Trasferimento di Embrione utero-tubarica e vasectomia nel modello murino

Riepilogo

Utero-tubarico trasferimento di embrioni utilizza la giunzione utero-tubarica come barriera per impedire la fuoriuscita embrione che si può verificare quando si esegue il trasferimento uterino. Maschi vasectomized sono tenuti ad ottenere destinatari pseudopregnant per il trasferimento di embrioni. Entrambe le tecniche sono discusse.

Abstract

Il trasferimento di embrioni preimpianto ad una femmina surrogata è un passo necessario per la produzione di topi geneticamente modificati o per studiare gli effetti delle alterazioni epigenetiche originati durante lo sviluppo preimpianto sul successivo sviluppo ed adulto salute del feto. L'uso di una tecnica di trasferimento di embrioni efficace e coerente è fondamentale per migliorare la generazione di animali geneticamente modificati e per determinare l'effetto di trattamenti diversi su tassi di impianto e sopravvivenza a termine. Embrioni allo stadio di blastocisti vengono generalmente trasmesse mediante trasferimento uterino, eseguendo una puntura nella parete uterina introdurre la pipetta manipolazione embrione. L'orifizio eseguita in utero non viene chiuso dopo la pipetta è stata ritirata, e gli embrioni possono deflusso alla cavità addominale causa della pressione positiva dell'utero. La puntura può anche produrre una emorragia che altera l'impianto, blocca la pipetta di trasferimento e può influenzare embrione dviluppo, soprattutto quando gli embrioni che non vengono trasferiti zona. Di conseguenza, questa tecnica spesso si traduce in tassi di sopravvivenza partire embrione molto variabili e globali. Evitare questi effetti negativi, utero-tubarica trasferimento di embrioni approfittare della giunzione utero-tubarica come una barriera naturale che impedisce all'embrione di deflusso ed evitare la puntura della parete uterina. Maschi vasectomized sono necessari per ottenere i destinatari pseudopregnant. Una tecnica per eseguire vasectomia è descritto come un complemento al trasferimento di embrioni in utero-tubarica.

Introduzione

Il trasferimento embrionale è probabilmente la procedura chirurgica più frequente eseguita nel modello murino. Questa tecnica è essenziale per ottenere discendenza di embrioni sottoposti a tecniche di manipolazione in vitro e, di conseguenza, costituisce un passo necessario per lo sviluppo di modelli geneticamente modificati mediante iniezione pronucleo, trasduzione lentivirale, o formazione di chimera. Inoltre, la tecnica consente di studiare gli effetti dello sviluppo di diverse insulti che si verificano durante lo sviluppo preimpianto. L'uso di tecniche di riproduzione artificiale ¹ o l'esposizione a concentrazioni anomale di sostanze o metaboliti ² diversi possono influenzare lo sviluppo embrionale con conseguente impianto o placentation guasti e gli effetti a lungo termine nella prole. Una tecnica di trasferimento di embrioni affidabile e riproducibile è fondamentale per verificare i possibili effetti negativi del trattamento sperimentale per l'impianto e lo sviluppo del feto in un uomo coerenteNER.

Embrioni murini preimpianto possono essere trasferiti ad una femmina destinatario sia in ovidotto tramite le ampolle di 0,5 giorni dopo coitum (DPC) destinatari pseudopregnant (trasferimento oviduct) ^3,4 o nell'utero di 2,5 DPC destinatario pseudopregnant (trasferimento uterina) ^5,6 a seconda del loro stadio di sviluppo. Embrioni allo stadio di blastocisti, come quelli utilizzati per generare topi chimerici mediante iniezione di cellule staminali pluripotenti embrionali o indotte, vengono di solito trasferite mediante trasferimento uterino. Blastocisti possono anche essere trasferiti a nell'ovidotto di un DPC destinatario 0.5, ma costituisce una prova meno fisiologica per disgregatori di sviluppo, perché l'embrione subisce diapausa e ha 2 giorni per recuperare dalla insulto prima dell'impianto avviene. Trasferimento uterino comporta perforando la parete uterina con un ago stretta in modo da generare una apertura che consente l'accesso di un embrione manipolazione pipetta nelle cavità uterina. Lanche se questa tecnica può produrre buoni risultati, la sopravvivenza a termine (ossia la percentuale di embrioni trasferiti che si sviluppano ad un cucciolo) è spesso bassa e imprevedibile ^7,8.

