الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار: بروتوكولات لعزل وتقييم الكريات البيضاء والصفائح الدموية البشرية

Summary

الكريات البيض في الدم والصفائح الدموية ويمكن أن تستخدم كعلامة للصحة الطاقة البيولوجية الشاملة للفرد وذلك لديها القدرة على رصد العمليات المرضية وتأثير العلاجات. نحن هنا تصف طريقة لعزل وقياس وظيفة الميتوكوندريا وانفجار التأكسدي في هذه الخلايا.

Abstract

ومن المعروف ضعف الميتوكوندريا أن تلعب دورا هاما في عدد من الحالات المرضية مثل تصلب الشرايين، والسكري، والصدمة الإنتانية، والأمراض العصبية ولكن تقييم التغيرات في وظيفة الطاقة البيولوجية في المرضى الذين يعانون من التحدي. على الرغم من أن الأمراض مثل السكري أو تصلب الشرايين الحاضر سريريا مع ضعف الجهاز محددة، مكونات النظامية من الأمراض، مثل ارتفاع السكر في الدم أو التهاب، ويمكن تغيير وظيفة الطاقة البيولوجية في تعميم الكريات البيض أو الصفائح الدموية. وقد اعترف هذا المفهوم لبعض الوقت ولكن تم تقييد التطبيق على نطاق واسع من قبل عدد كبير من الخلايا الأولية اللازمة لتحليل الطاقة البيولوجية. وقد تم التغلب على هذا القيد من خلال الجمع بين التقنية خصوصية تقنيات حبة العزل المغناطيسي، وتقنيات التصاق الخلية، والتي تسمح للخلايا لضمها دون تفعيل لmicroplates، وحساسية من التكنولوجيات الجديدة مصممة للإنتاجية عالية هيئة التصنيع العسكريقياس التنفس roplate. مثال على هذه المعدات هو محلل تدفق خارج الخلية. يستخدم مثل هذه الأجهزة عادة الأكسجين ودرجة الحموضة تحقيقات حساسة لقياس معدلات التغير في هذه المعلمات في الخلايا الملتصقة، ومن ثم يمكن المتعلقة الأيض. نحن هنا من التفصيل الطرق لعزل وطلاء من وحيدات، الخلايا الليمفاوية، والعدلات والصفيحات، من دون تفعيل، من الدم البشري وتحليل وظيفة الميتوكوندريا الطاقة البيولوجية في هذه الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، ونحن لشرح كيفية التأكسدي انفجر في وحيدات والعدلات ويمكن أيضا أن يقاس في نفس العينات. منذ استخدام هذه الأساليب فقط 8-20 مل دم الإنسان لديهم إمكانات لرصد الجيل أنواع الاكسجين التفاعلية والطاقة الحيوية في عملية إعداد سريرية.

Introduction

مراقبة صحة الطاقة البيولوجية للخلايا المناعية (وحيدات، الخلايا الليمفاوية، العدلات) والصفائح الدموية من الدم وقد اعترف لبعض الوقت كأداة تشخيصية يمكن أن تكون مفيدة لتقييم صحة الطاقة البيولوجية الشاملة للفرد. هناك هيئة الناشئة الأدب وعزا عدد من الأمراض مثل السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية وأمراض الاعصاب لضعف الميتوكوندريا ^1،2. هذا هو المهم سريريا منذ ضعف الميتوكوندريا يمكن الشروع في سلسلة من الأحداث الخلوية التي تعزز مسارات الإشارات الموالية للالتهابات أو تؤدي إلى موت الخلية. وتتميز العديد من الدراسات وظيفة الميتوكوندريا من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى والصفائح الدموية في ظروف مثل فيبروميالغيا، ومرض السكري، والصدمة الإنتانية، ومرض الزهايمر ^3-7. على سبيل المثال، تقييم دراسة حديثة أن الطاقة الحيوية من الصفائح الدموية كعلامة من أجل وظيفة الميتوكوندريا وجدت أن الصفائح الدموية من النوع 2 DIABETقد المرضى جيم تقلص الميتوكوندريا ^7،8 استهلاك الأوكسجين. من هذه النتائج وغيرها، فمن الواضح أن وحيدات، الخلايا الليمفاوية، العدلات، والصفائح الدموية يمكن أن تكون علامات بديلة وذلك اعتبارا من التغيرات في الطاقة الحيوية في ظل ظروف مرضية لأنها مسح جهاز الدورة الدموية ويمكن أن تعكس التغيرات الأيضية المحلية والعالمية. لتحديد ما إذا كان هذا النهج له قيمة النذير أو التشخيص طريقة إنتاجية عالية من التحليل وكان المطلوب هو طريقة متسقة لإعداد الخلية.

