인간 백혈구 및 혈소판의 분리 및 평가를위한 프로토콜 : 생물 에너지와 산화 버스트

요약

혈액 백혈구 및 혈소판은 개인의 생체 에너지 전반적인 건강의 마커로 사용하고 있으므로 병적 과정 및 치료의 효과를 모니터링하기위한 잠재력을 가질 수있다. 여기에서 우리는 미토콘드리아의 기능이 세포의 산화 버스트를 분리하고 측정하는 방법을 설명합니다.

초록

미토콘드리아 장애는 죽상 동맥 경화증, 당뇨병, 패 혈성 쇼크, 및 퇴행성 신경 질환이지만 도전 환자의 생체 에너지 함수의 변화를 평가 같은 병적 조건의 개수에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 당뇨병 또는 현재 죽상 동맥 경화증 등의 질환은 임상 적으로 특정 장기의 손상으로 고혈당이나 염증 등의 병리 조직 구성 요소는 백혈구 나 혈소판을 순환에 바이오 에너지 기능을 변경할 수 있지만. 이 개념은 약간의 시간에 대한 인식되었지만 널리 응용 프로그램은 바이오 에너지 분석에 필요한 기본 세포의 많은 수에 의해 제한되어 있습니다. 본 기술 한정 세포 마이크로 플레이트에 활성화하지 않고 부착 될 수 있도록 자성 비드 분리 기술, 세포 접착 기술의 특이성을 조합함으로써 극복되었고, 새로운 기술의 감도가 높은 처리량 MIC 위해 설계roplate respirometry. 이 장비의 예로는 세포 외 유출 분석기입니다. 이러한 장비는 일반적으로 다음 대사에 관련 될 수 자기편 세포에서 이러한 매개 변수의 변화의 속도를 측정하는 산소와 산도에 민감한 프로브를 사용합니다. 여기에 디테일이 인간의 혈액과 이들 세포의 미토콘드리아 생체 에너지 함수의 분석을 활성화하지 않고, 단핵구, 림프구, 호중구와 혈소판의 분리 및 도금 방법을 우리는. 또, 단핵구 및 호중구에서 버스트 산화는 또한 동일한 샘플을 측정 할 수있는 방법을 보여준다. 이 방법은 8-20 ml의 인간의 혈액을 사용하기 때문에 그들은 임상 환경에서 활성 산소 종의 생성 및 생체 에너지를 모니터링하기위한 가능성이있다.

서문

면역 세포 (단핵구, 림프구, 호중구)와 혈액에서 혈소판의 바이오 에너지 상태를 모니터링하는 것은 개인의 전체 바이오 에너지 상태를 평가하기 위해 잠재적으로 유용한 진단 도구로 몇 시간 동안 인정을 받고있다. 암, 심장 혈관 질환과 미토콘드리아 기능 장애 ^1,2에 신경 퇴행성 질환과 같은 질병의 숫자를 탓 문학의 새로운 몸이있다. 미토콘드리아의 기능 장애는 염증성 신호 전달 경로를 촉진 또는 세포 사망을 초래할 세포 사건의 시리즈를 시작할 수 있기 때문에이 임상 적으로 중요하다. 몇몇 연구는 섬유 근육통, 당뇨병, 패 혈성 쇼크, 그리고 알츠하이머 병 ^3-7과 같은 조건에있는 말초 혈액 단핵 세포와 혈소판의 미토콘드리아 기능을 특징으로하고 있습니다. 예를 들어, 최근의 연구는 미토콘드리아의 기능을위한 마커로 혈소판의 생체 에너지를 평가하고 발견 2 형 diabet에서 혈소판IC 환자는 미토콘드리아의 산소 ^소비량을 감소 ^7,8했다. 이러한 연구 결과와 다른 사람, 그들이 전신 순환을 조사하고 로컬 및 글로벌 신진 대사의 변화를 반영 할 수 있기 때문에 단핵구, 림프구, 호중구, 혈소판은 병적 인 조건에서 생체 에너지의 변화로 대리 마커를 제공 할 수 있음을 알 수있다. 이 방법은 예후 또는 진단 적 가치에게 높은 처리량 분석의 방법과 세포의 준비를위한 일관성있는 방법이 필요가 있는지 여부를 결정합니다.

