Utéro-tubaire transfert d'embryons et la vasectomie dans le modèle de souris

Résumé

Le transfert d'embryons utéro-tubaire utilise la jonction utéro-tubaire comme une barrière pour empêcher l'écoulement de l'embryon qui peut se produire lors de l'exécution de transfert de l'utérus. Les hommes ayant subi une vasectomie sont nécessaires pour obtenir bénéficiaires pseudo-pour le transfert d'embryon. Ces deux techniques sont discutées.

Résumé

Le transfert d'embryons de pré-implantation à une femme de substitution est une étape nécessaire à la production de souris génétiquement modifiées ou pour étudier les effets de modifications épigénétiques origine au cours du développement préimplantatoire sur le développement et la santé du fœtus adulte ultérieure. L'utilisation d'une technique de transfert d'embryons efficace et uniforme est essentielle pour améliorer la production d'animaux génétiquement modifiés, et à déterminer l'effet de différents traitements sur les taux d'implantation et de survie à long terme. Des embryons au stade de blastocyste sont généralement transférés par transfert de l'utérus, la réalisation d'une ponction dans la paroi utérine pour introduire la pipette de la manipulation de l'embryon. L'orifice effectué dans l'utérus ne se ferme pas après la pipette est retirée, et les embryons peuvent écoulement à la cavité abdominale, en raison de la pression positive de l'utérus. La ponction peut également produire une hémorragie qui affecte l'implantation, bloque la pipette de transfert et peut affecter l'embryon développement, en particulier lorsque les embryons sont transférés sans zona. Par conséquent, cette technique entraîne souvent des taux de survie faible embryon très variables et globaux. Éviter ces effets négatifs, le transfert d'embryon utéro-tubaire profiter de la jonction utéro-tubaire comme une barrière naturelle qui empêche l'embryon sorties et éviter la ponction de la paroi utérine. Les hommes ayant subi une vasectomie sont nécessaires pour obtenir bénéficiaires pseudo-. Une technique pour effectuer la vasectomie est décrite en tant que complément au transfert d'embryons utéro-tubaire.

Introduction

Le transfert d'embryons est probablement l'intervention chirurgicale le plus souvent réalisée dans le modèle de souris. Cette technique est essentielle pour obtenir la progéniture d'embryons in vitro soumis à des techniques de manipulation dans et, par conséquent, constitue une étape nécessaire pour le développement de modèles génétiquement modifiés par injection pronucléaire, transduction lentivirus, ou la formation de chimère. En outre, la technique permet l'étude des effets sur le développement de diverses insultes qui se produisent au cours du développement préimplantatoire. L'utilisation des techniques de reproduction artificielle ¹ ou l'exposition à des concentrations anormales de différentes substances ou métabolites ^{2 mai} affecter le développement de l'embryon, entraînant des échecs d'implantation ou placentation et les effets à long terme sur la progéniture. Une technique de transfert d'embryons fiable et reproductible est cruciale pour tester les effets négatifs possibles du traitement expérimental sur l'implantation et le développement du fœtus chez un homme cohérentner.

Embryons préimplantatoires murins peuvent être transférés à un destinataire femelle soit dans l'oviducte par les ampoules de 0,5 jours après le coït (DPC) des destinataires pseudo-(transfert de l'oviducte) ^3,4 ou dans l'utérus de 2,5 dpc destinataire pseudogestante (transfert de l'utérus) ^5,6 en fonction de leur stade de développement. Des embryons au stade de blastocyste, tels que ceux qui sont utilisés pour générer des souris chimères par injection de cellules souches embryonnaires pluripotentes ou induites, sont généralement transférés par transfert de l'utérus. Blastocystes peuvent aussi être transférées à l'oviducte d'une DPC bénéficiaire de 0,5, mais il constitue un test moins physiologique pour les perturbateurs de développement, parce que l'embryon subit diapause et dispose de 2 jours pour récupérer de l'insulte avant l'implantation a lieu. transfert de l'utérus implique la perforation de la paroi de l'utérus avec une aiguille étroit afin de générer une ouverture qui permet l'accès d'une pipette manipulation de l'embryon dans la lumière utérine. Aien que cette technique peut donner de bons résultats, la survie à long terme (à savoir le pourcentage d'embryons transférés qui se développent à un chiot) est souvent faible et imprévisible ^7,8.