La puntura della parete uterina comporta alcuni effetti collaterali dannosi. Primo, miometrio è un tessuto altamente vascolarizzato e la sua puntura provoca spesso una piccola emorragia. Il sangue può bloccare la pipetta di trasferimento dell'embrione o invadere il lume uterino causando la morte embrionale e / o guasto dell'impianto. Ciò è particolarmente rilevante quando gli embrioni senza zona vengono trasferiti, come le cellule del sangue e detriti possono allegare i blastomeri. In secondo luogo, l'apertura eseguita non sigilla dopo che gli embrioni sono stati trasferiti, in modo che può rifluire attraverso l'orifizio ed essere espulso alla cavità addominale quando un eccessivo volume è stato introdurre nell'utero. Il trasferimento di embrioni in utero-tubarica qui descritto approfittare della giunzione utero-tubarica per consegnare il embryos nell'utero senza la necessità di bucare la parete uterina e quindi evitando le conseguenze negative ^9.

Le femmine destinatario pseudopregnant utilizzati per il trasferimento degli embrioni sono ottenuti per accoppiamento naturale con i maschi vasectomized ^8. Le secrezioni seminali prodotti da un maschio sterile sono necessari per l'utero di diventare ricettivo agli embrioni trasferiti. Per ottenere un destinatario, un massimo di 2 femmine di otto settimane a 6 mesi di età sono posti con un maschio vasectomizzato nel pomeriggio. La mattina seguente, le femmine vengono controllati per la presenza di una spina copula vaginale, un ciuffo di proteine ​​coagulate dal liquido seminale maschile. Come accoppiamento avviene di solito durante la mezzanotte, il giorno di rilevazione spina vaginale è considerato 0.5 dpc. Anche se i maschi vasectomized possono essere acquistati presso alcuni fornitori, la procedura chirurgica qui descritta è relativamente facile e non richiede strumenti aggiuntivi di quanto richiesto per il trasferimento degli embrioni.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Beltsville Area cura degli animali ed uso Comitati (BAACUC 11-015) secondo USDA cura degli animali e uso orientamenti.

1. Anestesia e Analgesia (comune per entrambe le procedure chirurgiche)

1. Pesare il mouse e caricare i seguenti anestetici e analgesici in due siringhe da 1 ml con 27 aghi G:
   1. Ketamina (0,1 mg / g: 0,01 ml / g di una soluzione 10 mg / ml) e xilazina (0,01 mg / g: 0.005 ml / g di una soluzione di 2 mg / ml).
   2. Buprenorfina (0,1 mcg / g: 0,01 ml di una soluzione 0,01 mg / ml).
2. Immobilizzare il mouse sollevando la collottola il più vicino alle mascelle il più possibile con il pollice e l'indice e tenendo la coda tra le piccole e anulare.
3. Iniettare miscela di ketamina-xylazina intraperitoneale. Al fine di evitare la puntura organi interni, tenere il mouse conla testa leggermente al di sotto del livello dei suoi fianchi (Figura 1A)
4. Iniettare buprenorfina per via sottocutanea nella nuca della stiva collo tra il pollice e l'indice (Figura 1B).
5. Lasciare il mouse nella gabbia (pulito e senza alcun altro animale) in una fase calda.
6. Una volta incosciente, verificare l'assenza di riflesso del piede posteriore (controllato da un pizzico tep). Applicare una pomata oculare per evitare la secchezza degli occhi e per verificare l'assenza di riflesso palpebrale (Figura 1C).
7. Questo protocollo fornisce un piano anestesia chirurgica per un minimo di 30 minuti, sufficiente per eseguire le procedure descritte di seguito (protocolli 2 e 3). Se sono necessari tempi più lunghi, un'ulteriore iniezione di ketamina + xilazina con metà della dose descritto in 1.1.1 può essere applicata dopo 30 min. Un cambiamento nel modello di respirazione ad uno più veloce e irregolare indica la loss del piano di anestesia corretta.