الأساليب لقياس وظيفة الميتوكوندريا في الكريات البيض والصفيحات الدموية وقد شاركت سابقا عزل الميتوكوندريا أو تقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الخلايا سليمة ^4،9. الاستفادة من تقييم الطاقة البيولوجية الخلوية باستخدام تدفق خارج الخلية (XF) محلل هو أن وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا يمكن أن تنشأ مع ركائز الذاتية والمعلمات الجهاز التنفسي مثل تسرب بروتون والجهاز التنفسي القصوىيمكن تحديد القدرات. نحن وغيرنا قد استخدمت هذه التكنولوجيا لإظهار أن ملامح الطاقة البيولوجية في الصفائح الدموية، وحيدات الخلايا اللمفية المعزولة من الدم البشري يمكن أن تنشأ ومقارنة بين أنواع الخلايا ^8. بالإضافة إلى ذلك، كل من العدلات وحيدات تمتلك قدرة التأكسدي في انفجار التي يتم تنشيطها oxidases NAPDH وتستهلك الأكسجين لتشكيل الفائق. الأهم من ذلك، هذا المسار هو عنصر أساسي من المناعة الفطرية والالتهابات الجهازية عن طريق التضمين. على سبيل المثال، فقد تبين أن ترتبط التغييرات في قدرة التأكسدي انفجار مع مختلف أمراض المناعة الذاتية مثل التصلب المتعدد، والتهاب المفاصل، والالتهابات المتكررة ^10،11. حاليا لا توجد إنتاجية عالية المقايسات الكمية المتوفرة لقياس انفجار التأكسدي في العينات السريرية. هذا أمر مهم لأن تميز قدرة التأكسدي انفجار العدلات وحيدات قد تخدم أيضا كأداة تشخيصية هامة لعدة patholoخيس.

كانت التحديات التقنية الرئيسية انخفاض الحساسية لقياس استهلاك الأوكسجين باستخدام تقنيات تخطيط الاستقطاب التقليدية والحاجة إلى استخدام الخلايا المرفقة عند استخدام تقنيات صفيحة ميكروسكوبية فلوروميتريك أكثر حساسية. في هذا الفيديو عملية، ونحن تصف حل تقني لهذه المشاكل. نحن بالتفصيل الأساليب لعزل، والطلاء وقياس الطاقة الحيوية من وحيدات، الخلايا الليمفاوية، العدلات، والصفائح الدموية وانفجار التأكسدي من وحيدات والعدلات من الدم البشري، وهذا الأسلوب هو مناسبة لتقييم السريرية من الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار للمحققين أن يكون الوصول إلى السكان المريض والقدرة على الحصول على عينات دماء جديدة.

Protocol

وقد تم استعراض كافة البروتوكولات وصفها في هذه المخطوطة لجمع الدم والعزلة والتحليل والتي وافق عليها مجلس المراجعة المؤسساتي في جامعة ألاباما في برمنغهام.

1. عزل الخلية (معدلة من Histopaque سيغما الدريخ البروتوكول رقم 1119 وبيوتيك Miltenyi MicroBead إيجابي والبروتوكولات اختيار سلبي)

