העברת רחם-תובל עובר ועיקור במודל העכבר

Summary

העברת עובר ברחם, חצוצרות משתמשת בצומת הרחם-חצוצרות כמחסום כדי למנוע את יצוא העובר שעלול להתרחש בעת ביצוע העברה ברחם. זכרים שעוקרו נדרשים להשיג מקבלי pseudopregnant לעוברים. שני הטכניקות הם דנו.

Abstract

העברת עוברי preimplantation לנקבה פונדקאית היא צעד הנדרש לייצורם של עכברים מהונדסים גנטי או כדי לחקור את ההשפעות של שינויים אפיגנטיים מקורו במהלך פיתוח preimplantation על בריאות פיתוח ומבוגר עוברית שלאחר מכן. השימוש בטכניקת העברת עובר יעילה ועקבית הוא חיונית כדי לשפר את הדור של בעלי חיים מהונדסים גנטי ועל מנת לקבוע את ההשפעה של טיפולים שונים על שיעורי השרשה והישרדות לטווח. עוברים בשלב הבלסטוציסט בדרך כלל מועברים על ידי העברת רחם, ביצוע לנקב בדופן הרחם להציג פיפטה המניפולציה עובר. פתח שבוצע ברחם אינו נסגר לאחר פיפטה בוטלה, והעוברים יכולים יצוא לחלל הבטן עקב הלחץ החיובי של הרחם. לנקב יכול גם לייצר דימום הפוגע בהשתלה, בלוקים טפטפת ההעברה ועלולה להשפיע על עובר דevelopment, במיוחד כאשר עובר ללא Zona מועברים. כתוצאה מכך, טכניקה זו לעתים קרובות תוצאות בשיעורי הישרדות עובר נמוך מאוד משתנים וכוללים. הימנעות השפעות השליליות אלה, העברת עובר ברחם, חצוצרות לנצל את צומת רחם-חצוצרות כמחסום טבעי המונע יצוא עובר ולהימנע מניקוב דופן הרחם. זכרים שעוקרו נדרשים לקבלת מקבלי pseudopregnant. טכניקה לביצוע ניתוח עיקור מתוארת כהשלמה לעוברים ברחם, חצוצרות.

Introduction

חזרת עוברים הוא כנראה ההליך הכירורגי השכיח ביותר שבוצע במודל העכבר. טכניקה זו היא חיונית כדי להשיג צאצאים מעוברים נתון במבחנה טכניקות מניפולציה, ולכן מהווה צעד הכרחי לפיתוח של מודלים מהונדסים גנטי על ידי הזרקת pronuclear, התמרה lentiviral, או היווצרות הכימרה. חוץ מזה, הטכניקה מאפשרת הלימוד של ההשפעות התפתחותיות של עלבונות מגוונים המתרחשים במהלך התפתחות preimplantation. השימוש בטכניקות מלאכותיות רבייה ¹ או החשיפה לריכוזים חריגים של חומרים או מטבוליטים ² שונים עשוי להשפיע על התפתחות עובר וכתוצאה מכישלונות השתלה או placentation והשפעות ארוך טווח בצאצאים. טכניקת חזרת עוברים אמינה לשחזור היא חיונית כדי לבדוק את ההשפעות שליליות האפשרית של טיפול ניסיוני בהשתלה והתפתחות העובר באדם עקבינר.

ניתן להעביר עוברי preimplantation Murine לנקבת נמען או לתוך oviduct באמצעות ampullae פוסט 0.5 ימים coitum הנמענים (DPC) pseudopregnant (העברת oviduct) ^3,4 או לתוך הרחם של 2.5 נמען pseudopregnant DPC (העברת רחם) ^5,6 בהתאם לשלב ההתפתחותי שלהם. עוברים בשלב הבלסטוציסט, כגון אלו המשמשים ליצירת עכברי chimeric על ידי הזרקה של תאי גזע pluripotent עובריים או מושרה, הם מועברים בדרך כלל על ידי העברת רחם. יכול גם להיות מועבר בלסטוציטים לoviduct של נמען DPC 0.5, אבל היא מהווה מבחן פחות פיסיולוגי למשבשים התפתחותי, כי העובר עובר diapause ויש לו 2 ימים להתאושש מהעלבון לפני ההשתלה מתרחשת. העברה ברחם כרוכה ניקוב דופן הרחם בעזרת מחט צרה על מנת ליצור הפתח המאפשר הגישה של פיפטה מניפולציה עובר לתוך לומן הרחם.lthough טכניקה זו יכולה להניב תוצאות טובות, ההישרדות לטווח (כלומר אחוז העוברים הועברו המתפתחים לגור) היא לעתים קרובות נמוכה ובלתי צפוי ^7,8.

