Utero-Tubenembryotransfer und Vasektomie im Maus-Modell

Zusammenfassung

Utero-Eileiter-Embryo-Transfer verwendet die utero-Eileiter-Kreuzung als Barriere, um den Embryo Abfluss, die bei der Durchführung von Uterus Übertragung auftreten können, zu verhindern. Vasektomierten Männchen sind erforderlich, um pseudo-Empfänger für Embryotransfer erhalten. Beide Techniken werden diskutiert.

Zusammenfassung

Die Übertragung der Präimplantationsembryonen zu einem Surrogat Frau ist ein erforderlicher Schritt für die Herstellung von genetisch veränderten Mäusen, um zu studieren oder die Auswirkungen von epigenetischen Veränderungen während Präimplantations Entwicklung bei zukünftigen Entwicklung des Fötus und Erwachsene Gesundheit entstanden ist. Die Verwendung einer wirksamen und kohärenten Embryo-Transfer-Technik ist entscheidend, um die Erzeugung von gentechnisch veränderten Tieren zu verbessern und die Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf Implantationsraten und Überlebenszeit zu bestimmen. Embryos im Blastozysten-Stadium in der Regel durch Uterus Übertragung übertragen, Ausführen einer Punktion in der Uteruswand, die Embryomanipulation Pipette einzuführen. Die in der Gebärmutter durchgeführt Öffnung nicht schließen, nachdem die Pipette wurde zurückgezogen, und die Embryonen können Abfluss in die Bauchhöhle durch den Überdruck der Gebärmutter. Die Punktion kann auch produzieren eine Blutung, die Implantation beeinträchtigt, blockiert die Transferpipette und können Embryo d beeinflussenntwicklung, vor allem, wenn Embryonen ohne zona übertragen werden. Folglich ist diese Technik oft zu sehr variabel und insgesamt niedrigen Embryo-Überlebensraten. Die Vermeidung dieser negativen Auswirkungen, Eileiter-utero-Embryo-Transfer nutzen die utero-Eileiter-Kreuzung als eine natürliche Barriere, die Embryo Abfluss behindert und vermeiden Sie die Punktion der Gebärmutterwand. Vasektomierten Männer werden für den Erhalt schein Empfänger erforderlich. Eine Technik zur Vasektomie durchführen wird als Ergänzung zu den utero-Eileiter-Embryo-Transfer beschrieben.

Einleitung

Embryotransfer ist wahrscheinlich der häufigste chirurgische Eingriff im Mausmodell durchgeführt. Diese Technik ist wesentlich, Nachkommen von Embryonen in vitro Manipulation Techniken unterworfen wurde, und daher stellt ein notwendiger Schritt für die Entwicklung von genetisch modifizierten Modelle von Vorkern-Injektion lentiviralen Transduktion oder Chimärenbildung. Außerdem ermöglicht die Technik die Untersuchung der Auswirkungen auf die Entwicklung von diversen Beleidigungen während der Präimplantations-Entwicklung auftreten. Die Verwendung von künstlichen Reproduktionstechniken ¹ oder der Einwirkung von abnormalen Konzentrationen verschiedener Stoffe oder Stoffwechsel ^{2. Mai} Embryonalentwicklung was Implantation oder Plazenta Ausfälle und langfristigen Auswirkungen bei den Nachkommen beeinflussen. Eine zuverlässige und reproduzierbare Embryo-Transfer-Technik ist entscheidend, um die möglichen negativen Auswirkungen der experimentellen Behandlung bei der Implantation und der fetalen Entwicklung in einem konsistenten Menschen testenner.

Murine Präimplantationsembryonen auf einen weiblichen Empfänger entweder in den Eileiter über den Ampullen von 0,5 Tage nach coitum (DPC) pseudo-Empfänger (Eileiter-Transfer) oder ^3,4 in die Gebärmutter von 2,5 dpc schein Empfänger (Gebärmutter-Transfer) ^5,6 übertragen werden je nach Entwicklungsstadium. Embryonen im Blastozystenstadium, wie sie verwendet werden, um chimäre Mäuse zu erzeugen, durch Injektion von embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen, sind in der Regel durch die Uterus Übertragung übertragen. Blastozysten können auch in den Eileiter einer 0,5 dpc Empfänger übertragen werden, aber es stellt eine weniger physiologischen Test für Entwicklungs Disruptoren, weil der Embryo durchläuft Diapause und hat 2 Tage, um von der Beleidigung zu erholen, bevor die Implantation stattfindet. Gebärmutter Übertragung beinhaltet Stechen der Uteruswand mit einem schmalen Nadel, um eine Öffnung, die den Zugang eines Embryo-Pipette in das Uteruslumen ermöglicht erzeugen. Abwohl diese Technik gute Ergebnisse (dh der Anteil der übertragenen Embryonen, die zu einem Welpen entwickeln) ist das Überleben zu Begriff oft niedrig und unberechenbar ^7,8.