1. الطرد المركزي الدم الكامل (تم جمعها في ACD أو أنابيب EDTA) في 500 x ج لمدة 15 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مع الدوار يتأرجح دلو (التسارع = 5-6، وليس الفرامل).
2. إزالة الطبقة العليا التي تحتوي على صفائح البلازما الغنية (الحزب الثورى) مع ماصة نقل حتى يبقى 1 سم فوق طبقة الخلايا (كرات الدم الحمراء معطف / ​​الشهباء). جانبا PRP في درجة حرارة الغرفة لتجهيز في وقت لاحق.
3. نقل معطف الشهباء لالعقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل، وتمييع إلى 24 مل مع RPMI القاعدية أو إلى 4x على الأقل بدءا حجم معطف الشهباء.
   ملاحظة: في النصف العلوي من طبقة RBC قد حافي ليتم تضمينها على الرغم من أن هذا سيؤدي إلى زيادة حجم RPMI نسبيا.
4. إعداد التدرج الكثافة ومنخفض الكثافة باستخدام Ficoll مع الثقل النوعي من 1.077 (1077) عن الطبقة العليا وارتفاع كثافة Ficoll مع الثقل النوعي من 1.119 (1119) عن الطبقة السفلى في ثلاثة أنابيب مخروطية 15 مل (3 مل لكل منهما). لتنفيذ هذه الخطوة، أولا إضافة 1077 إلى كل أنبوب. باستخدام 5 مل ماصة الضيقة إضافة 1119 إلى الجزء السفلي من الأنبوب من خلال وضع غيض ماصة تحت 1077 وببطء الافراج عن كاشف دون خلط مع التدرج العليا. وينبغي أن يكون ما مجموعه 6 مل من وسائل الإعلام التدرج الكثافة الحالية في هذه المرحلة مع مرحلة اضح عن الانفصال في 3 مل علامة.
5. باستخدام ماصة الآلي، إضافة 8 مل من الدم المخفف (من الخطوة 1.3) بلطف إلى كل أنبوب التدرج باستخدام الإعداد الطاقة المنخفضة لمنع إزعاج من طبقات متدرجة. يجب أن يكون الحجم الكلي 14 مل في هذه الخطوة.
6. أنابيب الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (accele6 التموينية، لا الفرامل).
   ملاحظة: في هذه المرحلة، يجب أن يكون ثلاثة نطاقات خلية متميزة واضح (الشكل 1A). نطاقات العلوي (بين 1077 والبلازما) يحتوي على خلايا وحيدات النوى (الشركات المتعددة الجنسيات) والصفائح الدموية، والفرقة الوسط (بين 1007 و 1119) يحتوي على خلايا النوى (PMNs) وانخفاض الفرقة (أقل من 1119) يحتوي على كرات الدم الحمراء.
7. جمع MNC وPMN بشكل منفصل باستخدام ماصات زجاجية معقمة دون إزعاج نطاقات الخلايا الأخرى. الجمع بين السكان MNC من كل أنبوب إلى أنبوب 50 مل العقيمة المخروطية. كرر هذا للسكان PMN كذلك.
8. إضافة 4 مجلدات من RPMI إلى كل أنبوب يحتوي على MNC وPMN الكسور على التوالي لتخفيف التدرج الكثافة.
9. أنابيب الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
10. في resuspend MNC بيليه الخلية والخلية بيليه PMN في 1 مل RPMI تحتوي على 0.5٪ نقي للغاية الدهنية خالية من حمض BSA (RPMI-BSA) ونقل إلى 1.5 مل أنابيب عقيمة. بيليه الخلايا باستخدام picofuge الفوق لمدة 30ثانية.
11. تجاهل طاف و resuspend كل بيليه الخلية في 80 ميكرولتر RPMI-BSA.
12. إضافة 20 ميكرولتر من حبة المغناطيسي المسمى antiCD14 الضد إلى الأنبوب الذي يحتوي على جزء MNC لاختيار إيجابية من وحيدات. للالأنبوب الذي يحتوي على جزء الخلية PMN، إضافة 20 ميكرولتر من حبة المغناطيسي المسمى antiCD15 الأجسام المضادة لاختيار إيجابية من العدلات. احتضان كل تعليق خلية لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
13. يغسل كل تعليق الخلية مع 1 مل سائل الإعلام RPMI-BSA وبيليه كما كان من قبل و resuspend كل بيليه في 500 ميكرولتر RPMI-BSA.
14. يتم فصل الخلايا المسمى في المجال المغناطيسي للخلية تنشيط الفرز المغناطيسي (MACS) فاصل. إعداد الأعمدة MACS LS (واحد لكل تعليق خلية) عن طريق وضع العمود على فاصل MACS والغسيل مع 3 مل من RPMI-BSA قبل إضافة تعليق الخلية.
15. بعد تطبيق الايقاف الخلية، وغسل كل عمود 3X مع 3 مل من RPMI-BSA سائل الإعلام (تأكد من السماح للدري وسائل الإعلامن تماما بين يغسل). جمع التعليق الخلية التدفق من خلال ويغسل العمود في أنبوب العقيمة.
16. لعزل حيدات والعدلات، وإزالة العمود من المجال المغناطيسي بعد غسل النهائي وأزل الخلايا المحددة بشكل إيجابي في أنبوب العقيمة مع 5 مل من RPMI-BSA باستخدام المكبس العمود.
17. لعزل الخلايا الليمفاوية بيليه جزء التدفق من خلال غسل من الشركات المتعددة الجنسيات من الخطوة 1.15 في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في 80 ميكرولتر RPMI-BSA. إضافة 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة CD61 وCD235a واحتضان تعليق خلية لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. تكرار فصل MACS كما كان من قبل، وجمع تدفق الرغم تحتوي على الخلايا الليمفاوية.
18. لتكوير حيدات، العدلات، اللمفاويات والكسور، كما كان من قبل أجهزة الطرد المركزي (الخطوة 1.9) وتجاهل supernatants. يجب معلق الكريات الخلايا في 1 مل خارج الخلية تدفق وسائل الاعلام (XF-DMEM) لفرز الأصوات. <ر /> ملاحظة: يجب 8 مل من الدم الكامل يؤدي إلى 1-5 × 10 ⁶ حيدات / مل، و5-20 × 10 ⁶ الخلايا الليمفاوية والعدلات / مل.
19. لعزل الصفائح الدموية، الطرد المركزي PRP (الخطوة 1.2) لمدة 8-10 دقيقة في 1،500 XG في درجة حرارة الغرفة. إزالة البلازما ويغسل مرة واحدة مع بيليه الخلية معقمة 5 مل PBS تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل PGI _2، repellet وتعليق بيليه النهائي في 1 مل من برنامج تلفزيوني PGI ₂ العازلة.
20. تحديد عدد الصفائح الدموية عن طريق قياس العكر مرة واحدة وعلقت الصفائح الدموية في برنامج تلفزيوني PGI ₂ العازلة معمل كما وصفها Walkowiak آخرون باستخدام المعادلة التالية: [6.23 / (2.016 - عبس _800)] - عامل التخفيف 3.09 س = # × 10 ^8. الصفائح الدموية / مل ^12.

