İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Özet

Kan lökositleri ve trombosit bireyin genel bioenergetic sağlığının bir belirteci olarak kullanılır ve bu nedenle patolojik süreçlerin ve tedavilerin etkisini izlemek için bir potansiyele sahip olabilir. Burada mitokondriyal fonksiyonu ve bu hücrelerde oksidatif patlama izole etmek ve ölçmek için bir yöntem tarif eder.

Özet

Mitokondriyal işlev bozukluğu örneğin ateroskleroz, diyabet, septik şok, ve nörodejeneratif hastalıklar ama zordur hastalarda bioenergetic fonksiyonunda değişikliklere değerlendirilmesi gibi patolojik durumların bir çok önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. , Diyabet ya da mevcut ateroskleroz gibi hastalıkların klinik spesifik organ yetmezliği, hiperglisemi ya da iltihap gibi patoloji sistemik bileşenleri, lökositler veya trombosit dolaşan bioenergetic işlevini değiştirebilir olsa da. Bu kavram, bir süre için kabul edilmiştir ancak yaygın uygulama bioenergetic analiz için gerekli birincil hücrelerin büyük sayısına göre kısıtlanmıştır. Bu teknik bir kısıtlama hücrelerin mikro aktivasyon olmadan bağlı izin manyetik boncuk ayırma teknikleriyle, hücre yapışma teknikleri özgünlüğünü birleştirerek üstesinden gelmek olmuştur ve yeni teknolojilerin hassasiyeti yüksek kapasiteli mikrofon için tasarlanmışroplate Respirometrik. Bu cihazın bir örneği dışı akı analizörü. Bu alet, tipik olarak daha sonra metabolizması ile ilgili olabilir yapışık hücrelerindeki bu parametreleri değişim oranlarını ölçmek için oksijen ve pH duyarlı probları kullanır. Burada ayrıntılı insan kanı ve bu hücrelerde mitokondriyal bioenergetic işlevinin analizi, aktivasyon olmaksızın, monositler, lemfositler, nötrofiller ve trombositlerin izolasyonu ve kaplama için YÖNTEM. Buna ek olarak, monositler ve nötrofillerde oksidatif patlama aynı örneklerde ölçülebilir gösterilmektedir. Bu yöntemler, sadece 8-20 ml insan kanı kullandıkları bir klinik ortamda reaktif oksijen türlerinin üretimi ve biyo enerjisini izleme için potansiyele sahiptir.

Giriş

Bağışıklık hücreleri (monositler, lenfositler, nötrofiller) ve kandan trombositler bioenergetic sağlık izleme bireyin genel bioenergetic sağlığını değerlendirmek için potansiyel olarak yararlı bir tanı aracı olarak bir süre için kabul edilmiştir. Kanser, kardiyovasküler hastalıklar ve mitokondriyal disfonksiyon ^{1,2 'nörodejeneratif} hastalıklar gibi bir dizi hastalıkların atfederek edebiyat yükselen bir vücudu var. Mitokondriyal işlev bozukluğu pro-inflamatuar sinyal yolları teşvik etmek ya da hücre ölümüne yol açan hücresel olaylar bir dizi başlatabilir, bu durum klinik açıdan önemlidir. Pek çok çalışma, fibromiyalji, diyabet, septik şok, ve Alzheimer hastalığı gibi durumlarda ^3-7 periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ve trombositler mitokondriyal fonksiyonu tanımlanmıştır. Örneğin, yeni bir çalışma, mitokondriyal işlevi için bir işaretleyici olarak, trombositler 'in biyo enerjisini değerlendirildi ve bulunan Tip 2 Diabet gelen trombositleric hastalar mitokondriyal oksijen tüketimi ^7,8 azalmıştı. Bu bulgular ve diğerleri, onlar sistemik dolaşıma anket, yerel ve global metabolik değişiklikleri yansıtıyor olabilir beri monositler, lenfositler, nötrofiller, trombositler ve patolojik koşullar altında Bioenerji değişikliklerin vekil belirteçleri hizmet açıktır. Bu yaklaşım prognostik veya tanısal değeri yüksek bir verimlilik analizi yöntemi ve hücre hazırlanması için tutarlı bir yöntem gereklidir olup olmadığını belirlemek için.

