. تعقيم الأدوات الجراحية، وتنظيف الأسطح حيث سيتم إجراء الجراحة وتصفيتهم مع الايثانول 70٪.
6. أداء التخدير كما هو مفصل سابقا (بروتوكول 1)، والتحقق من فقدان ردود الفعل.
7. حفظ رانه الماوس على مسرح الحارة، وإزالة الفراء مع كليبرز الكهربائية من المنطقة الظهرية بين الركبتين والأضلاع البعيدة (أرقام 3A 3B و).
8. تطهير منطقة حلق بواسطة المسح متتابعة مع 10٪ البوفيدون اليود والايثانول 70٪.
9. نقل الأجنة من الحاضنة إلى prewarmed وسائل الاعلام التلاعب الجنين.
10. نقل المتلقي إلى مرحلة دافئة تحت stereomicroscope ووضعه في موقف المعرضة أفقيا للجراح (مع رئيسها تتطلع إلى الجانب الأيمن أو الأيسر من جراح).
11. تغطية المنطقة بمنشفة العقيمة مع وجود ثقب تعريض منطقة حلق وإلقاء الضوء على منطقة العمليات الجراحية.
12. إجراء 1 سم مستعرضة (العمودي) شق في الجلد في بقعة تقع على الجمجمة ⅓ من الخط الفاصل بين الضلع الماضي والوركين و⅓ الظهرية من الخط الفاصل بين الظهر والبطن (أرقام 3A لالثانية 3B). عقد الجلد مع ملقط مسنن خلع الملابس وقطع مع مقص (الشكل 3C).
13. مرة واحدة وقد تم قطع الجلد، والمبيض (أحمر / برتقالي) أو لوحة الدهنية المحيطة المبيض (أبيض) يمكن تصور من خلال جدار الجسم. إجراء 0.3-0.5 سم مستعرضة (العمودي) شق في جدار الجسم على المبيض أو وسادة الدهنية في مكان حيث لا يقطع شق أي الأوعية الدموية الكبيرة. عقد العضلات مع ملقط تشريح الصغرى مسننة وقطع مع مقص (الشكل 3D).
14. تحريك الماوس ليكون رئيسها يواجه نحو الجراح.
15. تحميل التلاعب ماصة الجنين (الشكل 3E):
    1. السماح لوسائل الإعلام CZBH ليصعد بواسطة الشعرية من خلال الجزء الضيق من ماصة التلاعب حتى حوالي 5 ملم من الجزء الأوسع.
    2. يستغرق فقاعة الهواء الصغيرة (0.2-0.5 ملم).
    3. يعرض الأجنة (5-10) فيالحد الأدنى من وسائل الإعلام (2-4 ملم).
    4. تناول فقاعة أخرى صغيرة الهواء (0.2-0.5 ملم) وكمية صغيرة من وسائل الاعلام (0.5-1 مم).
    5. ترك ماصة الزجاج التي تعلق على حامل الشافطة أو الفم إلى الجهاز اليد التي تديرها، وعلى استعداد لخطوة 3.17.
16. انتزاع لوحة الدهنية المحيطة المبيض مع ملقط تشريح الصغرى مسننة وتسحبه نحو الرأس الماوس لفضح المبيض، قناة البيض، وجزء صغير من الرحم العلوي من تجويف البطن (أرقام 3F و3G).
17. عقد قطعة الشافطة الفم في الفم، وعلى استعداد لاستخدامها، والاستيلاء على وسادة الدهنية مع ملقط تشريح الصغرى مسننة لنقل قناة البيض وفضح مفترق-الرحم البوقي (أي حيث يلتقي قناة البيض الرحم).
18. الحفاظ على مفترق-الرحم البوقي يمكن الوصول إليها، واتخاذ طفيف منحني ملقط تشريح الصغرى مع يدك اليسرى (إذا كان الحق وسلم) ووضعها تحت فقطملتقى-الرحم البوقي الاستيلاء على قناة البيض حوالي 2 مم فوق ذلك الجزء.
19. عقد ملتقى-الرحم الأنبوبي مع ملقط تشريح طفيف المنحنية الدقيقة، ثقب الباب قناة البيض على مقربة من ملقط مع 27 G إبرة (الشكل 3H).
20. إدراج الجنين التلاعب ماصة في فوهة يؤديها مع الإبرة والتقدم إلى الرحم من خلال تقاطع-الرحم الأنبوبي (أرقام 3I و3J). مرة واحدة وقد مرت ماصة للالبوقي تقاطع الرحم (الشكل 3K) أنه ينزلق بسهولة. لا تقدم بعيدا جدا في الرحم لمنع الضرر بطانة الرحم (لا يزيد عن 3 ملم) وماصة حجب من قبل الحطام.
21. الافراج عن الأجنة إلى الرحم عن طريق النفخ بلطف (الشكل 3L). يجب على كل من فقاعات الهواء تمر عبر الرحم. بعض وسائل الإعلام أعلاه فقاعة الأولىويمكن أيضا أن تطلق في الرحم، ولكن تجنب إدخال المزيد من الهواء، لأنها قد تعيق التوطين.
22. إزالة ماصة فقط بعد أن تم الإفراج الأجنة في الرحم.
23. نقل قناة البيض والمبيض إلى تجويف البطن عن طريق الاستيلاء على لوحة الدهنية.
24. خياطة العضلات مع مرتبة غرزة أفقية مع 5/0 خياطة للامتصاص (الشكل 3M).
25. خياطة الجلد مع المقص الجرح (الشكل 3N).
26. ننطلق من الخطوة 10 على الجانب الآخر إذا لزم الأمر.
27. تحديد المستلم (حلقة الأذن، الوشم إصبع ...)، نقله إلى قفصه (وضعت على المرحلة الدافئة) ومراقبة حتى يتعافى من التخدير (واعية والحفاظ على الاستلقاء القصية).
28. علق حوادث ممكن تحدث أثناء نقل الأجنة وإضافة المضادات الحيوية إلى مياه الشرب. A 0.5-1 مل من الحقن تحت الجلد سالي الحارةالحل شمال شرق يحسن الانتعاش.
29. مقاطع الجرح يمكن إزالتها بعد 10 يوما نقل الأجنة مع مزيل الجرح مجز أو اثنين من أزواج من ملقط (الشكل 3O). يمكن أن يكون وزنه المتلقي في ذلك اليوم لتقييم الحمل وتقدير عدد الجراء. توفير المواد عشش إلى المتلقي بعد 15 يوما نقل الأجنة.

النتائج

يوفر-الرحم البوقي نقل الأجنة وسيلة لنقل الأجنة إلى الرحم تجنب بعض المضاعفات المرتبطة إلى الرحم نقل الأجنة ^2،9،10. في الجدول 1 نظهر بعض النتائج التي حصلنا عليها ممثل نقل مثانات بلاستولية CD1 يتعرضون لأنواع مختلفة من التلاعب إلى المستلمين CD1 بعد بروتوكو?...

Discussion

قطع القناة الدافقة هو تقنية جراحية على التوالي إلى الأمام نسبيا التي لا تنطوي على صعوبات كبيرة. عندما التعقيم مع فيوسيدين والإيثانول تأكد من غسل الماضي (مع الإيثانول) يزيل البوفيدون اليود، لأنها قد تهيج الغشاء البريتوني. ويمكن أيضا الوصول إلى الأسهر أن يتحقق عن ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Micro dissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used, they made narrower drops.