2. طلاء للخلايا

1. إعداد الخلوي تاك (لاصق الخلية): إضافة 90 ميكرولتر خلية لاصقة إلى 180 ميكرولتر DIH ₂ 0، 540 ميكرولتر من 0.1 N ثنائي الصوديومكربونات (درجة الحموضة 8.0)، وضبط درجة الحموضة إلى 7،2-7،8 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم. إعداد لوحات XF (24 جيدا، V7 microplates) بواسطة طلاء كل جيدا مع 30 ميكرولتر من خلية لاصقة المعدة.
   ملاحظة: يجب أن يكون مستعدا لاصقة خلية جديدة لكل استخدام.
2. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة ثم اللصق الخلية نضح ويغسل الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني (1 مل / جيد).
3. تنفيذ عدد خلايا معزولة على حيدات، الخلايا الليمفاوية، والعدلات والصفيحات وتقديمهم إلى حجم مناسب باستخدام XF-DMEM للسماح كثافة البذر من 250K خلايا / جيد للحيدات، الخلايا الليمفاوية، والعدلات، و 25 × 10 ⁶ / جيد لالصفائح الدموية. بدلا من ذلك، لقياس استجابة انفجار الأكسدة، العدلات يمكن المصنف في 125K خلايا / جيد. يجب أن يكون حجم بذر النهائي لكل ميكرولتر 200 تعليق خلية / جيد.
4. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 200 x ج لمدة 1 ثانية مع عدم وجود الفرامل. تدوير لوحة 180 ˚ وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى مع عدم وجود الفرامل في 300 × ز.
5. جلب المجلد جيدا النهائيأوميا إلى 660 ميكرولتر مع XF-DMEM واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل XF الفحص. ملاحظة: Photomicrographs الخلايا مطلي قبل وبعد الفحص يمكن استخدامها لضمان الطلاء الكافية ويستبعد مفرزة الخلية.

3. إعداد 24 جيدا خارج الخلية الجريان الفحص بلايت (XF24)

1. هيدرات XF يبحث مع حل calibrant مدة لا تقل عن 2 ساعة قبل الفحص.
2. إعداد 10X مخزونات 0.5 ميكروغرام / مل أوليغوميسين، 0.6 ميكرومتر FCCP، و 10 ميكرومتر في antimycin A-XF DMEM وتحميل 75 ميكرولتر من الحلول الأسهم في الموانئ حقن خرطوشة في الترتيب أعلاه. إذا القياسات انفجار الأكسدة هي التي يمكن الحصول عليها، حقن 10X الأسهم من 100 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية يمكن حقنها بعد antimycin-A.
3. معايرة خرطوشة رطب وتحميلها وتنفيذ أعمال الفحص XF. وقد وصفت وسائل تفصيلية لتحليل وتفسير التغيرات سواء استهلاك الأوكسجين ودرجة الحموضة في المنشورات السابقة ^9،13،14 ولا دiscussed في التفاصيل هنا.
4. بعد XF مقايسة، ونضح جميع ولكن 50 ميكرولتر من مشاركة XF-DMEM بعد الفحص لمنع فقدان الخلايا من لوحة وإضافة 50 ميكرولتر العازلة RIPA تحلل الخلية وإجراء فحص البروتين للتطبيع.

النتائج

من أجل تقييم الطاقة الحيوية من خلايا الدم، ويتم جمع الدم كله من الموضوعات الإنسان عن طريق بزل الوريد في EDTA أو ACD أنبوب جمع vacutainer. هو تصور عزل الكريات البيضاء والصفائح الدموية التالية جمع الدم في الشكل 1A كما هو مفصل في البروتوكول. تتم معالجة عينات الدم الكامل في غضون 8 ساعة من جمع لتجنب موت الخلايا والتنشيط. لم يتم اختبارها مرات التخزين الموسعة أكبر من 8 ساعات ولكن قد يؤدي إلى تغير الطاقة الحيوية ويكون ممثلا أقل من الظروف الفسيولوجية. وقد استخدمت حمض سترات الدكستروز (ACD-8 مل) وEDTA vacutainer أنابيب لخلية العزلة مع عدم وجود تأثير ملاحظ على وظيفة الطاقة البيولوجية للخلايا معزولة. مضادات التخثر هي الضرورة الجلطات تقلل من عدد الخلايا التي تم الحصول عليها، تتداخل مع تشكيل المرحلة المناسبة خلال التدرج Ficoll الطرد المركزي، وتؤدي في قليل من دون الحصول على الصفائح الدموية في المصل بالطرد المركزي. يمثل كل دم بيولوجيجب أن تنفذ الخطر كال ومعدات الحماية الشخصية المناسبة في جميع أنحاء الإجراء بأكمله حتى بعد عزل السكان الخلية أو يتم إنشاؤها لست] الخلية. العينات ليتم التخلص منها وفقا للمعايير التخلص من النفايات البشرية للمؤسسة.