Die Punktion der Uteruswand bringt einige nachteilige Nebenwirkungen. Erstens ist Myometrium ein stark vaskularisierten Gewebes und seine Punktion führt oft zu einer geringen Blutung. Blut kann die Embryotransfer Pipette blockieren oder dringen in die Uteruslumen verursacht embryonalen Tod und / oder Implantation Versagen. Dies ist besonders relevant, wenn Embryonen ohne zona übertragen werden, da die Blutzellen und Ablagerungen können zu den Blastomeren befestigen. Zweitens ist die Öffnung nicht verschließen durchgeführt, nachdem die Embryonen übertragen wurden, so dass sie durch die Öffnung fließen kann und zurück in die Bauchhöhle ausgestoßen wird, wenn ein zu großes Volumen hat, in den Uterus eingeführt worden ist. Die beschriebene utero-Eileiter-Embryo-Transfer hier die Vorteile der utero-Eileiter-Kreuzung, um die embr liefernYos in den Uterus ohne die Notwendigkeit der Punktion der Uteruswand und damit die Vermeidung ihrer nachteiligen Folgen ^9.

Die pseudo-Empfänger für Frauen Embryotransfer verwendet werden, durch natürliche Paarung mit Männchen vasektomierten ⁸ erhalten. Die Samensekret durch eine sterile Männchen produziert werden für die Gebärmutter erforderlich empfänglich für die Embryonen übertragen zu werden. Um einen Empfänger zu erhalten, werden maximal 2 Weibchen von 8 Wochen bis 6 Monaten mit einem männlichen vasektomierten in den Nachmittag gelegt. Am nächsten Morgen sind Frauen für das Vorhandensein einer vaginalen Kopulation Stecker, einem Klumpen geronnenen Proteinen aus der männlichen Samenflüssigkeit überprüft. Als während der Mitternachts Paarung erfolgt in der Regel, wird der Tag der vaginalen Plug-Erkennung als 0,5 dpc sein. Obwohl vasektomierten Männer können von einigen Händlern erworben werden kann, ist die hier beschriebene chirurgische Verfahren relativ einfach und erfordert keine zusätzliche Instrumente als für Embryotransfer erforderlich.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der Beltsville Bereich Animal Care und Verwenden Gremien (BAACUC 11-015) in Übereinstimmung mit USDA Animal Care und Verwenden Richtlinien genehmigt.

1. Anästhesie und Analgesie (gemeinsam für beide Chirurgische Verfahren)

1. Wiegen Sie die Maus, und laden Sie die folgenden Anästhetika und analgetische in zwei 1 ml Spritzen mit 27 G Nadeln:
   1. Ketamin (0,1 mg / g: 0,01 ml / g einer 10 mg / ml) und Xylazin (0,01 mg / g: 0,005 ml / g eines 2 mg / ml Lösung).
   2. Buprenorphin (0,1 ug / g: 0,01 ml einer 0,01 mg / ml Lösung).
2. Immobilisieren, die Maus, indem Sie den Genick seines Halses so nah an den Backen wie möglich mit dem Daumen und Zeigefinger und hielt den Schwanz zwischen die kleinen und Ringfinger.
3. Inject Ketamin-Xylazin intraperitoneal Mischung. Um zu vermeiden, Punktion inneren Organe, halten Sie die Maus mitden Kopf leicht unter dem Niveau der Hüften (1A)
4. Inject Buprenorphin subkutan in das Genick des Hals halten zwischen Daumen und Zeigefinger (Abbildung 1B).
5. Lassen Sie die Maus in den Käfig (sauber und ohne jedes andere Tier) an einem warmen Bühne.
6. Sobald bewusstlos, überprüfen Sie für das Fehlen der hinteren Fussreflex (von Zehe Prise überprüft). Bewerben Augensalbe zur Trockenheit des Auges zu vermeiden und um das Fehlen von Augenlidreflexe (Abbildung 1C) zu überprüfen.
7. Dieses Protokoll stellt eine chirurgische Anästhesieebene für mindestens 30 Minuten, ausreichend, um die unten beschriebenen Verfahren durchzuführen (der Protokolle 2 und 3). Wenn längere Zeiten benötigt werden, kann eine zusätzliche Injektion von Ketamin + Xylazin mit der Hälfte der in 1.1.1 beschriebenen Dosierungs nach 30 Minuten angewendet werden. Eine Änderung des Atmungsmusters zu einem schnelleren und einem unregelmäßigen zeigt die loss der richtigen Narkose-Ebene.