La perforation de la paroi utérine entraîne des effets secondaires néfastes. Tout d'abord, le myomètre est un tissu très vascularisé et sa perforation en résulte souvent une petite hémorragie. Le sang peut bloquer la pipette de transfert d'embryons ou d'envahir la lumière utérine causant la mort de l'embryon et / ou de l'échec de l'implantation. Ceci est particulièrement pertinent lorsque les embryons sont transférés sans zona, comme les cellules sanguines et les débris peuvent joindre les blastomères. Deuxièmement, l'ouverture réalisée n'est pas étanche après les embryons ont été transférés, de sorte qu'ils peuvent circuler à travers l'orifice et être expulsé de la cavité abdominale quand un trop grand volume a été d'introduire dans l'utérus. Le transfert de l'embryon in utero-tubaire décrit ici profiter de la jonction utéro-tubaire de livrer le embryo dans l'utérus sans avoir besoin de perforer la paroi utérine et ainsi éviter ses conséquences néfastes ^9.

Les femmes bénéficiaires de pseudo-utilisés pour le transfert d'embryons sont obtenus par accouplement naturel avec des hommes ayant subi une vasectomie ^8. Les sécrétions séminales produites par un mâle stérile sont nécessaires pour l'utérus à devenir réceptive aux embryons transférés. Pour obtenir un destinataire, un maximum de 2 femelles de 8 semaines à 6 mois d'âge sont placés avec un mâle vasectomisé dans l'après-midi. Le lendemain matin, les femmes sont vérifiés pour la présence d'un bouchon de copulation vaginale, un bouquet de protéines coagulées du liquide séminal masculin. Comme l'accouplement a lieu habituellement pendant minuit, le jour de la détection de bouchon vaginal est considéré comme 0,5 dpc. Bien que les mâles vasectomisés peuvent être achetés auprès de certains fournisseurs, la procédure chirurgicale décrite ici est relativement facile et ne nécessite pas d'instruments supplémentaires que nécessaire pour le transfert d'embryons.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été approuvés par la Région Beltsville soin et l'utilisation des animaux Comités (BAACUC 11-015) en conformité avec l'USDA Animal Care et Directives d'utilisation.

Une. Anesthésie et l'analgésie (commune pour les deux interventions chirurgicales)

1. Peser la souris et charger les anesthésiques et analgésiques suivants dans deux seringues de 1 ml avec 27 g d'aiguilles:
   1. La kétamine (0,1 mg / g: 0,01 ml / g d'une solution à 10 mg / ml) et de xylazine (0,01 mg / g: 0,005 ml / g d'une solution à 2 mg / ml).
   2. La buprénorphine (0,1 pg / g: 0,01 ml d'une solution à 0,01 mg / ml).
2. Immobiliser la souris en décrochant le peau du cou au plus près des mâchoires que possible avec le pouce et l'index et tenant la queue entre les petits et l'annulaire.
3. Injecter mélange de kétamine-xylazine par voie intrapéritonéale. Pour éviter de percer les organes internes, tenir la souris avecsa tête légèrement au-dessous du niveau de ses hanches (figure 1A)
4. Injecter buprénorphine sous-cutanée dans la peau du maintien de cou entre le pouce et l'index (figure 1B).
5. Laissez la souris dans la cage (propre et sans aucun autre animal) sur une scène chaude.
6. Une fois inconscient, vérifier l'absence de réflexes du pied arrière (vérifié par pincement de l'orteil). Appliquer une pommade pour les yeux pour éviter la sécheresse de l'œil et de vérifier l'absence de réflexe palpébral (figure 1C).
7. Ce protocole prévoit un plan d'anesthésie chirurgicale pour un minimum de 30 minutes, assez pour effectuer les procédures décrites ci-dessous (les protocoles 2 et 3). Si des temps plus longs sont nécessaires, une injection supplémentaire de la kétamine + xylazine avec la moitié du dosage décrit dans 1.1.1 peut être appliquée après 30 min. Un changement dans le mode de respiration pour une plus rapide et une irrégularité indique le loss du plan d'anesthésie appropriée.