백혈구 및 혈소판에있는 미토콘드리아의 기능을 측정하는 방법은 이전 그대로 세포 ^4.9에서 세포 생물 에너지의 미토콘드리아 또는 평가의 분리를 포함하고 있습니다. 세포 외 유출 (XF) 분석을 사용하여 세포 바이오 에너지 평가의 장점은 세포의 미토콘드리아 기능과 같은 양성자 누출 최대한의 호흡과 같은 내생 기판과 호흡 매개 변수를 설정할 수 있다는 것입니다용량이 결정될 수있다. 우리는 다른 사람은 혈소판에있는 바이오 에너지 프로파일은, 인간의 혈액에서 분리 된 단핵 세포와 림프구가 설립 세포 유형 ⁸ 사이에서 비교 될 수 있다는 것을 보여주기 위해이 기술을 사용하고 있습니다. 또, 양쪽 호중구 및 단핵 세포가 NAPDH 산화 효소가 활성화되는 산화 적 버스트 용량을 소유하고 과산화물을 형성하는 산소를 소비한다. 중요한 것은,이 통로는 선천성 면역의 핵심 구성 요소이며 조직의 염증에 의해 변조된다. 예를 들어, 산화 적 버스트 용량의 변화가 예컨대 다발성 경화증, 관절염, 재발 성 감염 ^10,11 등 다양한자가 면역 질환과 관련되어 있음을 보여왔다. 현재 임상 샘플에서 산화 버스트를 측정 할 수 더 높은 처리량 정량 분석​​이 없습니다. 호중구 및 단핵 세포의 산화 적 버스트 능력을 특성화하는 것도 몇개 patholo위한 중요한 진단 도구로서 작용할 수있다 때문에 이것은 중요GIES.

중요한 기술적 과제는 종래 기술을 사용하여 폴라로그래피 산소 소비량의 측정 및보다 민감한 마이크로 플레이트 형광 기술을 사용하여 세포를 부착 할 때 사용하기위한 필요 최저 감도왔다. 이 실제 비디오에서는, 우리는이 문제에 대한 기술적 솔루션을 설명합니다. 우리는 세부 사항 단핵구, 림프구, 호중구, 혈소판과 단핵구와 인간의 혈액에서 호중구의 산화 버스트의 생체 에너지의 분리, 도금 및 측정을위한 방법.이 방법이 연구자에 대한 생체 에너지와 산화 버스트의 임상 평가에 적합합니다 환자 인구와 신선한 혈액 샘플을 획득 할 수있는 기능에 액세스 할 수 있습니다.

프로토콜

혈액 수집, 분리 및 분석이 원고에 설명 된 모든 프로토콜은 버밍햄에 위치한 앨라배마 대학을 검토하고, 임상 시험 심사위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 세포 격리 (Histopaque 시그마 - 알드리치 프로토콜 번호 1119 및있는 Miltenyi Biotec은 마이크로 비드 긍정적이고 부정적인 선택 의정서에서 수정)