يتم طرد الدم كله لفصل الصفائح الدموية البلازما الغنية من معطف الشهباء، وطبقة بيضاء فقط فوق خلايا الدم الحمراء معبأة الذي يحتوي على الكريات البيض. يتم تطبيق الغلالة الشهباء لتدرجات الكثافة وطرد للحصول على خلايا الدم المحيطية (وحيدات الخلايا اللمفية) وخلايا النوى (المحببة). تلوث RBC الفرد MNC وPMN مراحل الخلية هو شائع في هذه المرحلة ويجب ان تحل خلال تنقية MACS. ثم يتم الحصول على أنواع الخلايا المختلفة عن طريق احتضان مع الأجسام المضادة المغناطيسي للحصول الكسور النقي. يتم جمع وحيدات قبل الحضانة الكسر PBMC مع CD14، من خلال تدفق من رانه حيدات الخلايا الليمفاوية تحتوي على، والتي يتم بعد ذلك المنضب من كرات الدم الحمراء والصفائح الدموية. ويتم الحصول على العدلات بواسطة حضانة طبقة الخلايا النوى مع CD15 الأجسام المضادة (الشكل 1A). بعد ذلك، والصفائح الدموية يمكن مكعبات بواسطة الطرد المركزي من البلازما الغنية الصفيحات وغسلها لإزالة مكونات البلازما الأخرى. بعد هذه التحديدات في الصفائح الدموية، CD14 + حيدات، الخلايا الليمفاوية، CD15 + العدلات يمكن عدها ومطلي على التصاق الخلية XF وحة محلل المغلفة المتوسطة لتحليل الطاقة الحيوية والأكسدة انفجار.

يجب أن يتم تنفيذ كل مرحلة من مراحل الإجراء في ظروف معقمة ويتم تشجيعهم على منع التنشيط المبكر للاستجابة التأكسدي انفجر في وحيدات والعدلات. مؤشرا على أقل من ظروف معقمة خلال العزلة هو واضح عندما العدلات، والتي ليس لديهم أي استهلاك الأوكسجين في ظل ظروف القاعدية، وتبدأ فحص تدفق خارج الخلية مع القياسات التي OCR مرتفعةزيادة تدريجية أو الانخفاض في جميع أنحاء الفحص. نؤكد على أهمية التصوير الخلايا باستخدام المجهر الضوئي في 200X أو أكبر لضمان عدم وجود علامات المورفولوجية التنشيط حدثت قبل الفحص. على سبيل المثال، عرض العدلات عادة تقريب لشكل غير منتظم مع حدود الخلية وضوحا كما رأينا في الشكل 1B. ومع ذلك، فإن هذه الخلايا تتسطح ضد سطح اللوحة عند تفعيلها وتفقد مورفولوجيا الخلايا المتميزة. لقد ذكرت سابقا التغيرات المورفولوجية من الكريات البيض والصفائح الدموية تفعيلها باستخدام هذا البروتوكول ويجب اتخاذ تدابير إضافية لضمان ظروف معقمة إذا تواجه تفعيل ^8.

وينظر الى خطة مبسطة للبروتوكول في الشكل 2 كجدول الوقت الذي الخطوات الأولية من العزلة الخلية، لوحة XF إعداد، وXF الاختبار هي مفصلة. يتكون عزل كثافة الفصل المتدرج من أنواع الخلايا وتبعتها الفصل المغناطيسي. بالتوازي مع عملية عزل الخلايا، لوحة XF إعداد ضروري لتجنب التأخير في الطلاء خلية أو البدء في الفحص XF. هذا أمر بالغ الأهمية لأن تأخير كبير يمكن أن يؤدي إلى تنشيط الخلايا والطاقة الحيوية المعلمات تتضاءل.

تركيزات الخلية غير كافية بعد العزلة هي مشكلة مشتركة والاستفادة المثلى من كل عملية الطرد المركزي هو ضروري لتجنب فقدان الخلية. وقد أجريت العزلة ناجحة على ما لا يزيد عن 6 مل من الدم ولكن يمكن إجراء تغييرات اعتمادا على تعميم تركيزات نوع من الخلايا المطلوبة. إذا تم إعداد التدرج الكثافة بشكل غير صحيح، قد مراحل خلية متميزة لا تكون مرئية ويمكن أن يحدث فقدان الخلايا (انظر إن الرب فيديو تعليمي لمظاهرة البصرية). الصفائح الدموية غير كافية معزولة عن الحزب الثورى أمر نادر الحدوث ولكن إذا حدث غسل العازلة لا يحتوي PGI ₂ أو إذا كانت العزلة يقام تحت درجة حرارة الغرفة. خطر الصفائح الدموية وغالبا ما يتم منع ctivation إذا الصفائح الدموية هي خلايا الماضي لتكون معزولة، ولكن إذا تبقى الصفائح الدموية في غسل العازلة لفترات طويلة سوف تتأثر الطاقة الحيوية. كانت هناك حالات من السكان الصفائح الدموية الصغيرة التي لم بيليه خلال الطرد المركزي 1،500 x ج والطاقة الحيوية هذه الخلايا لم تتميز على نطاق واسع. انظر الجدول رقم 2 عن دليل أكثر اكتمالا استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

