マウスモデルにおける子宮卵管胚移植と精管切除

要約

子宮卵管胚移植は、子宮の転送を実行するときに発生する可能性があり、胚の流出を防止するためのバリアとして子宮卵接合を使用しています。精管切除雄は、胚移植のための偽妊娠レシピエントを得るために必要とされる。両方の技術が議論されている。

要約

サロゲートメス着床前の胚の転送は、その後の胎児の発育と成人健康上の着床前の開発中に発信し遺伝子改変マウスを製造するための、またはエピジェネティックな変化の影響を研究するために必要なステップです。効果的かつ一貫性のある胚移植技術の使用は、遺伝子改変動物の発生を増強する用語に移植率及び生存率に対する異なる処理の効果を決定するために重要である。胚盤胞期の胚は、通常、胚操作ピペットを導入するために子宮壁内の穿刺を行い、子宮転送により転送される。ピペットが取り下げられた、胚による子宮の正圧に腹腔へ流出することができた後に子宮に行わオリフィスは閉じません。パンクにも、移植性を損なう出血を生成することができ、ブロック転送ピペットおよび胚Dに影響を与える可能性が透明帯のない胚が転送され、特にevelopment、。従って、この技術は、しばしば非常に可変と全体的に低い胚の生存率をもたらす。これらの負の影響を回避、子宮卵管胚移植、胚流出を妨げる天然バリアとしての子宮卵管接合を利用して、子宮壁の穿刺を避ける。精管切除した雄は、偽妊娠の受信者を取得するために必要とされる。精管切除を行うための技術が子宮卵管胚移植を補完するものとして記載されている。

概要

胚移植は、おそらくマウスモデルで実行される最も頻繁な外科的処置である。この技術は、 インビトロでの操作技術に供胚から子孫を得ることが不可欠であり、したがって、前核注入、レンチウイルス形質導入、またはキメラ形成による遺伝的に改変されたモデルの開発のために必要なステップを構成している。しかも、この技術は、着床前の開発中に発生する多様な侮辱の発達への影響の研究を可能にする。人工生殖技術¹または別の物質または代謝物²の異常な濃度への暴露の使用は、移植や胎盤形成の障害と子孫における長期的な効果をもたらした胚の発達に影響を及ぼす可能性があります。信頼性と再現性胚移植技術は、一貫性のある人間に移植すると、胎児の発育に関する実験的治療の可能性のあるマイナスの効果をテストすることが重要であるNER。

マウス着床前胚は、0.5日後に交尾の膨大部（DPC）偽妊娠レシピエント（卵管転送^）3,4または2.5のDPC偽妊娠レシピエントの子宮に（子宮転送^）5,6を経由して卵管にどちらレシピエント雌に転送することができます彼らの発達段階に応じて。このような胚または誘導多能性幹細胞の注入によってキメラマウスを生成するために使用されるもののような胚盤胞段階の胚は、通常、子宮転送により転送される。胚盤胞は、また0.5 DPC受信者の卵管に転送することができますが、胚は休眠を受け、注入が行われる前に発作から回復する2日間を持っているので、それは、発達かく乱にはあまり生理的テストを構成している。子宮内移植は、子宮腔への胚操作ピペットのアクセスを可能にする開口部を生成するために、狭い針で子宮壁に穴をあけることを含む。 Althoughこの技術は良い結果を得ることができ、長期の生存が（ つまり PUPに開発移植胚の割合）は、多くの場合、低および^7,8予測不可能である。

子宮壁の穿刺は、いくつかの有害な副作用を伴う。まず、子宮筋層が高度に血管組織であり、その穿刺は、多くの場合、小さな出血が生じる。血液は胚移植ピペットをブロックしたり、胚の死および/または着床不全の原因となる子宮内腔に侵入​​することができる。血液細胞および破片が割球に取り付けることができるように、 透明帯のない胚は、転送されるとき、これは特に関連する。胚が転送された後第行わ開口は密封しないので、オリフィスを通って流れることができ、大きすぎる体積が子宮内に導入されたときに腹腔に排出される。ここに記載さ子宮卵管胚移植はEMBRを提供するために子宮卵管接合を利用する子宮壁を穿刺し、それによってその有害な結果^9を回避する必要なく、子宮へヨーヨー。