ניקוב דופן הרחם כרוך כמה תופעות לוואי מזיקות. ראשית, myometrium היא רקמת vascularized מאוד ולנקבה לעתים קרובות תוצאות דימום קטן. דם עלול לחסום את טפטפת העברת עובר או לפלוש ללומן רחם גרימת מוות עוברי ו / או כישלון השתלה. זה רלוונטי במיוחד כאשר עובר ללא Zona מועברים, כמו תאי הדם והפסולת יכולים לצרף לסטומרים. שנית, הפתיחה שבוצעה אינה חותמת אחרי העוברים הועברו, ולכן הם יכולים לזרום בחזרה דרך פתח ולהיות מגורשים לחלל הבטן, כאשר נפח גדול מדי כבר להכניס לתוך הרחם. העברת העובר ברחם, חצוצרות שתוארו במסמך זה לנצל את צומת הרחם-חצוצרות כדי לספק embryos לתוך הרחם ללא הצורך בניקוב דופן רחם ובכך להימנע מההשלכות השליליות שלה ^9.

נקבות נמען pseudopregnant משמשות להעברת עובר מתקבלות על ידי הזדווגות טבעית עם זכרים עוקרו ^8. הפרשות המכוננת המיוצרים על ידי זכר סטרילי נדרשות לרחם להפוך פתוח לעוברים שהועברו. כדי להשיג נמען, למקסימום של 2 נקבות של 8 שבועות עד 6 חודשים של גיל מונחים עם זכר שעוקר בשעתי אחר הצהריים. למחרת בבוקר, נשים נבדקות לנוכחות של תקע הזדווגות בנרתיק, סבך של חלבונים קרוש מנוזל הזרע הגברי. כהזדווגות מתרחשת בדרך כלל בחצות, היום של גילוי תוסף נרתיק נחשב 0.5 DPC. למרות שניתן לרכוש זכרים עוקרו מכמה ספקים, ההליך הכירורגי שתואר במסמך זה הוא קל יחסית ואינו דורש כל מכשירים נוספים מהנדרש להעברת עובר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים פינת Beltsville והשימוש Comittees (BAACUC 11-015) בהתאם משרד החקלאות טיפול בבעלי חיים ושימוש בהנחיות.

1. הרדמה ושיכוך כאבים (משותף לשני פרוצדורות כירורגיות)

1. לשקול את העכבר ולטעון את חומרי ההרדמה ומשככי כאבים הבאים בשני מזרקים 1 מיליליטר עם 27 מחטי G:
   1. קטמין (0.1 מ"ג / גר ': 0.01 מיליליטר / גרם של פתרון 10 מ"ג / מיליליטר) ו xylazine (0.01 מ"ג / גר': 0.005 מיליליטר / גרם של פתרון 2 מ"ג / מיליליטר).
   2. עצירות (0.1 מיקרוגרם / g: 0.01 מיליליטר של פתרון 0.01 מ"ג / מיליליטר).
2. לשתק את העכבר על ידי להרים את העורף שלה קרוב ללסתות ככל האפשר עם האגודל ואצבע מורה ומחזיק את הזנב בין האצבעות הקטנות וטבעת.
3. הזרק תערובת קטמין-Xylazine intraperitoneally. על מנת להימנע מניקוב איברים פנימיים, להחזיק את העכבר עםראשו מעט מתחת לרמה של ירכיה (איור 1 א)
4. להזריק תת עורי עצירות בעורפו של צוואר אחיזה בין האגודל ואצבע המורה (איור 1).
5. השאר את העכבר בכלוב (הנקי וללא כל בעל חיים אחרים) על במה חמה.
6. ברגע שלא מודע, לבדוק על היעדריו של רפלקס האחורי ברגל (נבדק על ידי קמצוץ הבוהן). החל משחה העין כדי למנוע יובש בעיניים ולבדוק על היעדריו של רפלקס palpebral (תרשים 1C).
7. פרוטוקול זה מספק מטוס כירורגית בהרדמה למינימום של 30 דקות, מספיק כדי לבצע את ההליכים המתוארים להלן (פרוטוקולים 2 ו -3). אם פעמים יותר נדרשות, זריקה נוספת של קטמין + xylazine עם מחצית מהמינון שתואר ב1.1.1 יכולה להיות מיושמת לאחר 30 דקות. שינוי בדפוס נשימה לאחד מהיר ולא סדיר מצביע על loss של מטוס ההרדמה המתאים.

