子宫 - 输卵管胚胎移植和输精管结扎术在小鼠模型

摘要

子宫 - 输卵管胚胎移植使用子宫 - 输卵管结作为一个屏障，以防止子宫进行传输时可能出现的胚胎流出。输精管结扎男性须取得假收件人胚胎移植。这两种技术都进行了讨论。

摘要

植入前胚胎到代孕雌鼠转移是用于生产转基因小鼠或研究遗传学改变的影响源自于随后的胚胎发育和成年人的健康胚胎植入前发育过程中的必要步骤。使用有效的和一致的胚胎移植技术的关键是要提高转基因动物的产生和确定不同处理对植入率和存活期的影响。胚胎在囊胚阶段通常是由子宫转移转移，在子宫壁进行穿刺引进胚胎操纵吸管。在子宫中执行的孔口不会关闭吸管已经撤回后，与胚胎可以流出到腹腔由于子宫的正压力。穿刺也可产生出血，损害植入，块的移液管，并可能影响胚胎ð才有发展，尤其是当胚胎没有透明传送。因此，这种技术通常会导致非常多变和整体低胚胎存活率。避免这些负面影响，子宫 - 输卵管胚胎移植采取子宫 - 输卵管交界处，阻碍胚胎流出一道天然屏障的优势，避免了子宫壁的穿刺。输精管结扎的男性都需要获得假收件人。的技术进行输精管结扎术被描述为补充的子宫 - 输卵管胚胎移植。

引言

胚胎移植可能是在小鼠模型中进行的最常见的外科手术。这种技术是必不可少的，从胚胎进行体外操作技术获得的后代，因此，构成了转基因模型中通过原核注射，慢病毒转导，或嵌合体的形成的发展的必要步骤。此外，该技术允许的早期发育过程中出现的多种有害刺激的发育影响的研究。使用人工繁殖技术¹或接触到不同的物质或代谢物²浓度异常可能会影响导致植入或胎盘失败和后代的长期影响胚胎发育。一个可靠和可重复的胚胎移植技术是至关重要的测试实验处理对着床和胎儿发育一致的人可能产生的负面影响NER。

小鼠植入前胚胎可以通过的0.5天交配后壶腹（DPC）假收件人（输卵管转让^）3,4或成2.5 DPC假收件人的子宫（子宫转让^）5,6传送到收件人的女性要么进入输卵管根据它们的发育阶段。胚胎在胚泡期，如那些用于产生嵌合小鼠通过注射胚胎或诱导多能干细胞的，通常是由子宫转移转移。囊胚也可以转移到0.5 DPC收件人的输卵管，但它构成了一个不太生理测试发育干扰，因为胚胎滞育经历，并具有2天的侮辱恢复植入前发生。子宫转让涉及的穿刺子宫壁具有窄的针，以便产生一个孔，它允许一个胚胎操纵吸管的访问到子宫腔中。一lthough这种技术可以产生良好的效果，生存至足月（ 即移植胚胎的发育到小狗的百分比）往往是低和难以预料^7,8。

子宫壁的穿刺则需要进行一些有害的副作用。首先，子宫肌层是高度血管化组织和其穿刺通常导致一个小的出血。血液可能会阻止胚胎移液管或侵入子宫腔引起胚胎死亡和/或植入失败。这是特别相关的，当胚卵不被转移，如血细胞和碎片可以连接到卵裂球。第二，所执行的开口不密封的胚胎已转移后，使他们能够流回通过节流孔和排出到腹腔时，过大的体积已经被引入到子宫。本文所述的子宫 - 输卵管胚胎移植采取子宫 - 输卵管交界处的优势为客户提供电磁制动YOS进入子宫而不刺穿子宫壁，从而避免其不利后果⁹的需要。

假孕雌性受体用于胚胎移植是通过自然交配获得与输精管结扎男性^8。由雄性不育产生的精液分泌物都需要子宫成为容易接受移植胚胎。为了获得一个收件人，最多2女8周〜6个月的婴儿被​​放在了输精管结扎男性在下午。次日早晨，女性被检查阴道交配插头，从男性精液凝固蛋白的一丛的存在。随着午夜的交配过程中通常会发生，阴道塞检测的日子被认为是0.5 DPC。虽然男性输精管结扎可以从一些供应商购买，这里所描述的手术过程是比较容易的，不需要任何额外的工具不是必需的胚胎移植。