胚移植のために使用偽妊娠レシピエント雌を精管切除した雄⁸と自然交配により得られる。雄性不稔で生成精液の分泌物が移植胚を受け入れるになるために子宮のために必要とされる。受信者を取得するには、生後6ヶ月〜8週間の2人の女性の最大は午後精管切除雄と配置されます。翌朝、雌を膣交尾プラグ、雄精液から凝固タンパク質の塊の存在がチェックされます。交配は通常、深夜中に発生するように、膣プラグ検出の日は0.5 DPCであると考えられている。精管切除した雄は、いくつかのベンダーから購入することができますが、ここに記載さの外科的処置は、比較的容易であり、胚移植のために必要とされるよりも、追加の機器を必要としない。

プロトコル

全ての動物実験は、米国農務省動物実験ガイドラインに従ってベルツヴィルエリア動物管理使用Comittees（BAACUC 11から015）によって承認された。

1。麻酔および鎮痛（外科的処置の両方に共通）

1. マウスを計量し、27 Gの針を2 1ミリリットルの注射器で、次の麻酔薬や鎮痛剤をロードします。
   1. ケタミン（0.1ミリグラム/グラム：0.01ミリリットル/ 10 mg / mlの溶液）およびキシラジン（0.01ミリグラム/グラム：2 mg / mlの溶液0.005ミリリットル/ g）。
   2. ブプレノルフィン（0.1μgの/ G：0.01 mg / mlの溶液を0.01ミリリットル）。
2. 親指と人​​差し指で、できるだけ顎の近くの首筋を拾っ少しと薬指の間に尾を保持することによって、マウスを固定。
3. 腹腔内にケタミン-キシラジン混合物を注入する。臓器に穿刺を回避するために、マウスを保持してわずかに腰のレベルの下に頭（ 図1A）
4. 親指と人差し指（ 図1B）との間にネックホールドの首筋にブプレノルフィンを皮下注射する。
5. 暖かいステージに（きれいで、他の動物なしで）ケージにマウスを残す。
6. 意識不明たら、（足指のピンチによって確認された） 後足反射の不在を確認してください。目の乾燥を回避し、 眼瞼反射 （ 図1C）がないことをチェックするために眼軟膏を適用します。
7. このプロトコルは、（プロトコル2および3）の下に記載の手順を実行するのに十分な30分の最小ための外科麻酔面を提供する。より長い時間が必要な場合は、1.1.1に記載の投薬量の半分でケタミン+キシラジンの追加の注射を30分後に適用することができる。より速く、不規則なものと呼吸パターンの変化が見よを示す適切な麻酔面のSS。

2。精管切除

1. 実績のある嵌合性能とオスを使用してください。
2. 、手術器具を滅菌手術が行われる表面を洗浄し、70％エタノールで拭いてください。
3. 反射の消失をチェックする、（プロトコル1）以前に詳述されるように麻酔を行う。
4. 暖かいステージにマウスを置き、2架空の横方向の線の間の腹側領域から電気バリカンで毛を取り除く 0.5センチメートルとペニス（ 図2A）上記2.5センチメートルを置いた。
5. 10％ポビドンヨードおよび70％エタノールで連続的なワイピングで剃毛面積を消毒 。
6. 剃毛面積を露出する穴と、滅菌タオルで外科医やカバーに向けた尻尾と仰臥位でマウスを置きます。手術領域を照らす。
7. 10〜15ミリメートル縦肌を実行incisionは約1cmペニス上腹部の内側のラインで。鋸歯状の鉗子をドレッシングしてから（ 図2Aおよび2B）ハサミでカットして肌を保持する。
8. 白線 5〜10mmの縦切開を行う。鋸歯状の鉗子をmicrodissectingで筋肉を持ち、ハサミ（ 図2C）で切断した。
9. 鋸歯状の鉗子を解剖マイクロ片側の睾丸脂肪パッドを取得し、 精巣を露出させ 、それを引っ張って、 輸精管と精巣上体 。 精管が同様の精巣壁に取り付けられていない（精巣に内側に位置しており、それが明確に区別自由チューブです血管が1辺（ 図2D）に沿って走ると精巣上体）。
10. 彼らは赤になるまでのマイクロ解剖鋸歯鉗子、 炎ドレッシング鉗子で輸精管を保持している （ 図2E 図2F）を一度に2点が精管を切断して焼灼するためにそれらを使用して栄>）、および。カットは約5ミリメートルの部分を削除し、2明確に分離焼灼終了する（ 図2G）のままにする必要があります。
11. 戻って腹腔へ睾丸、精巣上体と精管を移動します。
12. 他の睾丸のステップ9から進んでください 。
13. 5/0吸収性縫合糸（ 図2H）で作られた1つまたは2つの水平マットレスステッチで筋肉を縫合 。
14. 1または2の創傷切り（ 図2I）で皮膚を縫合 。
15. vasectomised男性の識別（耳のリング、指の入れ墨を...）、 それは麻酔から回復するまでケージは暖かいステージ上に配置して観察を移動（意識し胸骨横臥を維持）。温かい生理食塩水の0.5〜1ミリリットル皮下注射は、再を改善するcovery。精管切除の転送中に発生する可能性の発生率を記録して、飲料水に抗生物質を追加します。
16. 創傷クリップは、10日間創傷クリッパー除去や歯ピンセットで精管切除後に除去することができる。精管切除の男性で、手術後2週間の交尾できるようになります。
17. 受信者を取得するためにそれを使用する前に、肥沃な雌と交配させることにより精管切除のオスの不妊をテストします 。