2. Vasectomie

1. Utilisez un homme avec une capacité d'accouplement prouvé.
2. Stériliser les instruments chirurgicaux, nettoyer les surfaces où la chirurgie sera effectuée et les essuyer avec 70% d'éthanol.
3. Effectuer anesthésie détaillé précédemment (Protocole 1), la vérification de la perte des réflexes.
4. Placez la souris sur une scène chaude, enlever la fourrure avec une tondeuse électrique de la région ventrale entre deux lignes transversales imaginaires placé 0,5 cm et 2,5 cm au-dessus du pénis (figure 2A).
5. Désinfecter la zone rasée par essuyage séquentiel avec 10% de l'iode de povidone, et de 70% d'éthanol.
6. Placez la souris en position couchée avec sa queue vers le chirurgien et la couverture avec une serviette stérile avec un trou d'exposer la zone rasée. Éclairer la zone chirurgicale.
7. Effectuez une incisio de la peau longitudinale 10-15 mmn à la ligne médiane de l'abdomen, à environ 1 cm au-dessus du pénis. Maintenez la peau avec dressing pince dentelées et puis couper avec des ciseaux (Figures 2A et 2B).
8. Effectuer une incision longitudinale de 5-10 mm dans la ligne blanche. Tenez le muscle avec microdissecting forceps dentelées et couper avec des ciseaux (figure 2C).
9. Prenez le coussin adipeux des testicules d'un côté avec micro dissection forceps dentelées et tirez pour exposer les testicules, les canaux déférents et l'épididyme. Canaux déférents est situé en dedans de l'testicule et il est un tube sans distinguer clairement (pas attaché à la paroi du testicule comme l' épididyme) avec un vaisseau sanguin le long d'un côté (figure 2D).
10. Tenir le canal déférent avec dissection dentelée micro forceps, pinces à pansement flamme jusqu'à ce qu'ils deviennent rouges (figure 2E ), puis les utiliser pour couper et cautériser le canal déférent de deux points à la fois (figure 2F). La coupe doit enlever une partie d'environ 5 mm et laisser deux extrémités cautérisés clairement séparés (figure 2G).
11. Déplacez les testicules, épididyme et le canal déférent vers la cavité abdominale.
12. Passez à l'étape 9 dans l'autre testicule.
13. Suturer le muscle avec un ou deux points de suture de matelassier horizontale à base de 5/0 suture absorbable (figure 2H).
14. Suturer la peau avec un ou deux tondeuses de la plaie (figure 2I).
15. Identifier le vasectomisé (de boucle d'oreille, tatouage doigt ...), déplacer la cage placée sur une étape chaleureuse et observer jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie (conscient et maintenir décubitus sternal). Une injection sous-cutanée de 0,5 à 1 ml de solution saline chaude améliore redécouverte. Enregistrer les incidents pouvant se produire pendant le transfert vasectomie, ajouter antibiotique à l'eau potable.
16. Clips plaies peuvent être retirés 10 jours après la vasectomie avec un dissolvant blessure de tondeuse ou une paire de pinces à dents. Le mâle vasectomisé sera prête à s'accoupler 2 semaines après la chirurgie.
17. Testez l'infertilité du mâle vasectomisé par accouplement avec des femelles fertiles avant de l'utiliser pour obtenir des bénéficiaires.