研究方案

所有动物实验均按照美国农业部的动物护理和使用指南批准贝尔茨维尔区动物护理和使用Comittees（BAACUC 11-015）。

1。麻醉和镇痛（常见的两种手术方法）

1. 权衡鼠标和加载以下麻醉药和镇 ​​痛两个1毫升注射器27G的针头:
   1. 氯胺酮（0.1毫克/克0.01毫升/克的10毫克/毫升的溶液）和甲苯噻嗪（0.01毫克/克0.005毫升/克的2毫克/毫升溶液）。
   2. 丁丙诺啡（0.1微克/克0.01毫升0.01毫克/毫升的溶液）。
2. 拿起它的脖子颈背尽量靠近钳口尽可能用拇指和食指和抱着小和无名指之间的尾部固定鼠标。
3. 注射氯胺酮-甲苯噻嗪混合腹腔 。为了避免刺穿内脏，按住鼠标其头部稍低于其臀部的水平（ 图1A）
4. 丁丙诺啡注射在皮下拇指和食指（ 图1B）之间保持脖子的颈背。
5. 离开鼠标在笼子里（干净，没有任何其他动物）在一个温暖的舞台。
6. 一旦昏迷，检查没有后脚反射 （由脚趾捏选中）。适用眼膏 ，以避免眼睛干涩，并核实没有眼睑反射消失 （ 图1C）。
7. 这个协议提供了一种外科麻醉平面为至少30分钟，足以执行下述程序（协议2和3）。如果需要更长的时间是必需的，额外的注射氯胺酮+甲苯噻嗪有一半在1.1.1中描述的剂量，可30分钟后应用。在呼吸模式，以更快的和不规则之一的变化表明LOSS适当的麻醉平面。

2。输精管结扎术

1. 使用男用具有公认的插拔性能优良 。
2. 消毒手术器械，其中清洁手术将要执行的曲面和用70％乙醇擦拭。
3. 如前面介绍（方案1），检查反射消失进行麻醉 。
4. 把鼠标放在一个温暖的阶段， 除去毛皮从两个假想横向线之间的腹侧区域电推子置于0.5厘米和2.5厘米以上的阴茎（ 图2A）。
5. 通过顺序擦拭，用10％聚维酮碘和70％乙醇消毒剃区域。
6. 鼠标放置在仰卧位，其对外科医生和盖用消毒毛巾用孔，露出剃区域尾巴。照亮手术区域。
7. 执行10-15毫米的纵向皮肤incisioN的中间线腹部，长约1厘米以上的阴茎。保持皮肤敷料锯齿钳，然后用剪刀剪（ 图2A和2B）。
8. 在白线进行5-10毫米纵形切口 。保持肌肉与microdissecting锯齿钳和切割用剪刀（ 图2C）。
9. 抢一侧睾丸脂肪垫微解剖锯齿钳，将其暴露睾丸， 输精管和附睾 ， 输精管位于内侧的睾丸，这是一个清晰可辨的免费管（未连接到睾丸墙壁，好像附睾）与血管沿一侧（ 图2D）上运行。
10. 持输精管用微解剖锯齿钳， 火焰敷料钳，直到它们变成红色（ 图2E ），然后用它们在一次切割和烧灼输精管的两个点（ 图2F）。切口应除去约5毫米的部分，留下两个明显分开的烧灼结束（ 图2G）。
11. 将睾丸，附睾和输精管回腹腔。
12. 从其他睾丸第9步进行 。
13. 缝合肌肉与5/0可吸收缝线（ 图2H）做一个或两个水平褥式缝合。
14. 缝合与一个或两个伤口剪（ 图2I）皮肤 。
15. 识别vasectomised男性（耳环，手指纹身...），将它的笼子放置在一个温暖的阶段， 观察，直到它从麻醉中恢复 （意识和维护胸骨斜卧）。一个0.5-1毫升皮下注射温生理盐水溶液再提高covery。输精管结扎记录在传输过程中发生的可能发生率，抗生素添加到饮用水。
16. 卷绕剪辑可以输精管切除术与伤口剪刀去除或一对齿钳10天之后被去除 。在男性输精管结扎会准备交配术后2周。
17. 通过使用它来 ​​获取收件人之前，肥沃的女性交配试验的输精管结扎男性的不育 。