1. 스윙 버킷 로터 (가속도 = 5-6, 알 수없는 브레이크)와 원심 분리기에서 15 분 500 XG에서 (ACD 또는 EDTA 튜브에 수집) 원심 분리기 전혈.
2. 1cm 셀 층 (적혈구 / 버피 코트) 이상으로 유지 될 때까지 전송 피펫과 혈소판 풍부 혈장 (PRP)를 포함하는 상위 레이어를 제거합니다. 나중에 처리 실온에서 PRP를 따로 설정합니다.
3. 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 버피 코트를 전송, 기초 RPMI 24 ml로 희석 또는 적어도 시작 버피 코트의 양을 4 배.
   참고 : RBC 층의 위쪽 절반이 수도 H이것은 비례 RPMI 볼륨 증가 귀착 되더라도 포함될 번가.
4. 세 15 ㎖의 원뿔형 튜브 (3 ㎖ 각각)의 하부층에 대한 1.119 (1119)의 비중과 상부층 및 고밀도 피콜 대해 1.077 (1077)의 비중과 저밀도 피콜를 이용한 밀도 구배를 준비한다. 이 단계를 수행하려면 먼저 각 튜브에 1077을 추가합니다. 5 ㎖ 좁은 피펫을 사용하면 1077 아래에 피펫 팁을 배치하여 튜브의 바닥에 1119을 추가하고 천천히 위쪽 그라데이션 혼합하지 않고 시약을 놓습니다. 밀도 구배 미디어 6 ㎖의 총 3 ㎖ 시점에서 분리의 표시 단계와이 단계에서 존재해야한다.
5. 자동 피펫을 사용하여 부드럽게 그라데이션 레이어를 방해 방지하기 위해 저전력 설정을 사용하여 각 그라데이션 튜브 (단계 1.3에서) 희석 된 혈액의 13 ML을 추가합니다. 전체 볼륨이 단계에서 14 ㎖를해야한다.
6. 실온 (에서 가속에서 30 분 700 XG에 원심 분리기 튜브배급 6, 아니 브레이크).
   참고 :이 단계에서, 세 가지 세포 밴드는 분명 (그림 1A)해야한다. (1077 플라즈마 사이) 최상위 밴드 다형 핵 세포 (백혈구) 및 (1119 이하) 낮은 밴드를 포함 단핵 세포 (다국적 기업) 및 혈소판, 및 (1007 1119 사이의) 중간 대역을 포함 적혈구가 포함되어 있습니다.
7. 다른 세포 대역을 방해하지 않고 멸균 유리 피펫을 사용하여 별도로 MNC 및 PMN를 수집합니다. 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 각 관에서 MNC 인구를 결합합니다. 뿐만 아니라 PMN 인구에 대해이 작업을 반복합니다.
8. 밀도 구배를 희석 각각 MNC 및 PMN 분수를 포함하는 각 튜브에 RPMI 4 볼륨을 추가합니다.
9. 실온에서 10 분 동안 700 XG에 원심 분리기 튜브.
10. MNC를 Resuspend 세포 펠렛 및 0.5 % 초 고순도 지방산이없는 BSA (RPMI-BSA)를 포함하는 1 ㎖의 RPMI에있는 PMN의 세포 펠렛 1.5 ML 튜브를 멸균로 전송. 30의 벤치 탑 picofuge를 사용하여 세포 펠렛초.
11. 뜨는을 취소하고 80 μl의 RPMI-BSA의 각 세포 펠렛을 재현 탁.
12. 단핵 세포의 긍정적 인 선택을 MNC 분획을 포함하는 튜브에 자석 구슬 표시 - antiCD14 항체의 20 μl를 추가합니다. PMN의 세포 분획을 포함하는 관의 경우, 호중구의 긍정적 인 선택을위한 자기 비드 표시 - antiCD15 항체의 20 μl를 추가합니다. 4 º C에서 15 분 동안 각각의 세포 현탁액을 품어
13. 1 ML RPMI-BSA 미디어와 각 세포 현탁액을 세척하고 이전 펠렛 500 μl의 RPMI-BSA의 각 펠렛을 재현 탁.
14. 표지 세포 (MACS) 분리를 정렬 자기 활성화 된 셀의 자기장에서 분리된다. 이전에 세포 현탁액을 추가하는 RPMI-BSA의 3 ㎖의 MACS 분리 및 세척에 열을 배치하여 MACS의 LS 열 (각 세포 현탁액에 대한)을 준비하십시오.
15. 세포 현탁액을 적용한 후, RPMI-BSA 미디어 3 ㎖와 배는 (할 수 있는지 확인 각 열을 씻어 미디어 드레 이즈N 완전히 씻어 사이). 멸균 튜브에 세포 현탁액의 흐름을 통해 열 세척을 수집합니다.
16. 단핵구와 호중구를 분리하기 위하여, 최종 세척 후 자기장에서 열을 제거하고 열 플런저를 사용하여 RPMI-BSA의 5 ㎖의 멸균 튜브에 긍정적으로 선택한 셀을 용출.
17. 림프구는 10 분 동안 300 XG에 1.15 단계에서 다국적 기업의 흐름을 통해 세척 분획 펠릿 분리하십시오. 뜨는을 취소하고 80 μl의 RPMI-BSA에있는 세포 펠렛을 resuspend. CD61 및 CD235a 항체의 20 μl를 추가하고 4 º C에서 15 분 동안 세포 현탁액을 품어 이전과 MACS 분리를 반복하고 림프구를 포함하지만 흐름을 수집합니다.
18. (단계 1.9) 이전과 단핵 세포, 호중구, 림프구의 분수, 원심 분리기 펠렛 및 상층 액을 삭제합니다. 세포 펠렛을 계산에 1 ㎖의 세포 외 유출 미디어 (XF-DMEM)에 재현 탁한다.
    참고 : 전체 혈액의 13 ㎖를 1 ~ 5 × 10 ⁶ 단핵 세포 / ㎖, 5 ~ 20 × 10 ⁶ 림프구와 호중구 / ㎖가 발생한다.
19. 상온에서 1,500 XG에서 8-10 분 동안 혈소판, 원심 분리기의 PRP (단계 1.2)을 분리하십시오. 플라즈마를 제거하고 PBS가 1 ㎍ / ㎖의의 PGI _2, repellet 보충 멸균 5 ㎖로 한 번 세포 펠렛을 씻어 PBS-PGI ₂ 버퍼의 1 ml의 최종 펠렛을 일시 중지합니다.
20. Walkowiak 등에 의해 설명 된대로 혈소판이 분광 광도계에 의해 PBS-PGI ₂ 완충액 일단 혼탁으로 혈소판 수를 결정하는 다음의 식 사용 : [6.23 / (2.016 - 절대 _800)] - 3.09 X 희석 요인 = # × 10 ^8. 혈소판 / ㎖ ^12.