2. Vasektomie

1. Verwenden Sie einen Mann mit einem bewährten Paarungsverhalten.
2. Sterilisieren chirurgische Instrumente, reinigen Sie die Oberflächen, auf denen Operationen durchgeführt werden, und wischen Sie sie mit 70% Ethanol.
3. Führen Anästhesie wie vorher beschrieben (Protokoll 1), die Überprüfung für den Verlust der Reflexe.
4. Legen Sie die Maus auf eine warme Phase, entfernen Fell mit elektrischen Haarschneider aus dem ventralen Bereich zwischen zwei imaginären Querlinien platziert 0,5 cm und 2,5 cm über dem Penis (2A).
5. Desinfizieren die rasierte Fläche von sequentiellen Wischen mit 10% Povidon-Jod und 70% Ethanol.
6. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage mit dem Schwanz gegen den Chirurgen und die Abdeckung mit einem sterilen Tuch mit einem Loch Aussetzen der rasierten Bereich. Beleuchten den OP-Bereich.
7. Führen Sie eine 10-15 mm Längs Haut incision in der Mittellinie des Bauches, etwa 1 cm über dem Penis. Halten Sie die Haut mit Dressing gezahnten Pinzette und dann mit einer Schere (2A und 2B).
8. Führen Sie eine 5-10 mm Längsschnitt in der Linea alba. Halten Sie den Muskel mit microdissecting gezackten Zange und schnitt mit der Schere (Abbildung 2C).
9. Besorgen Sie sich die Hodenfettpolster von einer Seite mit Mikro Sezieren gezackten Zange und ziehen Sie es auf Hoden freizulegen, Samenleiter und Nebenhoden. Samenleiter wird medial der Hoden entfernt und es ist ein deutlich unterscheidbar kostenlos Rohr (nicht an die Wand wie die Hoden befestigt Nebenhoden) mit einem Blutgefäß entlang einer Seite (Abbildung 2D) läuft.
10. Halten Sie die Samenleiter mit einer Mikrozange gezahnt Seziersaal, Flammkornzange, bis sie rot (2E ) und dann nutzen sie, um in zwei Punkte auf einmal geschnitten und ätzen die Samenleiter (2F). Der Schnitt sollte ein Teil von etwa 5 mm zu entfernen und zwei klar voneinander getrennt cauterized Enden (2G).
11. Bewegen Sie die Hoden, Nebenhoden und Samenleiter zurück in die Bauchhöhle.
12. Fahren Sie mit Schritt 9 in der anderen Hoden.
13. Naht der Muskel mit einer oder zwei horizontalen Matratze Stiche mit 5/0 resorbierbares Nahtmaterial (2H) gefertigt.
14. Naht der Haut mit einem oder zwei Wunde Knipser (2I).
15. Identifizieren Sie die vasektomierten (Ohrring, Finger Tattoo ...), verschieben Sie den Käfig an einem warmen Bühne platziert und beobachten, bis er aus der Narkose erholt sich (bewusst und pflegen Brustlage). Ein 0,5-1 ml subkutane Injektion von warmen Kochsalzlösung verbessert die WiederErholung. Notieren Sie die möglichen Vorfälle während Vasektomie Übertragung auftreten, fügen Antibiotikum, das Trinkwasser.
16. Wundclips können 10 Tage nach der Vasektomie mit einer Wunde Klipper-Entferner oder ein Paar Zähne Pinzette entfernt werden. Die vasektomierten männlichen bereit zu 2 Wochen nach der Operation paaren.
17. Testen Sie die Unfruchtbarkeit der männlichen vasektomierten durch Paarung mit fruchtbaren Weibchen, bevor Sie es an die Empfänger zu erhalten.