3。子宫 - 输卵管胚胎移植

1. 小鼠桑椹胚或囊胚可以通过这种技术被转移到假孕雌性接受者在2.5 DPC。
2. 准备操纵胚胎玻璃吸管 :
   1. 研磨玻璃毛细管的尖端，以避免损坏吸液管保持。
   2. 通过加热用细火而略微旋转软化的玻璃毛细管的中间部分毛细管用双手同步。一旦毛细管部分变得柔软，延展性（淡红色），迅速 ​​从火焰撤回拉两端，其外部直径缩小到130-150微米。
   3. 等待玻璃冷却下来，然后剪轻轻得分狭窄部分用钻石点铅笔，研磨石或指甲锉，并从两侧拉。休息应该是干净和垂直
3. 抛光前部，通过非常迅速燃烧，留下了100-130微米的孔径。移液器可以存储供以后使用。
4. 温暖的胚胎操纵媒体 （CZBH或M2，见讨论）。
5. 消毒手术器械，其中清洁手术将要执行的曲面和用70％乙醇擦拭。
6. 如前面介绍（方案1），检查反射消失进行麻醉 。
7. 保持T他的鼠标在一个温暖的阶段， 除去毛皮从膝盖和远端肋骨（ 图3A和3B）之间的背侧区电推剪。
8. 通过顺序擦拭，用10％聚维酮碘和70％乙醇消毒剃区域。
9. 将胚胎从孵化器到预热的胚胎操纵媒体。
10. 将收件人温暖的阶段，体视显微镜下，并将其放置在俯卧位横向外科医生（与它的头向右看或外科医生的左侧）。
11. 用无菌毛巾用孔，露出剃区域覆盖的区域，照亮手术区域。
12. 执行1厘米的横向（垂直） 切口，在皮肤中位于最后肋骨和臀部和背部和腹部（ 图3A中的线之间的背⅓之间的线的颅⅓一个点ND 3B）。持与敷料锯齿钳子皮肤和用剪刀剪（ 图3C）。
13. 一旦皮肤已被切断，卵巢（红/橙）或周围的卵巢（白色）的脂肪垫可以通过体壁进行可视化。 在体壁进行0.3-0.5厘米的横向（垂直）的切口比在一个地方的切口不切断任何大血管的卵巢或脂肪垫。持与微解剖锯齿钳子肌肉和用剪刀剪下（ 图3D）。
14. 将鼠标移动到具有其头部朝向外科医生。
15. 加载胚胎操纵吸管 （ 图3E）:
    1. 允许CZBH介质通过毛细管现象通过操纵移液管的窄部提升至较宽的部分为约5毫米。
    2. 拿起一个小气泡（0.2-0.5毫米）。
    3. 在引进胚胎（5-10）媒体少量（2-4毫米）。
    4. 拿起另一个小气泡（0.2-0.5毫米）和少量的媒体（0.5-1毫米）。
    5. 留下连接到口吸气持有人或手动操作的装置，准备步骤3.17的玻璃移液管。
16. 抓住周围用微解剖锯齿钳子卵巢脂肪垫并把它朝着小鼠头部暴露卵巢，输卵管，以及一小部分的上子宫出腹腔（ 图3F和3G）。
17. 握住吸气口片在口中，随时可以使用，抢脂肪垫微解剖锯齿钳将输卵管和暴露子宫-输卵管交界处（ 即其中输卵管达到子宫）。
18. 保持子宫 - 输卵管交界处前往，采取微弯微解剖钳用左手（如果右撇子），并把它们的正下方在子宫-输卵管交界处抓长约2毫米以上的部分输卵管 。
19. 握住子宫-输卵管交界处的微弯微解剖钳， 穿破输卵管部分接近钳用27号针头（ 图3H）。
20. 将胚胎操纵吸管插入通过子宫-输卵管交界处用针和前进到子宫进行的小孔（ 图3I和3J）。一旦移液器已通过子宫-输卵管交界处（ 图3K），它的幻灯片轻松。不进步到很远的子宫，防止子宫内膜损伤（不超过3毫米）和吸管堵塞的杂物。
21. 轻轻吹（ 图3L）释放的胚胎进入子宫。这两个气泡必须通过子宫。一些媒体的第一泡以上也可以释放到子宫，但避免引入更多空气，因为它可能会妨碍着床。
22. 除去胚胎已被释放到子宫刚过吸管 。
23. 将输卵管和抓取脂肪垫子房回腹腔。
24. 用5/0可吸收缝线（ 图3M）缝合肌肉与水平褥式缝合。
25. 缝合伤口剪（ 图3N）的皮肤 。
26. 如果需要从另一侧步骤10继续。
27. 识别收件人（耳环，手指纹身...），将其移动到它的笼子（放置在一个温暖的阶段），然后观察，直到它从麻醉中恢复 （意识和维护胸骨斜卧）。
28. 注释胚胎移植过程中发生的可能发生率，并添加抗生素的饮用水。一个0.5-1毫升皮下注射温暖萨利的NE解决方案改善恢复。
29. 伤口剪辑可以胚胎移植的伤口剪去除剂或两对钳（ 图1-30）后10天被删除 。收件人可以在这一天来评估怀孕和估计幼仔的数量来衡量。胚胎移植后15天偎依提供材料给收件人。

结果

子宫-输卵管胚胎移植提供了一个刻薄的胚胎转移到子宫，避免了一些关联到子宫胚胎移植^2,9,10并发症。在表1中我们将展示我们所获得把经受不同种类的操作，以CD1收件人CD1囊胚下面描述的协议的一些代表性的结果。的生存期（导致小狗胚胎％）或存活至E15（在慢病毒暴露的情况下）是胚胎只是在体外培养从受精卵阶段（IVC），胚胎经受IPSC的注射，以产生嵌合的幼仔之...

讨论

输精管结扎术是一种相对简单的手术技术，不涉及重大困难。当用聚维酮碘和乙醇消毒确保最后一次洗涤（用乙醇）去除碘伏，因为它会刺激腹膜。到输精管的访问也可以通过阴囊或在腹部⁸进行横向切口实现的。阴囊切口已被推荐到腹部横切口，由于需要相对较小的切口，并稍微好一点的术后行为^11。然而，我们优选腹部切口在阴囊，因为它提供了从两个睾丸到输精管

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Micro dissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used, they made narrower drops.