Lökosit ve platelet mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için yöntemler daha önceleri sağlam hücrelerde ^4,9 hücresel biyoenerjitiklerin mitokondri veya değerlendirme izolasyonunu kapsamıştır. Bir hücre dışı akı (XF) analizör kullanılarak cep bioenergetic değerlendirme avantajı hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu, proton kaçak ve maksimal solunum gibi endojen substratların ve solunum parametreleri ile kurulmuş olmasıdırkapasitesi tespit edilebilir. Biz ve diğerleri trombositlerde bioenergetic profiller, insan kanından izole edilen monositler ve lenfositler kurulmuş ve hücre tipleri ⁸ arasında karşılaştırılabilir olduğunu göstermek için bu teknolojiyi kullanmıştır. Buna ek olarak, hem nötrofiller ve monositler NADPH oksidazlar aktive edildiği bir oksidatif patlama kapasitesine sahip ve süperoksit oluşturulması için oksijen tüketir. Önemlisi, bu yolun doğal bağışıklığın önemli bir bileşenidir ve sistemik inflamasyon ile modüle edilir. Örneğin, oksidatif patlama kapasitesinde değişiklikler, multipl skleroz, artrit, ve tekrarlayan enfeksiyonlar ^10,11 gibi çeşitli oto-bağışıklık hastalıkları ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Şu anda klinik örneklerde oksidatif patlama ölçmek için uygun herhangi bir yüksek verimli deneyler, nicel vardır. Nötrofil ve monositlerin oksidatif patlama kapasiteleri karakterize ayrıca çeşitli patolojiler için önemli bir teşhis aracı olarak hizmet edebilir çünkü bu önemlidirara yüzleri.

Anahtar teknik zorluklar, geleneksel polarografik teknikler kullanılarak oksijen tüketiminin ölçülmesi ve daha duyarlı mikroplâka florometrik teknikleri kullanırken bağlı hücreleri kullanmak için ihtiyacı için düşük duyarlılık olmuştur. Bu pratik video, biz bu sorunlara teknik çözüm açıklar. Bu detay monositler, lenfositler, nötrofiller ve monositler ve trombositler ve İnsan kanından nötrofil oksidatif patlama biyoenerjitiklerin izolasyonu, kaplama ve ölçüm için yöntemler. Bu yöntem sahip araştırmacılara biyoenerjitiklerin ve oksidatif patlama, klinik değerlendirme için uygundur bir hasta popülasyonu ve taze kan örnekleri elde etmek için yeteneği erişim.

Protokol

Kan toplama, izolasyonu ve analizi için bu yazıda anlatılan tüm protokoller Birmingham Alabama Üniversitesi'nde gözden ve Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1.. Hücre İzolasyon (Histopaque Sigma-Aldrich No'lu Protokol'ün 1119 ve Mıltenyı Bıotec microbead Pozitif ve Negatif Seçim Protokolleri Modifiye)