2. 세포의 도금

1. 세포 탁 (세포 접착제)의 제조 : 180 μL에 90 μL의 세포 접착제를 추가 DIH ₂ 0, 0.1 N 나트륨 양의 540 μL탄산 (산도 8.0), 1 N 수산화 나트륨을 사용하여 7.2-7.8로 산도를 조정합니다. 준비된 세포 접착제의 30 μL 잘 각을 코팅하여 XF 판 (24도, V7 마이크로 플레이트)를 준비합니다.
   참고 : 세포 접착제는 각각의 사용에 대한 새로운 준비를해야합니다.
2. 20 ~ 30 분 후 대기음 세포 접착제 37 º C에서 접시를 품어 두 번 PBS로 우물을 세척 (1 ㎖ / 웰).
3. 고립 된 단핵구, 림프구, 호중구와 혈소판에 세포 수를 수행하고 단핵구, 림프구, 호중구 잘 250K 세포 /의 파종 밀도를 허용하는 XF-DMEM을 사용하여 적절한 볼륨으로 가져오고, 25 × 10 ⁶ / 잘 혈소판. 대안 적으로, 산화 적 버스트 응답을 측정하기 위해, 호중구는 125K 세포 / 웰에서 시드 할 수있다. 각각의 세포 현탁액에 대한 최종 시드 볼륨이 200 μL / 잘해야한다.
4. 없이 브레이크를 1 초 동안 200 XG에서 접시를 원심 분리기. 300 X g에서 더 브레이크 다시 접시를 180 ˚ 원심 분리기를 돌립니다.
5. 최종 우물 권을 가지고매실 XF-DMEM와 사전 XF 분석에 30 분 동안 37 º C에서 알을 품다 660 μL에. 참고 : 도금 세포 이전과 분석 후의 현미경 사진은 적절한 도금을 보장하고 세포 분리를 배제하는 데 사용할 수 있습니다.

3. 24 웰 세포 외 유출 분석 플레이트의 제조 (XF24)

1. 수화물 XF는 이전의 분석에 2 시간의 최소 calibrant 솔루션을 조사합니다.
2. 위의 순서대로 카트리지 주입 포트에 0.5 ㎍ / ㎖의 oligomycin의 10 배 주식, 0.6 μM FCCP 및 XF-DMEM에 10 μM antimycin의 재고 솔루션의 부하 75 μl를 준비합니다. 산화 버스트 측정치가 얻어지는 경우에, 100 NG / ㎖ PMA의 10X 재고 주입 antimycin-A 후에 주입 할 수있다.
3. 수화 및로드 된 카트리지를 교정하고 XF 분석을 수행합니다. 분석 및 산소 소비와 산도 모두 변화의 해석에 대한 자세한 방법은 이전의 출판물 ^9,13,14에 설명되어있다 및 D되지 않습니다여기에 자세히 iscussed.
4. 분석은 플레이트로부터 세포의 손실을 방지하고 50 μL RIPA 세포 용해 완충액을 추가하고 정상화 단백질 분석을 수행 한 후 XF 분석 후, XF-DMEM의 마지막 50 μL를 제외한 모든 대기음.

결과

혈액 세포의 생체 에너지를 평가하기 위하여, 전혈 EDTA 또는 ACD vacutainer 수집 튜브에 정맥 천자하여 피험자로부터 수집된다. 프로토콜에 설명 된대로 백혈구 및 혈액 수집 다음 ​​판의 분리는 그림 1A에 시각화된다. 전체 혈액 샘플은 세포의 죽음과 활성화를 방지하기 위해 컬렉션의 8 시간 이내에 처리됩니다. 8 시간보다 더 확장 된 저장 시간은 테스트되지 않았습니다 만, 변경된 생체 에너지 발생과 생리적 조건의 적은 대표 될 수있다. 산성 구연산 덱스 트로 오스 (ACD-8 ㎖), EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) vacutainer 튜브는 격리 된 세포의 생체 에너지 기능에 아무런 효과가 관찰 된 세포와 분리되어 사용되어왔다. 혈전, 얻어진 세포의 수를 감소 피콜 구배 원심 분리 단계 동안 적절한 형성을 방해하고, 원심 분리하여 혈청에서 얻어진 명 혈소판 거의 초래하기 때문에 항응고제가 필요하다. 모든 혈액은 biolog을 나타냅니다iCal의 위험과 적절한 개인 보호 장비는 세포 집단이 고립되거나 세포 용 해물이 생성 된 후에도 전체 절차를 통해 구현해야합니다. 샘플은 기관의 인간 폐기물 표준에 따라서 처리되어야한다.