3. Utero-Eileiter-Embryo Transfer

1. Maus Morulae oder Blastozysten können durch diese Technik zu einer pseudo weiblichen Empfänger bei 2,5 dpc übertragen werden.
2. Bereiten Embryo Manipulation Glaspipette:
   1. Reinigen Sie die Spitzen der Glaskapillaren, um eine Beschädigung der Pipettenhalter.
   2. Erweichen Sie einen Mittelteil der Glaskapillare durch Erhitzen mit einem feinen Flamme, während leichtes Drehendie Kapillare mit beiden Händen synchron. Sobald die Kapillare Abschnitt wird weich und formbar (hellrot), zurückziehen es schnell von der Flamme und ziehen beide Enden an seinem Außendurchmesser auf 130-150 um einzugrenzen.
   3. Warten Sie, bis das Glas abgekühlt ist, und dann schneiden Sie es durch leichtes erzielte den schmalen Teil mit einer Diamant-Punkt-Bleistift, Schleifstein oder Nagelfeile und Ziehen von beiden Seiten. Die Pause sollte sauber und senkrecht sein
3. Polieren Sie die Spitze durch sehr schnell flammenden, so dass eine Öffnung um 100-130. Pipetten für die spätere Verwendung gespeichert werden.
4. Warm Embryo Manipulation Medien (CZBH oder M2, siehe Diskussion).
5. Sterilisieren chirurgische Instrumente, reinigen Sie die Oberflächen, auf denen Operationen durchgeführt werden, und wischen Sie sie mit 70% Ethanol.
6. Führen Anästhesie wie vorher beschrieben (Protokoll 1), die Überprüfung für den Verlust der Reflexe.
7. Keeping ter Maus auf eine warme Phase, Pelz entfernen mit elektrischen Haarschneider aus dem dorsalen Bereich zwischen den Knien und den distalen Rippen (3A und 3B).
8. Desinfizieren die rasierte Fläche von sequentiellen Wischen mit 10% Povidon-Jod und 70% Ethanol.
9. Bewegen Sie die Embryonen aus dem Inkubator auf die vorgewärmten Embryo Manipulation Medien.
10. Bewegen Sie den Empfänger an einen warmen Bühne unter dem Stereomikroskop und legen Sie sie in Bauchlage seitlich an den Chirurgen (mit seinem Kopf auf der Suche nach der rechten oder linken Seite des Chirurgen).
11. Decken Sie den Bereich mit einem sterilen Tuch mit einem Loch Aussetzen der rasierten Fläche und beleuchten den OP-Bereich.
12. Führen Sie eine 1 cm quer (vertikal) Schnitt in der Haut an einer Stelle, an der Schädel ⅓ der Linie zwischen der letzten Rippe und der Hüfte und der dorsalen ⅓ der Linie zwischen der Rückseite und der Bauch (Fig. 3A eine befindetnd 3B). Halten Sie die Haut mit Dressing gezackten Zange und schnitt mit der Schere (3C).
13. Sobald die Haut geschnitten worden ist, kann Ovar (rot / orange) oder die Fettpolster um den Eierstock (weiß) durch die Körperwand visualisiert werden. Führen Sie eine 0,3-0,5 cm quer (vertikal) Einschnitt in der Körperwand über den Eierstock-oder Fettpolster an einer Stelle, wo der Schnitt keine großen Blutgefäß geschnitten. Halten Sie die Muskeln mit Mikrosektions gezackt Pinzette und schneiden mit der Schere (Abbildung 3D).
14. Bewegen Sie die Maus zu haben, den Kopf zugewandten Chirurgen.
15. Laden Sie die Embryo-Pipette (3E):
    1. Ermöglichen CZBH Medien durch Kapillarwirkung durch den engen Abschnitt der Manipulation Pipette aufsteigen, bis etwa 5 mm des breiteren Teils.
    2. Nehmen Sie eine kleine Luftblase (0,2-0,5 mm).
    3. Führen Sie die Embryonen (5-10) ineine minimale Menge von Medien (2-4 mm).
    4. Nehmen Sie eine weitere kleine Luftblase (0,2-0,5 mm) und eine kleine Menge von Medien (0,5-1 mm).
    5. Lassen Sie die Glaspipette bis zur Mündung Sauger Halter oder zum Handgerät, bereit für Schritt 3.17 angebracht.
16. Besorgen Sie sich die Fettpolster rund um den Eierstock mit Mikrosektions gezackte Zange und ziehen Sie sie auf den Maus-Kopf, um die Eierstöcke, Eileiter und einen kleinen Teil der oberen Gebärmutter aus der Bauchhöhle (3F und 3G) aus.
17. Halten Sie die Saugvorrichtung Mundstück in den Mund, bereit zu werden, greifen die Fettpolster mit Mikrosektions gezackte Zange, um die Eileiter zu bewegen und setzen die utero-Eileiter-Kreuzung (dh wo die Eileiter erfüllt die Gebärmutter).
18. Halten Sie die utero-Eileiter-Kreuzung zugänglich, nehmen Sie leichte gebogene Pinzette Mikrodissektion mit der linken Hand (bei Rechtshänder) und legen Sie sie direkt unterdie utero-Eileiter-Kreuzung packte den Eileiter etwa 2 mm über dem Teil.
19. Halten Sie die utero-Eileiter-Verbindung mit den leicht gebogenen Mikro Dissektion Pinzetten, Punktion der Eileiter Abschnitt in der Nähe der Zange mit einem 27-G-Nadel (3H).
20. Legen Sie die Embryo-Pipette in die Öffnung mit der Nadel und in die Gebärmutter durch die Eileiter-utero-Kreuzung durchgeführt (Abb. 3I und 3J). Sobald die Pipette die utero-Eileiter-Kreuzung (3K) reichte es gleitet leicht. Sehr weit voran Sie nicht in die Gebärmutter Endometrium-Schäden (nicht mehr als 3 mm) und Pipetten Blockierung durch die Trümmer zu verhindern.
21. Lassen Sie die Embryonen in die Gebärmutter durch sanft weht (Abbildung 3 l). Beide Luftblasen durch die Gebärmutter passieren. Einige der Medien über der ersten Blasenkann auch in den Uterus freigegeben werden, aber die Einführung von mehr Luft zu vermeiden, da es die Implantation zu verhindern.
22. Nehmen Sie die Pipette kurz nach Embryonen in die Gebärmutter freigegeben.
23. Bewegen Sie den Eileiter und zurück in die Bauchhöhle von Eierstock greifen die Fettpolster.
24. Naht der Muskel mit einer horizontalen Matratzenstich mit 5/0 resorbierbares Nahtmaterial (Abbildung 3M).
25. Nähen Sie die Haut mit einer Wunde Klipper (Abbildung 3 N).
26. Gehen vom Schritt 10 auf der anderen Seite, falls erforderlich.
27. Identifizieren Sie den Empfänger (Ohrring, Finger Tattoo ...), verschieben Sie sie in seinem Käfig (an einem warmen Bühne platziert) und beobachten, bis er aus der Narkose erholt sich (bewusst und pflegen Brustlage).
28. Kommentieren die möglichen Vorfälle während Embryotransfer auftritt und fügen Antibiotikum, das Trinkwasser. Ein 0,5-1 ml subkutane Injektion von warmen saline Lösung verbessert die Wiederherstellung.
29. Wundclips können 10 Tage nach Embryotransfer mit einer Wunde Klipper-Entferner oder zwei Pinzetten (Abbildung 3 O) entfernt werden. Der Empfänger kann an diesem Tag, um eine Schwangerschaft zu beurteilen und schätzen die Zahl der Jungtiere abgewogen werden. Geben eingebettet Material an den Empfänger 15 Tage nach Embryotransfer.