3。子宮卵管胚移植

1. マウス桑実胚または胚盤胞は2.5 DPCでの偽妊娠レシピエント雌に、この技術によって転送することができます。
2. 胚操作用ガラスピペットを準備します。
   1. ピペットホルダーの損傷を防ぐために、ガラスキャピラリーの先端を磨く。
   2. 少し回転させながら、細かい炎で加熱することにより、ガラスキャピラリの中央部を柔らかく同期両手で毛細血​​管。キャピラリー部は（光赤色）柔らかく可鍛性になると、炎からすぐにそれを撤回し、130〜150程度に、その外径を狭める両端を引っ張る 。
   3. クールダウンしてから軽くダイヤモンドポイントの鉛筆、砥石や爪やすりで狭い部分を得点し、両側から引っ張って、それをカットするガラスのを待ちます。ブレークがきれいに垂直である必要があり
3. 100〜130ミクロンの開口部を残して、非常に迅速に燃えることで先端を磨く 。ピペットは、後で使用するために保存することができる。
4. 暖かい胚操作メディア （CZBHまたはM2は、説明を参照してください）。
5. 、手術器具を滅菌手術が行われる表面を洗浄し、70％エタノールで拭いてください。
6. 反射の消失をチェックする、（プロトコル1）以前に詳述されるように麻酔を行う。
7. Tを維持彼温かいステージ上でマウス、膝と遠位リブ（ 図3Aと図3B）との間の背側領域から電気バリカンで毛を削除します 。
8. 10％ポビドンヨードおよび70％エタノールで連続的なワイピングで剃毛面積を消毒 。
9. あらかじめ温めておいた胚操作メディアにインキュベーターから胚を移動します 。
10. 実体顕微鏡下で暖かい舞台に受信者を移動し、（その頭を右または外科医の左側に見て）外科医に横方向に発生しやすい位置に配置します。
11. 剃毛面積を露出する孔を、滅菌タオルでエリアをカバーし、手術領域を照らす。
12. 最後の肋骨と腰と背中と腹部（ 図3Aの Aとの間のラインの背⅓の間の線の頭蓋⅓に位置してスポットにおける皮膚中の 1cmの横方向（垂直方向） の切開を行うND 3B）。鋸歯状の鉗子をドレッシングで皮膚を持ち、ハサミ（ 図3C）で切断した。
13. 皮膚が切断されると、卵巣（赤/オレンジ）または卵巣（白色）を囲む脂肪パッドは、体壁を介して視覚化することができる。切開は任意の大血管を切断しないスポットでの卵巣または脂肪パッド上で体壁に 0.3〜0.5センチ、横方向（垂直方向） の切開を行う。マイクロ解剖鋸歯鉗子で筋肉を持ち、ハサミ（ 図3D）で切断した。
14. その頭は外科医に向いているようにマウスを移動します。
15. 胚操作用ピペット （ 図3E）をロードします 。
    1. CZBHメディアが広い部分の約5ミリメートルまでの操作ピペットの狭い部分を通って毛細管現象によって上昇することができます。
    2. 小さな気泡（0.2〜0.5ミリメートル）を取り上げる。
    3. で胚（5-10）を導入メディアの最小量（2-4 mm）である。
    4. 別の小さな気泡（0.2〜0.5ミリメートル）とメディアの少量（0.5〜mm）を取り上げる。
    5. ステップ3.17の準備ができて、口の吸引器ホルダーにまたは手動デバイスに接続されているガラスピペットのままにしておきます。
16. マイクロ解剖鋸歯ピンセットで卵巣周囲の脂肪パッドを取得し、 卵巣、卵管、および腹腔のうち上部の子宮の小さい部分（ 図3Fおよび3G）を公開するために、マウスの頭の方に引き出します。