يمكن تحديد ملامح الطاقة البيولوجية من الكريات البيض والصفائح الدموية باستخدام محلل XF، والذي يقيس الوقت الحقيقي O ₂ الاستهلاك في الخلايا noninvasively. هو مطلي كل نوع من الخلايا على لوحة XF24 مع خمسة مكررات كما هو مبين في الشكل 3A. يشير الجدول 1 يتوقع القاعدية والأكسدة انفجار القيم بواسطة نوع من الخلايا خلال الفحص وتركيزات البروتين متوسط ​​نصيب أيضا. هي تكنولوجيات إنتاجية أعلى متوفرة، مثل XF96، والذي يسمح للأربعة مانحين ليتم تقييمها في وقت واحد كما هو مبين في الشكل 3B. بعد الفحص، يتم تصدير البيانات إلى كمبيوتر العمل محطة للتحليل باستخدام البرمجيات المناسبة XF و Microsoft Excel. تم تطبيع القيم OCR لمحتوى البروتين الكلي في الآبار المقابلة والتعبير عن بمول / دقيقة / ملغم بروتين. وذكرت وملامح انفجار الطاقة البيولوجية للأكسدة ممثل عن كل نوع من الخلايا مؤخرا من قبل مجموعتنا ^8. ويمكن حساب مزيد من التحليل للمعلمات الطاقة البيولوجية للفحص (القاعدية، ATP المرتبطة، تسرب بروتون، القصوى، وnonmitochondrial التأكسدي انفجار) للآبار الفردية كما هو موضح سابقا وموضح أدناه ^8.

يتم تأسيس معدل استهلاك الأوكسجين القاعدية (OCR) من خلال القياسات 3 الأولى كما هو موضح في الشكل 4A. أوليغوميسين (0.5 ميكروغرام / مل)، يتم حقن المانع من الميتوكوندريا ATP-سينسيز في المتوسط ​​XF لتقدير OCR جانب لتخليق ATP وتمثيلا تيد كما ATP المرتبطة. ويمكن أن يعزى إلى التعرف الضوئي على الحروف OCR المتبقية ناقص nonmitochondrial إلى تسرب بروتون. ثم يضاف FCCP على uncoupler لتحديد OCR القصوى، تليها antimycin-A، مثبط للتنفس الميتوكوندريا، لتحديد مصادر nonmitochondrial من استهلاك الأوكسجين. القدرة الاحتياطية هو مقياس كمية ATP التي يمكن أن تنتج تحت الطلب حيوية ويمكن أن تحسب على أساس الفرق بين الحد الأقصى لمعدل التنفس والقاعدية. من أجل تحديد قدرة التأكسدي انفجار، phorbol 12-13-ميريستات خلات (سلطة النقد الفلسطينية) يتم حقن ناهض بي كي سي لزيادة النشاط أوكسيديز NADPH، ويمكن قياس الزيادة في معدل استهلاك الأوكسجين بعد التحفيز سلطة النقد الفلسطينية باستخدام محلل XF. الشكل 4B إظهار كيفية حساب معايير مختلفة من وظيفة الميتوكوندريا المؤكسدة انفجار.

1301/51301fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg "/>
الشكل 1. عزل الكريات البيضاء والصفائح الدموية من الدم الجامعة. أ) يتم فصل العينات التي تم جمعها طازجة في البلازما ومكوناتها الخلوية بواسطة الطرد المركزي وتنقيته من خلال Ficoll التدرج الكثافة، والمغناطيسي خلية المنشط الفرز (MACS) بواسطة الإيجابية (الوحيدات والعدلات) أو اختيار السلبية (الخلايا الليمفاوية)، في حين يتم عزل الصفائح التي كتبها عالية السرعة الطرد المركزي من الصفائح الدموية البلازما الغنية. B) الصور من السكان الخلية معزولة معلق مرة واحدة في XF DMEM ومطلي بكثافات الخلية المشار إليه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ghres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg "/>
الشكل 2. إعداد لوحات XF24 للدراسات الطاقة البيولوجية من الكريات البيض والصفيحات الدموية. زمني مفصل للإعداد لوحة XF24 فحص من قبل العزلة الخلية والطلاء والماء خرطوشة وحقن ميناء التحميل.

ومطلي الشكل 3. تخطيط من الكريات البيض والصفيحات الدموية على XF24 وXF96 وحات محلل ألف) الكريات البيضاء (خلايا 125-250K / جيد) والصفائح الدموية (25 × 10 ⁶ خلايا / جيد) من متبرع واحد على لوحة XF24 مقايسة بين الخلفية الضوابط. يتم تحميل 75 ميكرولتر من 10X مخزونات أوليغوميسين (0.5 ميكروغرام / مل)، FCCP (0.6 ميكرومتر)، antimycin-A (10 ميكرومتر)، وسلطة النقد الفلسطينية (100 نانوغرام / مل) المخفف في وسائل الإعلام في XFإلى الموانئ حقن المشار إليه. ب) الكريات البيضاء (خلايا 75-150K / جيد) والصفائح الدموية (10 X10 ⁶ خلايا / جيد) من ما يصل الى أربعة مانحين يمكن مطلي على XF96 في إجمالي حجم 180 ميكرولتر XF-DMEM. 20 ميكرولتر من 10X مخزونات أوليغوميسين (1.0 ميكروغرام / مل)، يتم تحميل FCCP (0.6 ميكرومتر)، antimycin-A (10 ميكرومتر)، وسلطة النقد الفلسطينية (100 نانوغرام / مل) المخفف في XF-DMEM في منافذ حقن المشار إليه.