Ergebnisse

Utero-Eileiter-Embryo-Transfer bietet eine mittlere Embryonen in die Gebärmutter vermeiden einige der Komplikationen an der Gebärmutterembryotransfer ^2,9,10 verbunden zu übertragen. In Tabelle 1 zeigen wir einige repräsentative Ergebnis, das wir erhalten haben, die Übertragung CD1 Blastozysten, verschiedene Arten von Manipulationen CD1 Empfänger unterzogen nach dem beschriebenen Protokoll. Das Überleben zu Begriff (% der Embryonen, was zu einer Welpe) oder das Überleben bis E15 (im Fa...

Diskussion

Die Vasektomie ist eine relativ einfach Operationstechnik, die keine großen Schwierigkeiten verbunden ist. Wenn Desinfektion mit Povidon-Jod und Ethanol stellen Sie sicher, dass der letzte Waschanlage (mit Ethanol) entfernt Povidoniod, da es das Bauchfell reizen. Der Zugang zu Samenleiter kann auch durch den Hodensack oder Durchführen einer transversalen Schnitt in den Bauch ⁸ erreicht werden. Scrotal Einschnitt wurde empfohlen, Bauchschnitt durch den vergleichsweise kleineren Schnitt benötigt und...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Micro dissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used, they made narrower drops.