전혈 버피 코트, 백혈구를 포함 단지 포장 적혈구 상기 백색 층에서 혈소판 풍부 혈장을 분리하기 위해 원심 분리한다. 버피 코트 밀도 구배에 적용 및 말초 혈액 단핵 세포 (단핵구 및 림프구) 및 다형 핵 세포 (과립구)를 얻기 위해 원심 분리한다. 개인 MNC 및 PMN 세포 단계의 RBC 오염이 단계에서 일반적이며 MACS 정화하는 동안 해결해야합니다. 다양한 세포 유형은 다음 순수한 분획을 얻기 위해 자기 항체 배양함으로써 얻어진다. 단핵 세포는 CD14, t의 흐름을 통해와 PBMC 분수의 배양에 의해 수집그 후 적혈구 및 혈소판의 고갈 림프구를 포함 단핵구. 중성 백혈구는 CD15 항체 (도 1a)와 다형 핵 세포층의 배양에 의해 수득된다. 그 후, 혈소판은 혈소판 풍부 혈장의 원심 분리에 의해 펠렛 화 및 다른 혈장 성분을 제거하기 위해 세척 될 수있다. 이러한 선택 후 혈소판은 CD14 + 단핵구, 림프구는 CD15 + 호중구는 생체 에너지 및 산화 적 버스트 분석을위한 세포 접착 매체 코팅 XF 애널라이저 플레이트 카운트 및 도금 될 수있다.

절차의 각 단계는 무균 조건에서 수행되어야하며, 단핵구 및 호중구에서 산화 적 버스트 반응의 조기 활성화를 방지하도록 권장된다. 기초 조건에서 산소가 소비에 조금이 호중구가 상승 OCR 측정과 세포 외 유출 분석을 시작하면 격리하는 동안 무균 조건 이하의 표시가 분명하다점차적으로 증가 시키거나 분석을 통해 감소. 우리는 활성화의 형태 학적 징후 전에 분석에 발생하지 않았는지 확인하기 위해 200 배 이상에 빛을 현미경을 사용하여 세포 이미징의 중요성을 강조한다. 그림 1B에서와 같이 예를 들어, 호중구는 일반적으로 발음 셀 경계와 불규칙한 모양에 둥근를 표시합니다. 그러나, 이들 세포는 활성화 된 때, 판의 표면에 대해 평평하고 그들의 독특한 세포 형태를 잃을 것이다. 우리는 이전에이 프로토콜을 사용하여 활성화 된 백혈구 및 혈소판의 형태 학적 변화를보고하고 활성화 ^8가 발생한 경우 추가 조치는 무균 조건을 보장하기 위해주의해야합니다.

프로토콜의 단순화 된 체계는 세포 분리, XF 접시 준비 및 XF 분석의 주요 단계를 자세히 설명하는 시간을 테이블로 그림 2에서 볼 수있다. 절연은 밀도 구배 세포 유형의 분리 및 이루어져자기 분리에 의해 이어진다. 세포 분리 과정에 병렬, XF 접시 준비 세포 도금 또는 XF 분석을 시작의 지연을 방지 할 필요가있다. 상당한 지연이 세포 활성화 및 감소 생물 에너지 학 매개 변수로 이어질 수 있기 때문에 중요합니다.

차단 후 불충분 세포 농도는 일반적인 문제 및 각 원심 분리 공정의 최적화는 세포 손실을 방지 할 필요가있다. 성공적인 아이솔레이션 피 적은 6 같은 ML에서 수행되었지만 변화는 원하는 세포 유형의 순환 농도에 의존 할 수있다. 밀도 구배가 제대로 준비가되어 있다면, 서로 다른 세포 단계가 표시되지 않을 수도 있습니다 세포의 손실은 (시각적 데모 조브 교육용 비디오를 참조) 발생할 수 있습니다. PRP에서 고립 된 부족 혈소판은 드물지만 격리 실내 온도 이하로 발생하는 경우 세척 버퍼 PGI _2를 포함하거나하지 않는 경우가 발생했습니다. 혈소판의 위험혈소판은 분리 할 수​​있는 마지막 셀 경우 ctivati​​on은 종종 방지, 혈소판은 장기간 세척 버퍼 내에 남아있는 경우, 생체 에너지가 영향을받을 것이다. 1,500 XG에 원심 분리 동안 펠렛하지 않았고 이러한 세포의 생체 에너지가 광범위 특징되지 않은 작은 혈소판 집단의 사례가 있었다. 자세한 문제 해결 가이드는 표 2를 참조하십시오.