2. Vasectomia

1. Usare un maschio con una performance comprovata accoppiamento.
2. Sterilizzare strumenti chirurgici, pulire le superfici in cui verrà eseguita la chirurgia e asciugarli con il 70% di etanolo.
3. Eseguire l'anestesia come precedentemente descritto (Protocollo 1), controllando per la perdita dei riflessi.
4. Posizionare il mouse su una fase calda, rimuovere pelliccia con tagliaunghie elettrici dalla zona ventrale tra due linee trasversali immaginarie collocato 0,5 centimetri e 2,5 centimetri al di sopra del pene (Figura 2A).
5. Disinfettare la zona rasata pulendo sequenziale con il 10% di povidone iodio e il 70% di etanolo.
6. Posizionare il mouse nella posizione supina con la coda verso il chirurgo e coprire con un tovagliolo sterile con un foro di esporre l'area rasata. Illuminare l'area chirurgica.
7. Eseguire un incisio pelle longitudinale 10-15 mmn nella linea mediana dell'addome, circa 1 cm sopra il pene. Tenere la pelle con spogliatoio pinza seghettati e poi tagliare con le forbici (Figure 2A e 2B).
8. Eseguire una incisione longitudinale 5-10 mm in linea alba. Tenere il muscolo con microdissecting pinze dentellate e tagliare con le forbici (Figura 2C).
9. Afferra il cuscinetto adiposo testicolare di un lato con micro dissezione forcipe seghettati e tirarlo per esporre testicolo, deferenti e dell'epididimo. Vasi deferenti si trova mediale al testicolo ed è un tubo libero chiaramente distinguibile (non attaccato al muro testicolo come il epididimo) con un vaso sanguigno che corre lungo un lato (Figura 2D).
10. Tenendo il dotto deferente con un micro dissezione seghettato pinze, pinze medicazione fiamma fino a che non diventa rosso (Figura 2E ), e poi usarle per tagliare e cauterizzare i vasi deferenti in due punti contemporaneamente (Figura 2F). Il taglio dovrebbe rimuovere una porzione di circa 5 mm e lasciare due estremità cauterizzato nettamente separate (Figura 2G).
11. Spostare il testicolo, epididimo e deferenti torna alla cavità addominale.
12. Procedere dal punto 9 nell'altro testicolo.
13. Suturare il muscolo con uno o due punti di sutura materasso orizzontali realizzate con 5/0 sutura riassorbibile (Figura 2H).
14. Suturare la pelle con uno o due tagliatori di ferita (Figura 2I).
15. Identificare il maschio vasectomizzato (anello di orecchio, dito tatuaggio ...), spostare la gabbia collocata su una fase calda e osservare fino a che non recupera dall'anestesia (cosciente e mantenere decubito sternale). Una iniezione sottocutanea 0,5-1 ml di soluzione salina calda migliora recupero. Registrare le possibili incidenze che si verificano durante il trasferimento vasectomia, aggiungere antibiotico per l'acqua potabile.
16. Clip della ferita possono essere rimossi 10 giorni dopo la vasectomia con un dispositivo di rimozione ferita tagliatore o un paio di pinze denti. Il maschio vasectomizzato sarà pronto per accoppiarsi 2 settimane dopo l'intervento chirurgico.
17. Provare la sterilità del maschio vasectomizzato da accoppiamento con femmine fertili prima di utilizzarlo per ottenere destinatari.