2. ניתוח עיקור

1. השתמש בגברים עם ביצועי הזדווגות מוכחות.
2. לעקר מכשירי ניתוח, לנקות את המשטחים שבו ניתוח יבוצע ולנגב אותם עם 70% אתנול.
3. לבצע הרדמה כמפורט לעיל (פרוטוקול 1), בדיקה לאובדן הרפלקסים.
4. מניחים את העכבר על במה חמה, להסיר את פרווה עם קוצץ חשמלי מאזור הגחון בין שני קווים רוחביים דמיוניים להציב 0.5 סנטימטר ו2.5 ס"מ מעל הפין (איור 2 א).
5. לטהר את האזור המגולח ידי ניגוב רציף עם 10% יוד povidone ו70% אתנול.
6. מניחים את העכבר במצב שכיבה עם הזנב לכיוון המנתח ומכסה במגבת סטרילית עם חור חושף את האזור המגולח. להאיר את אזור הניתוח.
7. בצע incisio עור אורך 10-15 מ"מn בקו המדיאלי של הבטן, כ 1 סנטימטר מעל לפין. את העור עם רוטב מלקחיים משוננים ולאחר מכן לגזור במספריים (2A דמויות ו2B).
8. בצע חתך אורכי 5-10 מ"מ בalba Linea. החזק את השרירים עם microdissecting מלקחיים משוננים ולגזור במספריים (איור 2 ג).
9. תפוס את רפידת שומן האשכים של צד אחד עם מיקרו לנתח מלקחיים משוננים ולמשוך אותו לחשוף את האשך, צינור זרע ויותרת אשך. זרע זרע ממוקם המדיאלי לאשך וזה צינור בחינם להבחין בבירור (לא צמוד לקיר כמו האשך יותרת האשך) עם כלי דם רצו לאורך צד אחד (איור 2 ד).
10. מחזיק את צינור זרע עם מלקחיים לנתח מיקרו משונן, מלקחיים הלבשה להבה עד שהם הופכים לאדומים (איור 2E ), ולאחר מכן להשתמש בם כדי לגזור ולצרוב את צינור הזרע בשתי נקודות בו זמנית (איור 2F). החתך צריך להסיר את החלק של כ -5 מ"מ ולהשאיר שני יופרדו בצורה ברורה קצוות צרובים (איור 2G).
11. הזז את האשך, יותרת האשך וצינור זרע חזרה לחלל הבטן.
12. להמשיך משלב 9 באשך השני.
13. תפרת את השריר עם תפרים מזרן אופקיים אחד או שניים עשו עם 5/0 תפר נספג (איור 2H).
14. לתפור את העור עם קוצץ אחד או שניים פצע (איור 2 ט).
15. זהה את זכר vasectomised (טבעת אוזן, קעקוע אצבע ...), להעביר אותו לכלוב שהונח על במה חמה ולהתבונן עד שהוא מתאושש מהרדמה (מודעת ולשמור על עינת חזה). הזרקה תת עורית מיליליטר 0.5-1 של תמיסת מלח חמימה משפרת מחדשcovery. רשום את מקרים האפשריים המתרחשים בעת העברת כריתת צינור זרע, להוסיף אנטיביוטיקה למי השתייה.
16. ניתן להסיר קליפים פצע 10 ימים לאחר כריתת צינור זרע עם מסיר גוזז פצע או זוג המלקחיים שיניים. הזכר שעוקר יהיה מוכן להזדווג 2 שבועות לאחר ניתוח.
17. בדוק את פוריותו של הזכר שעוקר על ידי הזדווגות עם נקבות פורה לפני השימוש בו כדי להשיג נמענים.