백혈구와 혈소판의 생체 에너지 프로파일은 비 침습적 세포에서 실시간 _O이 소비를 측정 XF 분석기를 사용하여 결정될 수있다.도 3a에 도시 된 바와 같이 각각의 세포 유형은 다섯 개의 반복으로 XF24 플레이트 상에 도금된다. 표 1이 나타내는 물론 당 분석, 평균 단백질 농도 동안 세포 유형으로 예상 기초 및 산화 버스트 값. 높은 처리 기술은 허용 XF96로 사용할 수 있습니다도 3b에 도시 된 바와 같이 동시에 평가 될 사 도너. 분석 한 후, 데이터가 적절한 XF 소프트웨어와 Microsoft Excel을 사용하여 분석을위한 워크 스테이션 컴퓨터에 수출되고 있습니다. OCR 값은 해당 우물에 총 단백질 함량에 정상화 및 pmol의 / 분 / MG 단백질로 표현했다. 각 세포 유형의 대표적인 생체 에너지 산화 버스트 프로파일은 최근 단체 ^(8)에 의해보고되었다. 이전에 도시 된 바와 같이 ¹³ 이하 분석법 (기저, ATP-결합, 양자 누출, 최대, nonmitochondrial 및 산화 버스트)의 생체 에너지 파라미터의 추가 분석은 개별 웰에 대해 계산 될 수있다.

도 4a에 도시 된 바와 같이 기저 산소 소모율 (OCR)를 제 3 측정에 의해 확립된다. Oligomycin (0.5 ㎍ / ml)을 미토콘드리아 ATP-합성 효소의 억제제는 OCR은 ATP 합성 및 represen 결합 추정 XF 매체에 주입 테드 ATP 결합으로. 잔류 OCR 마이너스 nonmitochondrial OCR 양성자 누출에 기인 할 수있다. 그런 다음 FCCP uncoupler 산소 소비의 nonmitochondrial 소스를 결정하는 antimycin-A 다음에 최대 OCR, 미토콘드리아 호흡의 억제를 측정하기 위해 추가됩니다. 예비 용량 정력 수요 하에서 제조 될 수 있고, 호흡의 최대 속도와 기부 사이의 차이로서 계산 될 수있는 ATP의 양의 척도이다. 산화 버스트 용량을 결정하기 위해서, 포르 볼 12 - 미리 스테이트 13 - 아세테이트 (PMA) PKC 작용제는 NADPH 옥시 다제 활성을 증가시키기 위해 주입하고, PMA 자극 다음 산소 소비 속도의 증가는 XF 분석기를 사용하여 측정 할 수있다.도 4b보기 미토콘드리아의 기능과 산화 버스트의 다른 매개 변수를 계산하는 방법을 보여줍니다.

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전체 혈액에서 백혈구와 혈소판의 그림 1. 격리. A) 갓 수집 된 시료를 원심 분리하여 혈장과 세포 성분으로 분리 피콜 밀도 구배에 의해 정제, 혈소판이 높은으로 격리하는 동안 자기 활성화 된 셀은 양극 (단핵구와 호중구) 또는 음의 선택 (림프구)에 의해 (MACS)를 정렬하는 한 번 XF DMEM에 재현 탁하고 표시된 세포 밀도에 도금 고립 된 세포 집단의 속도 혈소판이 풍부한 혈장을 원심 분리. B) 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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세포의 분리 및 도금 및 카트리지 수화 및 주입구 로딩 XF24 분석 판의 준비를위한 백혈구 및 혈소판의 바이오 에너지 연구에 대한 XF24 판의 그림 2. 준비. 자세한 타임 라인.

XF24 및 XF96 분석기 판.) 백혈구 (125-250K 세포 / 웰) 단일 기증자 혈소판 (25 X 10 ⁶ 세포 / 웰)에 백혈구 및 혈소판의 그림 3. 레이아웃은 배경 중 XF24의 분석 접시에 도금하는 제어합니다. 75 oligomycin의 10 배 주식 (0.5 ㎍ / ㎖), FCCP (0.6 μM), antimycin-A (10 μM)의 μL 및 XF 미디어에 희석 PMA (100 NG / ML)가로드됩니다표시된 주입 포트. B) 백혈구 (75-150K 세포 / 웰)과 많은 네 기증자로부터도 ⁶ 셀 /은) 180 ㎕의 XF-DMEM의 총 부피에 XF96에서 도금 될 수있다 혈소판 (10 배. oligomycin (1.0 ㎍ / ㎖)의 10 배 주식 20 ㎕는 FCCP (0.6 μM), antimycin-A (10 μM) 및 PMA XF-DMEM에 희석 (100 NG / ML)가 표시된 주입 포트에로드됩니다.