3. Utéro-tubaire de transfert d'embryons

1. Souris morula ou blastocyste peuvent être transférés par cette technique à un destinataire femelle pseudo à 2,5 dpc.
2. Préparer embryon pipette en verre de manipulation:
   1. Polir les extrémités des capillaires en verre, afin d'éviter d'endommager le porte-pipette.
   2. Adoucir une partie médiane du capillaire de verre par chauffage d'une amende flamme tout en tournant légèrementle capillaire avec les deux mains de manière synchrone. Une fois la section capillaire devient mou et malléable (rouge clair), le retirer rapidement de la flamme et tirez les deux extrémités pour réduire son diamètre externe de 130-150 um.
   3. Attendez que le verre refroidisse et le couper en marquant légèrement la partie étroite avec un crayon pointe de diamant, pierre abrasive ou lime à ongles et en tirant des deux côtés. La rupture doit être propre et perpendiculaire
3. Polir la pointe à la flamme très rapidement, laissant une ouverture de 100-130 um. Les pipettes peuvent être stockés pour une utilisation ultérieure.
4. Chaud médias de manipulation de l'embryon (CZBH ou M2, voir la discussion).
5. Stériliser les instruments chirurgicaux, nettoyer les surfaces où la chirurgie sera effectuée et les essuyer avec 70% d'éthanol.
6. Effectuer anesthésie détaillé précédemment (Protocole 1), la vérification de la perte des réflexes.
7. Garder til la souris sur une scène chaude, retirez la fourrure avec une tondeuse électrique de la région dorsale entre les genoux et les nervures distales (figures 3A et 3B).
8. Désinfecter la zone rasée par essuyage séquentiel avec 10% de l'iode de povidone, et de 70% d'éthanol.
9. Déplacez les embryons de l'incubateur pour les médias de manipulation de l'embryon préchauffé.
10. Déplacez le destinataire à un stade chaud sous la loupe binoculaire et placez-le en position latérale sujettes au chirurgien (avec sa tête regardant vers la droite ou la gauche du chirurgien).
11. Couvrir la zone avec une serviette stérile avec un trou d'exposer la zone rasée et éclairer la zone chirurgicale.
12. Effectuer un 1 cm transversale (verticale) incision dans la peau à un endroit situé sur le crâne ⅓ de la ligne entre la dernière côte et les hanches et le ⅓ dorsale de la ligne entre le dos et l'abdomen (figures 3A unee 3B). Maintenez la peau avec dressing pince dentelées et couper avec des ciseaux (figure 3C).
13. Une fois que la peau a été coupée, de l'ovaire (rouge / orange) ou le pad adipeux entourant l'ovaire (blanc) peuvent être visualisées à travers la paroi du corps. Effectuez une 0,3-0,5 cm transversale (verticale) incision dans la paroi du corps sur l'ovaire ou un coussin adipeux dans un endroit où l'incision ne coupe pas tout navire grande de sang. Tenez le muscle avec micro dissection pince dents de scie et couper avec des ciseaux (figure 3D).
14. Déplacez la souris pour avoir sa tête tournée vers le chirurgien.
15. Chargez la manipulation pipette de l'embryon (figure 3E):
    1. Permettre aux médias CZBH à monter par capillarité à travers la partie étroite de la pipette de manipulation jusqu'à environ 5 mm de la partie la plus large.
    2. Prenez une petite bulle d'air (0,2-0,5 mm).
    3. Présentez les embryons (5-10) dansune quantité minimale de supports (2-4 mm).
    4. Prenez une autre petite bulle d'air (0,2-0,5 mm) et une petite quantité de médias (0,5-1 mm).
    5. Laisser la pipette en verre fixé au support de l'aspirateur de la bouche ou au dispositif actionné à la main, prêt à l'étape 3.17.
16. Prenez le coussin adipeux entourant l'ovaire avec micro dissection forceps en dents de scie et tirez-le vers la tête de la souris pour exposer l'ovaire, oviducte, et une petite partie de l'utérus supérieure de la cavité abdominale (figures 3F et 3G).