3. חזרת עוברים ברחם, חצוצרות

1. עכבר morulae או בלסטוציטים ניתן להעביר על ידי טכניקה זו לנקבת נמען pseudopregnant ב2.5 DPC.
2. הכן את פיפטה זכוכית המניפולציה עובר:
   1. ללטש את קצות נימי זכוכית על מנת למנוע נזק לבעל פיפטה.
   2. לרכך את החלק אמצעי של נימי זכוכית על ידי חימום עם להבה עדינה תוך סיבוב מעטהנימים בשתי הידיים באופן סינכרוני. ברגע שסעיף הנימים הופך להיות רך וגמיש (צבע אדום בהיר), לסגת ממנו במהירות מהאש ולמשוך את שני הקצוות כדי לצמצם בקוטר החיצוני שלה ל130-150 מיקרומטר.
   3. חכה לזכוכית להתקרר ולאחר מכן לחתוך אותו בקלילות הבקיע החלק הצר בעיפרון יהלומי נקודה, אבן מחוספסת או פצירה ומושך משני הצדדים. צריכה להיות ההפסקה נקייה ובניצב
3. ללטש את הקצה על ידי בוער מהר מאוד, והשאיר הפתח 100-130 מיקרומטר. טפטפות יכולה להיות מאוחסנת לשימוש מאוחר יותר.
4. תקשורת מניפולציה עובר החמה (CZBH או M2, ראה דיון).
5. לעקר מכשירי ניתוח, לנקות את המשטחים שבו ניתוח יבוצע ולנגב אותם עם 70% אתנול.
6. לבצע הרדמה כמפורט לעיל (פרוטוקול 1), בדיקה לאובדן הרפלקסים.
7. שמירה על tהוא העכבר על במה חמה, להסיר את הפרווה עם קוצץ חשמלי מאזור הגב בין הברכיים וצלעות דיסטלי (3A דמויות ו3B).
8. לטהר את האזור המגולח ידי ניגוב רציף עם 10% יוד povidone ו70% אתנול.
9. הזז את העוברים מן החממה לתקשורת המניפולציה עובר prewarmed.
10. הזז את הנמען לבמה חמה מתחת לסטראו ולמקם אותו בעמדה נוטה רוחבי למנתח (בראשה מביט לימין או לצד שמאל של המנתח).
11. מכסה את האזור במגבת סטרילית עם חור חושף את האזור המגולח ולהאיר את אזור הניתוח.
12. בצע רוחבי 1 סנטימטר חתך (אנכי) בעור במיקום ממוקם על ⅓ הגולגולת של הקו בין הצלע האחרונה והירכיים ו⅓ הגב של הקו בין הגב והבטן (3A דמויותnd 3B). את העור עם רוטב מלקחיים משוננים ולגזור במספריים (איור 3 ג).
13. ברגע שהעור נחתך, השחלה (אדום / כתום) או כרית השומן המקיפה את השחלה (לבנה) יכול להיות דמיינו דרך קיר הגוף. בצע שוכל סנטימטר 0.3-0.5 חתך (אנכי) בקיר הגוף על השחלה או כרית שומן במקום שבו החתך לא לחתוך את כל כלי דם גדולים. החזק את השרירים עם מלקחיים משוננים לנתח מיקרו ולגזור במספריים (איור 3D).
14. להזיז את העכבר כדי לקבל את ראשו פונה כלפי המנתח.
15. טען את פיפטה עובר המניפולציה (3E איור):
    1. לאפשר תקשורת CZBH לעלות בנימיות דרך החלק הצר של פיפטה המניפולציה עד כ -5 מ"מ של חלק הרחב יותר.
    2. קח את בועת אוויר קטנה (0.2-0.5 מ"מ).
    3. להציג את העוברים (5-10) בכמות מינימאלית של תקשורת (2-4 מ"מ).
    4. קח את עוד בועת אוויר קטנה (0.2-0.5 מ"מ) וכמות קטנה של מדיה (0.5-1 מ"מ).
    5. השאר את פיפטה הזכוכית מחוברת לבעל aspirator פה או למכשיר מופעל ביד, מוכן לצעד 3.17.
16. תפוס את רפידת השומן המקיפה את השחלה עם מלקחיים משוננים לנתח מיקרו ולמשוך אותו לכיוון ראש העכבר כדי לחשוף את השחלה, oviduct, וחלק קטן של הרחם העליון מחוץ לחלל הבטן (3F דמויות ודור 3).