الشكل 4. تحليل مؤشرات الطاقة البيولوجية. A) تتبع ممثل معدل استهلاك الأوكسجين (OCR) من خلال الميتوكوندريا وانفجار التأكسدي في حيدات. يتم تأسيس القاعدية التعرف الضوئي على الحروف (معدلات 3 الأولى تدل عليه الأرقام في الدوائر). ثم الإضافات متتابعة من أوليغوميسين (O؛ 0.5 ميكروغرام / مل)، FCCP (F؛ 0.6 ميكرومتر) ومكافحةيتم حقن لتحديد الميتوكوندريا والتنفس nonmitochondrial الخلايا nonactivated؛ mycin-A (10 ميكرومتر A). أخيرا، يضاف سلطة النقد الفلسطينية (100 نانوغرام / مل) لقياس الأكسدة انفجار. ب) يتم احتساب تحليل وحدات من وظيفة الميتوكوندريا المؤكسدة انفجار من الاختلافات في معدلات كما هو مبين.

	الأمثل كثافة البذر	ج. القاعدية التعرف الضوئي على الحروف (بمول O 2 / دقيقة)	ج. الأكسدة انفجار OCR (بمول O 2 / دقيقة)	ج. بروتين (ميكروغرام) / جيد
حيدات	250K خلايا / جيد	83.9 (± 13.0)	300.3 (58.8 ±)	19.0 (± 2.4)
العدلات	250K خلايا / جيد	6.1 (± 2.2)	1411.8 (± 233.3)	20.6 (± 2.7)
الخلايا الليمفاوية	250K خلايا / جيد	52.9 (± 7.7)	15 (± 4.1)	13.2 (± 2.1)
الصفائح الدموية	25 × 10 6 خلايا / جيد	199.4 (20.3 ±)	24 (± 2.7)	47.5 (± 3.1)

الجدول 1. ويبين متوسط ​​القاعدية (تصنيف 3) وانفجار التأكسدي (تصنيف 7) OCR لم يتم تصحيحها لOCR nonmitochondrial أو البروتين عن طريق نوع من الخلايا مطلي في كثافة الخلية المشار إليه: المعايير العادية للمقايسة XF24. يظهر متوسط ​​محتوى البروتين في يؤديها كذلك مقايسة العاصمة لوري. تمثل هذه البيانات قيم متوسط6-8 المتبرعين الأصحاء مع أقواس تحتوي ± SEM.

خطوة	مشكلة	السبب المحتمل	حل
1.2	البلازما واضحة	الصفائح الدموية مكعبات خلال الطرد المركزي	تقليل الوقت الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة أو بطيئة إلى 400 x ج
	البلازما حليبي	الدهون الزائدة	تجنب جمع بعد الأكل
1.6	نطاقات الخلايا غير مكتملة شكلت	عفريتإعداد التدرج روبر، كاشف الباردة	تجنب تعطيل التدرج خلال pipetting ل، غرفة استخدام درجة حرارة الكاشف
	كتل في نطاقات الخلية	تخثر الدم قد حدثت	جمع الدم باستخدام مضادات التخثر مثل ACD أو EDTA
1.10	لا بيليه الخلية	راجع الخطوة 1.6	إذا طاف ضبابي انظر أدناه
	طاف ضبابي	تلوث التدرج Ficoll الثقيلة، تلوث الصفائح الدموية	زيادة سرعة الطرد المركزي إلى 900 x ج، ديالعود مع أكثر RPMI
1.16، 1.17	العائد المنخفض من الكريات البيض	تلوث RBC الثقيلة، وليس ما يكفي من الدم كله، تخثر	الأجسام المضادة مزدوجة وRPMI-BSA مجلدات، وجمع المزيد من الدم، إضافة للتخثر
1.19	تراكم الصفائح الدموية	PGI 2 حذفت، والتعرض لوسائل الاعلام الباردة والتخزين لفترات طويلة في البلازما	إضافة PGI 2 إلى الصفائح الدموية غسل العازلة والكواشف استخدام درجة حرارة الغرفة
1.20	انخفاض عدد الصفائح الدموية	خسارة خلال الطرد المركزي الأولية، تراكم الصفائح الدموية	شاهدالخطوات 1.2 و 1.19
2.3	تلوث RBC		تكرار MACS الانفصال

الجدول 2. الكريات البيض والصفيحات العزلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها. يسرد الجدول المشاكل الشائعة التي واجهتها خلال الكريات البيض والصفيحات العزلة خلية من الدم والحلول التي يمكن أن توجه المستخدمين من خلال عملية استكشاف الأخطاء وإصلاحها كله.