3. Utero-tubarica Embryo Transfer

1. Mouse morule o blastocisti possono essere trasferiti da questa tecnica ad una femmina destinatario pseudopregnant a 2,5 DPC.
2. Preparare embrione vetro manipolazione pipetta:
   1. Lucidare le punte dei capillari di vetro, al fine di evitare danni al titolare pipetta.
   2. Ammorbidire una porzione centrale del capillare di vetro riscaldando con una bella fiammata mentre leggermente la rotazioneil capillare con entrambe le mani sincrono. Una volta che la sezione capillare diventa morbida e malleabile (colore rosso chiaro), ritirarsi rapidamente dal fuoco e tirare entrambe le estremità per ridurre il suo diametro esterno di 130-150 micron.
   3. Attendere che il vetro si raffreddi e poi tagliarla con una leggera segnando la parte stretta con una matita a punta di diamante, pietra abrasiva o limetta per unghie e tirando da entrambi i lati. La pausa deve essere pulita e perpendicolare
3. Lucidare la punta molto velocemente fiammeggiante, lasciando un'apertura di 100-130 micron. Le pipette possono essere memorizzati per un uso successivo.
4. Warm mezzi di manipolazione di embrioni (CZBH o M2, vedi la discussione).
5. Sterilizzare strumenti chirurgici, pulire le superfici in cui verrà eseguita la chirurgia e asciugarli con il 70% di etanolo.
6. Eseguire l'anestesia come precedentemente descritto (Protocollo 1), controllando per la perdita dei riflessi.
7. Mantenere tegli mouse su una fase calda, rimuovere pelliccia con tagliaunghie elettrici dalla zona dorsale tra le ginocchia e le costole distali (Figure 3A e 3B).
8. Disinfettare la zona rasata pulendo sequenziale con il 10% di povidone iodio e il 70% di etanolo.
9. Spostare gli embrioni dall'incubatore ai mezzi di manipolazione dell'embrione preriscaldata.
10. Spostare il destinatario di una fase calda con lo stereomicroscopio e collocarlo in posizione prona lateralmente al chirurgo (con la testa che guarda a destra oa sinistra del chirurgo).
11. Coprire l'area con un asciugamano sterile con un foro di esporre l'area rasata e illuminare la zona chirurgica.
12. Eseguire da 1 cm trasversale (verticale) incisione nella pelle in un punto situato sulla cranica ⅓ della linea tra l'ultima costola e fianchi e la ⅓ dorsale della linea tra la schiena e l'addome (Figure 3A unnd 3B). Tenere la pelle con spogliatoio pinze dentellate e tagliare con le forbici (Figura 3C).
13. Una volta che la pelle è stata tagliata, ovaio (rosso / arancione) o il pad adiposo che circonda l'ovaio (bianco) possono essere visualizzati attraverso la parete del corpo. Eseguire un 0,3-0,5 cm trasversale (verticale) incisione nella parete del corpo sopra l'ovaio o pad adiposo in un punto in cui l'incisione non taglia qualsiasi grande vaso sanguigno. Tenere il muscolo con micro dissezione pinza dentata e tagliare con le forbici (Figura 3D).
14. Muovi il mouse per avere la testa rivolta verso il chirurgo.
15. Caricare la manipolazione dell'embrione pipetta (Figura 3E):
    1. Lasciare i media CZBH di salire per capillarità attraverso la parte stretta della pipetta manipolazione fino a circa 5 millimetri della parte più larga.
    2. Prendete una piccola bolla d'aria (0,2-0,5 mm).
    3. Introdurre gli embrioni (5-10) inuna quantità minima di media (2-4 mm).
    4. Prendete un'altra piccola bolla d'aria (0,2-0,5 mm) e una piccola quantità di materiale (0,5-1 mm).
    5. Lasciare la pipetta di vetro attaccato al titolare aspirazione bocca o al dispositivo azionati a mano, pronta per il passo 3.17.
16. Afferra il pad adiposo che circonda l'ovario con micro dissezione pinza dentata e tirarlo verso la testa del mouse per esporre l'ovaio, ovidotto, e una piccola porzione di utero superiore fuori della cavità addominale (Figure 3F e 3G).