17. מחזיק חתיכת הפה aspirator בפה, מוכן לשימוש, תופס את כרית השומן עם מלקחיים משוננים לנתח מיקרו כדי להזיז את oviduct ולחשוף את צומת הרחם-תובל (כלומר היכן oviduct עומד ברחם).
18. שמירה על צומת הרחם-תובל נגיש, לקחת מלקחיים מעוקלים קלים מיקרו לנתיחה ביד שמאל (אם ימניים) ולמקם אותם ממש מתחתצומת הרחם-תובל תופסת oviduct כ 2 מ"מ מעל חלק זה.
19. מחזיק את צומת הרחם-חצוצרות עם המלקחיים נתיחה קלים המעוגלים מיקרו, לנקב את סעיף oviduct הקרוב למלקחיים עם מחט G 27 (איור 3H).
20. הכנס את פיפטה המניפולציה העובר לתוך פתח הופיע עם המחט ומראש לרחם דרך צומת הרחם-תובל (איורים 3I ו3J). ברגע שפיפטה עברה את הצומת ברחם, חצוצרות (איור 3K) הוא מחליק בקלות. לא יתקדם רחוק מאוד אל תוך הרחם כדי למנוע נזק של רירית הרחם (לא יותר מ 3 מ"מ) וחסימת פיפטה על ידי הפסולת.
21. שחרר את העוברים לתוך הרחם על ידי בעדינות נושבת (איור 3L). שני בועות האוויר חייבים לעבור דרך הרחם. חלק מכלי התקשורת מעל הבועה הראשונהיכול גם להשתחרר אל תוך הרחם, אבל למנוע החדרת אוויר יותר, מכיוון שהוא עלול לעכב השתלה.
22. הסר את פיפטה רק לאחר העוברים שוחררו אל תוך הרחם.
23. הזז את oviduct ושחלה חזרה לחלל הבטן על ידי גרירת כרית השומן.
24. תפרת את השריר עם תפר מזרן אופקי עם 5/0 תפר נספג (איור 3M).
25. לתפור את העור עם גוזז פצע (איור 3N).
26. להמשיך משלב 10 בצד השני, אם נדרש.
27. זהה את הנמען (טבעת אוזן, קעקוע אצבע ...), להעביר אותה לכלוב שלה (שהונח על במה חמה) ולבחון עד שהוא מתאושש מהרדמה (מודעת ולשמור על עינת חזה).
28. סמן במקרים האפשריים המתרחשים במהלך חזרת עוברים ולהוסיף אנטיביוטיקה למי השתייה. הזרקה תת עורית מיליליטר 0.5-1 של סאלי החמהפתרון ne משפר את ההתאוששות.
29. ניתן להסיר קליפים פצע 10 ימים לאחר חזרת עוברים עם מסיר גוזז פצע או שני זוגות מלקחיים (איור 3O). הנמען יכול להישקל באותו יום כדי להעריך את ההריון ולהעריך את מספר הגורים. לספק חומר גוזל לנמען 15 ימים לאחר חזרת עוברים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

העברת עובר ברחם, חצוצרות מספקת מתכוון להעביר עוברים אל רחם הימנעות חלק מהסיבוכים הקשורים לעוברים ברחם ^2,9,10. בטבלה 1 אנו מראים כמה תוצאת נציג השגנו העברת בלסטוציטים CD1 נתון למיני מניפולציות לנמעני CD1 שונים בעקבות הפרוטוקול המתואר. ההישרדות לטווח (% מע?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ניתוח העיקור הוא טכניקה כירורגית קדימה יחסית ישרה שאינו כרוכה בקשיים גדולים. כאשר חיטוי עם יוד povidone ואתנול לוודא כי השטיפה האחרונה (עם אתנול) מסירה יוד povidone, מכיוון שהוא עלול לגרום לגירוי הצפק. הגישה לצינור זרע גם יכולה להיות מושגת על ידי שק האשכים או ביצוע חתך רו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used; they made narrower drops.