Discussion

يمثل هذا البروتوكول تجميع عدة تقنيات تستخدم عادة لعزل خلايا الدم بطريقة مناسبة لتحليل الطاقة الحيوية. تقنيات متجاورة قدمت هي مفيدة لأساليب العزل الأخرى (أي تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية) لقدرتها على عزل أعداد كبيرة من الخلايا في ظروف وسائل الإعلام التي تسيطر عليها مع الحد الأدنى من الضغوط المفروضة على خلايا معزولة. فمن لديه عيب العزلة المطولة حتى مع الحد الأدنى من انقطاع. يخدم هذا البروتوكول كأساس لعزل خلايا الدم الأولية من بالكائن البشري، والتي يمكن استقراء في إعدادات السريرية والبحوث متعدية.

MACS الانفصال هو موثوق بها تقنية عزل الخلية التي توفر إمكانية عزل الخلايا مباشرة من الدم الكامل، ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب كميات أكبر من الأجسام المضادة وليس الأمثل لعزل جميع أنواع الخلايا متميزة أربعة كما هو موضح في هذا الأسلوب. لديه هناك بالتابعين أي دليل لإثبات أن اختيار إيجابية من الكريات البيض التي كتبها نتائج الانفصال MACS في التنشيط باستخدام بروتوكول عزلتنا. الأعمدة MACS تعمل بواسطة امتصاص الخلايا المسمى في مجال مغناطيسي باستخدام الأجسام المضادة مترافق إلى 50 جزيئات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic نانومتر. ثم يتم مزال الخلايا المسمى قبالة العمود. يتم تطبيق الاختيارات الإيجابية والسلبية في هذا البروتوكول لضمان العزلة السريع والنقاء. إذا تم الحصول على عدم كفاية أعداد الخلايا من العزلة أو النقاء هو في السؤال، وأكثر الأجسام المضادة يمكن أن تضاف إلى العينة وفقا لتعليمات البائع والمقطع الثاني من خلال العمود LS قد يؤدي إلى مزيد من النقاء (الجدول 2). وجدت لدينا مختبر نقاء عالية وكفاءة الطلاء باستخدام بروتوكول القائمة من خلال تحليل الايقاف الخلية النهائي عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية ^8.

تحليل تدفق خارج الخلية لديها القدرة على رصد كل استهلاك الأوكسجين وتحمض وسائل الإعلام في الوقت الحقيقي على ذلك من بعد التمديدالأقطاب الكهربائية لها. استهلاك الأكسجين كما لوحظ من قبل استجابة التأكسدي انفجر في وحيدات والعدلات هو NADPH أوكسيديز تعتمد كما هو موضح عن طريق تثبيط مع DPI ^8. شهدنا الوقت فقدان القدرة تعتمد في انفجار التأكسدي مع العزلة لفترات طويلة أو المقايسات XF الموسعة. وقد تم تصميم هذا البروتوكول وضعت للاستخدام على XF24 ولكن هو أيضا متوافقة مع XF96 في حوالي ثلث إلى نصف واحد من الخلية XF24 بذر الكثافة (الشكل 3).

في تصميم هذا البروتوكول، وكان مطلوبا الالتزام البروتوكولات القائمة لكل تقنية لتحقيق الأداء الأمثل مع التعديلات التي أدخلت فقط للسيطرة على الأوضاع وسائل الإعلام لتحليل الطاقة البيولوجية. بعد اتقان التقنيات، مثل بروتوكول يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات والبحوث متعدية لقياس السمية أو فعالية استراتيجيات العلاج، واستكشاف الخصائص الأيضية من المرض، والإنتاج أكسدة بواسطة الوحيدات ونيوتrophils في حالات الالتهابات.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-094-833
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-501
CD61 MicroBeads, human  for platelets	Miltenyi Biotec	130-051-101
CD14 MicroBeads, human  for monocytes	Miltenyi Biotec	130-050-201
CD15 MicroBeads, human  for granulocytes	Miltenyi Biotec	130-046-601
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes	Fisher	02-684-26
RPMI 1640	Gibco	11835-030	with L-glutamine and without phenol red
Prostaglandin I2, sodium salt	Cayman	18220
1.5 ml semi-micro cuvettes	Phenix Research Products	SC-2410
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077	Sigma	10771
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119	Sigma	11191
Bovine Serum Albumin Fraction V	Roche	3117405001	fatty-acid ultra-free
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma	P8139
XF24 FluxPak	Seahorse Biosciences	100850-001
DMEM	Fisher	MT90113PB	w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate
L-Glutamine, 200 mM (100x)	Invitrogen	25030-081
D-Glucose	Sigma	G7528
Sodium Pyruvate	Sigma	P8574
Cell-Tak (cell adhesive)	BD Biosciences	CB-40242
Oligomycin	Sigma	O4876
Antimycin A	Sigma	A8674
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma	C-2920
DC Protein Assay Reagent A	Bio-Rad	500-0113
DC Protein Assay Reagent S	Bio-Rad	500-0015
DC Protein Assay Reagent B	Bio-Rad	500-0114
Seahorse	Seahorse Biosciences
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-090-976 and 24039
Spectrophotometer