17. Maintien de la pièce aspirateur à bouche dans la bouche, prêt à être utilisé, prenez le pad adipeux avec micro dissection pince dents de scie pour déplacer l'oviducte et exposer la jonction utéro-tubaire (c'est à dire où l'oviducte répond l'utérus).
18. Garder la jonction utéro-tubaire accessible, prendre de légères micro pinces à dissection courbes de la main gauche (pour un droitier) et les placer juste en dessousla jonction utéro-tubaire saisissant l'oviducte sur 2 mm au-dessus de la partie.
19. Tenir la jonction utéro-tubaire avec les légères micro pinces à dissection courbes, percer la section oviducte à proximité de la pince avec une aiguille de calibre 27 (figure 3H).
20. Insérez l'embryon manipulation pipette dans l'orifice effectué avec l'aiguille et l'avance de l'utérus à travers la jonction utéro-tubaire (figures 3I et 3J). Une fois la pipette a passé la jonction utéro-tubaire (Figure 3K), il se glisse facilement. Ne pas progresser très loin dans l'utérus pour éviter d'endommager l'endomètre (pas plus de 3 mm) et le blocage de la pipette par des débris.
21. Relâchez les embryons dans l'utérus par soufflant doucement (Figure 3L). Les bulles d'air doivent passer par l'utérus. Certains médias-dessus de la première bullepeuvent également être disséminés dans l'utérus, mais éviter d'introduire plus d'air, car il pourrait entraver l'implantation.
22. Retirer la pipette juste après embryons ont été libérés dans l'utérus.
23. Déplacez l'oviducte et de l'ovaire vers la cavité abdominale en saisissant le pad adipeux.
24. Suturer le muscle avec un point de matelassier horizontale avec 5/0 suture absorbable (figure 3M).
25. Suturer la peau avec une tondeuse de la plaie (figure 3N).
26. Passez à l'étape 10 de l'autre côté si nécessaire.
27. Identifier le destinataire (boucle d'oreille, tatouage doigt ...), le déplacer vers sa cage (placé sur une scène chaude) et observer jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie (conscient et maintenir décubitus sternal).
28. Annoter les incidences possibles survenant pendant le transfert d'embryons et d'ajouter des antibiotiques à l'eau potable. Un 0,5-1 ml injection sous-cutanée de sali chaudsolution ne améliore la récupération.
29. Clips plaies peuvent être retirés 10 jours après le transfert d'embryon avec un dissolvant plaie de coupe ou deux paires de pinces (Figure 3O). Le destinataire peut être pesé ce jour pour évaluer la grossesse et estimer le nombre de chiots. Fournir du matériel niché au destinataire 15 jours après le transfert d'embryon.

Résultats

Transfert d'embryons utéro-tubaire fournit un moyen de transférer les embryons dans l'utérus d'éviter certaines des complications associées au transfert d'embryon de l'utérus ^2,9,10. Dans le tableau 1, nous montrons un résultat représentatif, nous avons obtenu le transfert de blastocystes CD1 soumis à différents types de manipulations aux bénéficiaires CD1 suivant le protocole décrit. La survie à long terme (% des embryons résultant en un chiot) ou la survie...

Discussion

La vasectomie est une technique chirurgicale relativement simple qui ne comporte pas de difficultés majeures. Quand la stérilisation avec de la povidone iode et de l'éthanol assurez-vous que le dernier lavage (avec de l'éthanol) supprime povidone iode, car il peut irriter le péritoine. L'accès au canal déférent peut également être obtenue par le scrotum ou la réalisation d'une incision transversale dans l'abdomen ^8. Incision scrotale a été recommandé de transversales...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Micro dissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used, they made narrower drops.