미토콘드리아와 단핵 세포에 산화 적 파열에 의한 산소 소비 속도 (OCR)의 그림 4. 바이오 에너지 인덱스의 분석.) 대표 추적. 기초 OCR은 (동그라미의 숫자로 표시 처음 3 비율)를 설립한다. oligomycin의 다음 순차적으로 추가 (O, 0.5 ㎍ / ㎖), FCCP (F, 0.6 μM) 및 안티마이신-A (A, 10 μM)는 미토콘드리아와 활성화되지 않은 세포의 nonmitochondrial 호흡을 결정하기 위해 주입된다. 마지막으로, PMA (100 NG / ㎖)을 나타낸 바와 같이 미토콘드리아의 기능과 산화 버스트의 모듈 형 분석이 속도의 차이에 의해 계산된다) 산화 버스트입니다. B를 측정하기 위해 추가됩니다.

	최적의 파종 밀도	평균. 기초 OCR (pmol의의 O 2 / 분)	평균. 산화 버스트 OCR (pmol의의 O 2 / 분)	평균. 단백질 (μg) /도
단핵구	250K 세포 /도	83.9 (13.0 ±)	300.3 (± 58.8)	19.0 (± 2.4)
호중구	250K 세포 /도	6.1 (± 2.2)	1411.8 (233.3 ±)	20.6 (± 2.7)
림프구	250K 세포 /도	52.9 (± 7.7)	15 (± 4.1)	13.2 (± 2.1)
혈소판	25 X 10 6 세포 /도	199.4 (20.3 ±)	24 (2.7 ±)	47.5 (± 3.1)

표 1. XF24 분석에 대한 일반 매개 변수 : 평균 기저 (평가 3) 및 산화 버스트 (요금 7) OCR이 nonmitochondrial OCR 또는 단백질에 수정되지는 지정된 셀 밀도에서 도금 세포 유형으로 표시됩니다. DC 로리 분석에 의해 수행으로 잘 당 평균 단백질 함량이 표시됩니다. 이러한 데이터의 평균값을 나타내는± SEM을 포함하는 괄호와 6-8 건강한 기증자.

단계	문제	가능한 이유	해결
1.2	분명 플라즈마	원심 분리 동안 펠렛 혈소판	10 분 400 XG에 저속 원심 분리 시간을 단축
	우유 플라즈마	여분의 지질	식후 컬렉션을 피하기
1.6	불완전한 세포의 밴드를 형성	꼬마 도깨비로퍼 그라데이션 준비, 차가운 시약	피펫, 사용 실내 온도 시약 동안 그라데이션을 방해하지 않도록
	셀 대역 수풀	혈액의 응고가 발생했을 수 있습니다	같은 ACD 또는 EDTA 등의 항응고제를 사용하여 혈액을 수집
1.10	어떤 세포 펠렛 없습니다	단계 1.6 참조	상층 액을 헷갈리는은 아래를 참조하는 경우
	흐릿한 상층	무거운 피콜 구배 오염, 혈소판 오염	900 XG, 디에 원심 분리 속도를 증가더 RPMI와 류트
1.16, 1.17	백혈구의 낮은 수율	무거운 RBC 오염, 부족 전체 혈액 응고	두 항체 및 RPMI-BSA 볼륨, 항응고제를 추가, 더 많은 혈액을 수집
1.19	혈소판 응집	PGI 2는 생략, 차가운 미디어, 플라즈마의 장기 보관에 노출	혈소판 세척 버퍼를 사용 실내 온도 시약 PGI 2 추가
1.20	낮은 혈소판	차 원심 분리, 혈소판 응집 동안 손실	참조1.2 및 1.19 단계
2.3	RBC 오염		MACS 분리를 반복

표 2. 백혈구 및 혈소판 분리 문제 해결. 표는 전체 혈액과 문제 해결 과정을 통해 사용자를 안내 할 수 있습니다 솔루션에서 백혈구 및 혈소판 세포 격리 중 발생하는 일반적인 문제를 나열합니다.