17. 卵管を移動し、（卵管が子宮を満たしているIE）子宮卵管接合部を露出させたマイクロ解剖鋸歯鉗子で脂肪パッドをつかむ、使用できるようになり、口の中で吸引器マウスピースを保持している。
18. アクセス可能な子宮卵管接合を維持する（右利きの場合）、左手でわずかに湾曲したマイクロ解剖鉗子を取るとすぐ下に配置しますその部分の上2ミリメートル程度の卵管をつかんで子宮卵管接合。
19. わずかに湾曲したマイクロ解剖鉗子で子宮卵管接合部を保持している、27のG針（ 図3H）を鉗子に近い卵管部分を穿刺 。
20. 子宮卵管接合（ 図3Iおよび3J）を介して子宮に針を事前に実施したオリフィスに胚操作用ピペットを挿入します 。ピペットは子宮卵管接合（ 図3K）を通過すると、簡単にスライドします。破片による子宮内膜の損傷（NO 3mm以下）とピペットブロッキングを防止するために、子宮に非常に遠く進まないでください。
21. 優しく（ 図3L）を吹き込んで子宮に胚を解放します 。両方の気泡が子宮を通過しなければならない。最初のバブルの上にあるメディアの中にはまた、子宮内に放出しますが、着床を妨げる可能性がある、より多くの空気を導入することを避けることができる。
22. 胚が子宮内に放出された直後に、ピペットを削除します 。
23. 脂肪パッドをつかんで戻って腹腔への卵管と卵巣を移動します。
24. 5/0吸収性縫合糸（ 図3M）水平マットレスステッチで筋肉を縫合 。
25. 創傷クリッパー（ 図3N）で皮膚を縫合する 。
26. 必要に応じて反対側にステップ10から続行する。
27. 、受信者（耳のリング、指の入れ墨を...）を特定（ウォームステージ上に配置）、そのケージに移動して、麻酔から回復するまで観察 （意識し胸骨横臥を維持）。
28. 胚移植時に発生する可能性の発生率に注釈や飲料水に抗生物質を追加します。暖かいのSalIの0.5〜1ミリリットルを皮下注射NEのソリューションは、回復を向上させます。
29. 創傷クリップは、10日間創傷クリッパー除去または鉗子（ 図3O）の2つの対を有する胚移植後に除去することができる。受信者は、妊娠を評価し、仔の数を推定するために、その日に計量することができます。 15日胚移植後に受信者に寄り添う材料を提供する。

結果

子宮卵管胚移植は、子宮胚移植^2,9,10に関連する合併症のいくつかを回避子宮に胚を転送する手段を提供する。 表1に、我々は我々が説明したプロトコルに従って、CD1受信者に操作の異なる種類の対象CD1胚盤胞を転送取得しているいくつかの代表的な結果を示す。項（PUP、その結果胚の％）または（レンチウイルス曝露の場合）E15に生存への生存は受精卵の段階（IVC）から<...

ディスカッション

精管切除は大きな困難を伴わない比較的単純手術法である。ポビドンヨード、エタノールで消毒した場合は、それが腹膜を刺激する可能性がある（エタノールによる）最後の洗浄は、ポビドンヨードを削除していることを確認してください。 輸精管へのアクセスはまた、陰嚢または腹部⁸の横方向の切開を行うことによって達成することができる。陰嚢切開は、必要に応じて、...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Micro dissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used, they made narrower drops.