1. Bir sallanan kepçeli rotor (ivme = 5-6, ve herhangi bir fren) olan bir santrifüj içinde 15 dakika boyunca 500 x g'de (ACD ya da EDTA tüplerinde toplanmıştır) Santrifüj tam kan.
2. 1 cm hücre tabakası (eritrosit / beyaz tabaka) üzerinde kalır kadar bir transfer pipet ile trombosit açısından zengin plazma (PRP) içeren üst katmanı kaldırın. Daha sonraki işlem için oda sıcaklığında PRP koyun.
3. Bir steril 50 ml konik tüp ince beyaz tabakayı transfer, bazal RPMI ile 24 ml'ye kadar seyreltilmesi ya da en azından başlangıç ​​ince beyaz tabaka hacmi 4x.
   Not: RBC tabakanın üst yarısı olabilir hBu orantılı olarak RPMI hacminin artırılması ile sonuçlanır, ancak dahil edilmesi için ave.
4. Üç 15 ml konik boruların (3 ml her biri) içinde, alt tabaka için 1.119 (1119) arasında bir özgül ağırlığa sahip üst tabaka ve yüksek yoğunluklu bir Ficoll için 1,077 (1077) özel bir ağırlığa sahip, düşük yoğunluklu Ficoll kullanılarak yoğunluk gradyan hazırlayın. Bu adımı gerçekleştirmek için, önce her tüpe 1077 ekleyin. 5 ml'lik bir dar bir pipet kullanarak 1077 altında pipet yerleştirerek tüpün dibine 1119 ekleyin ve yavaş yavaş üst gradyanı ile karıştırılmadan reaktif serbest bırakın. Yoğunluk gradyan medya 6 ml'lik bir toplam 3 mi işaretine ayırma görünür bir faz ile, bu aşamada mevcut olması gerekmektedir.
5. Otomatik bir pipet kullanarak, yavaşça gradyan katmanları rahatsız önlemek için düşük güç ayarını kullanarak her bir gradyan tüpüne (adım 1.3) ile seyreltilmiş kan 8 ml ekleyin. Toplam hacim, bu aşamada 14 ml olmalıdır.
6. Oda sıcaklığında (hızlanma 30 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj tüplerirasyon 6, hiçbir fren).
   Not: Bu aşamada, üç farklı hücre bantları açık (Şekil 1A) olmalıdır. (1077 ve plazma arasında) üst bantları polimorfonükleer hücreler (PMN) ve (1119 aşağıda) alt bant içeren mononükleer hücreler (ÇUŞ) ve trombositler ve (1007 ve 1119 arasında) orta bandını içeren alyuvarlar içerir.
7. Diğer hücre grupları bozmadan steril cam pipetler kullanılarak ayrı ayrı MNC'yi ve PMN toplayın. Bir steril 50 ml konik tüp içine her tüpten MNC nüfus birleştirin. De PMN nüfus için bu işlemi tekrarlayın.
8. Yoğunluk gradyanı seyreltilmesi için sırasıyla MNC ve PMN içeren fraksiyonlar her tüpe RPMI 4 sayılarını.
9. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 700 x g santrifüj tüpleri.
10. Süspanse MNC Hücre topağı ve% 0.5 ultra-saf yağ asidi içermeyen BSA (RPMI-BSA) ihtiva eden 1 ml RPMI PMN Hücre topağı ve 1.5 ml tüpler, steril aktarın. 30 için bir tezgah üstü picofuge kullanarak hücrelerin Peletsn.
11. Süpernatantı atın ve 80 ul RPMI-BSA her hücre pelletini.
12. Monositlerin pozitif seçim için MNC fraksiyonu içeren tüp manyetik boncuk etiketli-antiCD14 antikor 20 ul ekle. PMN hücre fraksiyonu ihtiva eden tüp için, nötrofillerin pozitif seçim için manyetik tane etiketlenmiş-antiCD15 antikor 20 ul ekle. 4 ° C'de 15 dakika boyunca her bir hücre süspansiyonu inkübe
13. 1 ml RPMI-BSA ortamı ile her bir hücre süspansiyonu yıkayın ve daha önce olduğu gibi pelet ve 500 ul RPMI-BSA içinde her pelletini.
14. Etiketlenmiş hücreler (MACS) ayırıcının ayırma manyetik aktif hücrenin manyetik alan içinde ayrılır. Önce, hücre süspansiyonunun eklenmesinden RPMI-BSA 3 ml MACS ayırıcı ve çamaşır üzerinde sütun yerleştirerek MACS LS sütun (her bir hücre süspansiyonu için bir tane) hazırlayın.
15. Hücre süspansiyonları uygulandıktan sonra, RPMI-BSA medya 3 ml 3x (izin emin olun her sütun yıkayın medya drain tamamen yıkar arasında). Steril tüp içine hücre süspansiyonu akış ve sütun yıkamaları toplayın.
16. Monositleri ve nötrofilleri izole etmek için, son yıkamadan sonra manyetik alandan sütun kaldırmak ve sütun pistonu ile RPMI-BSA, 5 ml steril tüp içine pozitif olarak seçilen hücrelerin elute.
17. Lenfositler, 10 dakika boyunca 300 x g'de ikinci aşama 1.15 uluslu akış-through-yıkama fraksiyonu pelet izole etmek. Süpernatant atılır ve 80 ul RPMI-BSA içinde hücre pelletini. CD61 ve CD235a antikor 20 ul ilave edin ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu inkübe Daha önce olduğu gibi MACS ayrılması tekrarlayın ve lenfositleri içeren rağmen akışını toplamak.
18. (Adım 1.9) daha önce olduğu gibi, monositler, nötrofiller, lenfositler ve fraksiyonlar, santrifüj pelet ve silmek için, üst fazlar. Hücre peletleri sayımı için 1 ml hücre dışı ortam akış (XF-DMEM) içinde yeniden süspansiyon haline olmalıdır.
    Not: Bütün kan 8 ml 1-5 x 10 ⁶ monosit / ml ve 5.20 x 10 ⁶ lenfositler ve nötrofiller / ml sonuç verir.
19. Oda sıcaklığında 1500 x g'de 8-10 dakika boyunca trombositlerin, santrifüj PRP (adım 1.2) izole etmek için. Plazma çıkarın ve PBS 1 mg / ml PGI _2, repellet ile takviye edilmiş, 5 ml steril ile bir kez hücre pelletini yıkama ve PBS-PGI ₂ tampon 1 ml nihai pelet askıya.
20. Walkowiak ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi trombosit spektrofotometre ile PBS-PGI ₂ tampon maddesi içinde süspansiyon haline kez bulanıklık derecesi trombosit sayısını belirlemek için, aşağıdaki denklem kullanılarak: [6.23 / (2.016 - ₈₀₀ Abs)] - 3.09 x seyreltme faktörü = # ⁸ x 10. trombosit / ml ^12.