17. Tenendo il pezzo aspirazione bocca in bocca, pronto per essere utilizzato, afferrare il pad adiposo con micro dissezione pinza dentata per spostare il ovidotto ed esporre la giunzione utero-tubarica (cioè dove l'ovidotto incontra l'utero).
18. Mantenere la giunzione utero-tubarica accessibili, prendere lievi curve micro pinza per dissezione con la mano sinistra (destra se consegnato) e metterli subito sottola giunzione utero-tubarica afferrare nell'ovidotto circa 2 mm sopra quella parte.
19. Tenendo la giunzione utero-tubarica con le lievi curve micro pinze dissezione, forare la sezione ovidotto vicino alle pinze con un ago G 27 (Figura 3H).
20. Inserire l'embrione manipolazione pipetta nel foro effettuato con l'ago e avanzare verso l'utero attraverso la giunzione utero-tubarica (Figure 3I e 3J). Una volta che la pipetta ha superato la giunzione utero-tubarica (Figura 3K) si infila facilmente. Non progredire molto lontano nell'utero per evitare danni endometriale (non più di 3 mm) e pipetta blocco dai detriti.
21. Rilasciare gli embrioni nell'utero soffiando delicatamente (figura 3L). Entrambe le bolle d'aria deve passare attraverso l'utero. Alcuni dei supporti oltre la prima bollapuò anche essere rilasciato in utero, ma evitare di introdurre più aria, in quanto può impedire l'impianto.
22. Rimuovere la pipetta appena dopo embrioni sono stati rilasciati nell'utero.
23. Spostare il ovidotto e ovaio torna alla cavità addominale afferrando il pad adiposo.
24. Suturare il muscolo con un punto materasso orizzontale con 5/0 sutura riassorbibile (Figura 3M).
25. Suturare la pelle con un clipper ferita (Figura 3N).
26. Procedere dal punto 10 sul lato opposto, se necessario.
27. Identificare il destinatario (anello di orecchio, dito tatuaggio ...), spostarlo sua gabbia (posto su una fase calda) e osservare fino a che non recupera dall'anestesia (cosciente e mantenere decubito sternale).
28. Annotare le possibili incidenze che si verificano durante il trasferimento di embrioni e aggiungere antibiotico per l'acqua potabile. Una iniezione sottocutanea 0,5-1 ml di sali caldoSoluzione ne migliora il recupero.
29. Clip della ferita possono essere rimossi 10 giorni dopo il trasferimento di embrioni con un dispositivo di rimozione ferita tagliatore o due paia di pinze (Figura 3O). Il destinatario può essere pesato in quel giorno per valutare la gravidanza e stimare il numero di cuccioli. Fornire materiale adagiato al beneficiario 15 giorni dopo il trasferimento dell'embrione.

Risultati

Utero-tubarica trasferimento di embrioni fornisce un mezzo per trasferire gli embrioni in utero evitare alcune delle complicanze associate uterina trasferimento degli embrioni ^2,9,10. Nella Tabella 1 mostriamo qualche risultato rappresentativo abbiamo ottenuto il trasferimento di blastocisti CD1 sottoposti a diversi tipi di manipolazioni ai destinatari CD1 seguendo il protocollo descritto. La sopravvivenza a termine (% di embrioni risultanti in un cucciolo) o sopravvivenza a E15 (nel caso di ...

Discussione

La vasectomia è una tecnica chirurgica in avanti relativamente semplice che non comporta grandi difficoltà. Quando sanificazione con povidone iodio ed etanolo assicurarsi che l'ultimo lavaggio (con etanolo) rimuove povidone iodio, in quanto può irritare il peritoneo. L'accesso al dotto deferente può essere ottenuta anche scroto o eseguendo una incisione trasversale nell'addome ^8. Incisione scrotale è stato raccomandato di trasversali incisione addominale dovuto alla incisione relativ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Micro dissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used, they made narrower drops.