토론

이 프로토콜은 생체 에너지 분석에 적합한 방식으로 혈액 세포 격리위한 여러 일반적 활용 기술의 컴파일을 나타낸다. 제시된 기법은 인접한 고립 셀에 배치 최소 응력으로 제어 된 미디어 조건에서 세포를 다수 분리 할 수있는 능력에 대한 다른 분리 방법 (즉, FACS 분석)에 유리하다. 심지어 최소한의 중단과 긴 아이솔레이션의 단점이있다. 이 프로토콜은 임상 연구 및 병진으로 외삽 될 수 피험자로부터 일차 혈액 세포의 분리를위한 기초로서 역할을한다.

MACS 분리는 전혈에서 직접 세포를 분리 할 가능성을 제공하는 안정적인 세포 격리 기술하고 있지만,이 방법은 항체의 더 많은 양을 필요로하며,이 방법에서 설명한 바와 같이 네 개의 별개의 세포 유형의 분리를위한 최적이 아니다. B가있다EEN 증거는 정품 인증 MACS 분리 결과로 백혈구의 양의 선택은 우리의 격리 프로토콜을 사용하는 것을 보여줍니다 없습니다. MACS 컬럼은 50 nm의 초상 자성 입자에 접합 된 항체를 사용하여 자기장에서 표지화 된 세포의 격리에 의해 기능한다. 표지화 된 세포는 다음 칼럼 오프 용출된다. 긍정적이고 부정적인 선택은 신속한 분리 및 순도를 보장하기 위해이 프로토콜에 구현된다. 불충분 한 세포 수는 격리에서 얻은 순도는 질문에 있다면, 더 많은 항체는 큰 순도 (표 2)가 발생할 수 있습니다 LS의 칼럼을 통해 공급 업체의 지시 및 제 2 통로에 따라 샘플을 추가 할 수 있습니다. 우리 연구소는 FACS 분석 ^(8)에 의해 최종 세포 현탁액을 분석하여 기존의 프로토콜을 사용하여 고순도 도금 효율을 발견했다.

세포 외 유출 분석기 OT의 위에 실시간으로 산소 소비 및 미디어 산성화를 모두 모니터링 할 수있는 능력을 가지고그녀의 전극. DPI ⁸ 억제에 의해 도시 된 바와 같이 모노 사이트 및 호중구에서 산화 반응에 의해 버스트 관찰 산소 소비는 NADPH 산화 효소 의존적이다. 우리는 장기와 분리되어 또는 확장 XF의 분석과 산화 버스트 용량의 시간 의존 손실을 볼 수있다. 이 프로토콜 설계 및 개발 XF24에서 사용할뿐만 아니라, 약 세 번째 밀도를 뿌리기 XF24 세포의 절반 (그림 3)에 XF96와 호환되었다.

이 프로토콜의 설계에서 각 기술에 대한 기존의 프로토콜 준수는 전적으로 바이오 에너지 분석을위한 미디어의 조건을 제어에 대한 수정과 최적의 성능을 위해 필요했다. 기술을 습득 한 후, 이러한 프로토콜은 치료 전략의 독성 효과를 측정 또는 질환의 대사 특성을 탐구하고, 단핵구 및 neut 의해 산화제 생산 병진 및 연구 다양한 어플리케이션에서 사용될 수있다염증 상태에있는 rophils.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-094-833
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-501
CD61 MicroBeads, human  for platelets	Miltenyi Biotec	130-051-101
CD14 MicroBeads, human  for monocytes	Miltenyi Biotec	130-050-201
CD15 MicroBeads, human  for granulocytes	Miltenyi Biotec	130-046-601
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes	Fisher	02-684-26
RPMI 1640	Gibco	11835-030	with L-glutamine and without phenol red
Prostaglandin I2, sodium salt	Cayman	18220
1.5 ml semi-micro cuvettes	Phenix Research Products	SC-2410
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077	Sigma	10771
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119	Sigma	11191
Bovine Serum Albumin Fraction V	Roche	3117405001	fatty-acid ultra-free
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma	P8139
XF24 FluxPak	Seahorse Biosciences	100850-001
DMEM	Fisher	MT90113PB	w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate
L-Glutamine, 200 mM (100x)	Invitrogen	25030-081
D-Glucose	Sigma	G7528
Sodium Pyruvate	Sigma	P8574
Cell-Tak (cell adhesive)	BD Biosciences	CB-40242
Oligomycin	Sigma	O4876
Antimycin A	Sigma	A8674
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma	C-2920
DC Protein Assay Reagent A	Bio-Rad	500-0113
DC Protein Assay Reagent S	Bio-Rad	500-0015
DC Protein Assay Reagent B	Bio-Rad	500-0114
Seahorse	Seahorse Biosciences
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-090-976 and 24039
Spectrophotometer