2. Hücre Kaplama

1. Hücre-Tak (hücre yapışkan) hazırlanması: 180 ul, 90 ul hücre yapıştırıcı madde ekleyin diH ₂ 0, 0.1 N sodyum bi 540 ulkarbonat (pH 8.0) ve 1 N NaOH kullanılarak pH 7,2-7,8 ​​ayarlayın. Hazırlanan hücre yapıştırıcı 30 ul her bir oyuğa kaplanarak XF levhaları (24-çukurlu, V7 mikro) hazırlayın.
   Not: Hücre yapıştırıcı Her kullanım için taze hazırlanmalıdır.
2. 20-30 dakika sonra aspire hücre yapıştırıcı boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve iki kez PBS ile yıkayın kuyu (1 ml / çukur).
3. Izole edilmiş monositler, lenfositler, nötrofiller ve plateletler üzerinde bir hücre sayımı gerçekleştirmek ve monositler, lenfositler ve nötrofiller için de 250k hücre / bir tohumlama yoğunluğuna izin vermek için XF-DMEM kullanılarak uygun hacme getirmek ve 25 x 10 ⁶ / oyuk plateletler için. Seçenek olarak ise, oksidatif patlama yanıtı ölçmek için, nötrofiller 125k hücre / oyuk olacak şekilde tohumlandı edilebilir. Her bir hücre süspansiyonu için son tohumlama hacmi 200 ul / oyuk olmalıdır.
4. Hiçbir frenli 1 sn boyunca 200 xg'de plaka santrifüj. 300 x g hiçbir fren ile tekrar plakasını 180 ˚ ve santrifüj döndürün.
5. Nihai iyi vol getirinume XF-DMEM ile ve önceki XF tahlil için 30 dakika boyunca 37 º C'de inkübe 660 ul. Not: kaplı hücreler önce ve sonra tahlil fotomikrografları yeterli bir kaplama sağlamak ve hücre ayrışması ekarte etmek için kullanılabilir.

3. Bir 24-yuvalı hücre dışı Flux Assay Plate hazırlanması (XF24)

1. Hidrat XF, deneyden önce 2 saat arasında, en az bir kalibrant çözeltisi ile probes.
2. Yukarıdaki sırayla kartuş enjeksiyon portu içine 0.5 ug / ml oligomycin 10x hisse senetleri, 0,6 iM FCCP ve XF-DMEM'de 10 uM antimycin A ve stok çözümleri yükü 75 ul hazırlayın. Oksidatif yarılma ölçümleri elde edilecekse, 100 ng / ml PMA 10x stoklar enjeksiyon antimycin-A sonra enjekte edilebilir.
3. Sulu ve yüklü kartuşu kalibre ve XF analizini gerçekleştirmek. Analiz ve oksijen tüketimi ve hem de pH değişiklikleri yorumlanması için ayrıntılı yöntemler, ^9,13,14 önceki yayınlarda tarif edilmiş ve d değildirburada ayrıntılı iscussed.
4. Tahlil plaka hücrelerin kaybını önlemek ve 50 ul RIPA hücre liziz tamponu ekleyin ve normalizasyonu için bir protein deneyi gerçekleştirmek için sonra XF deneyinden sonra, XF-DMEM son 50 ul ama aspire.

Sonuçlar

Kan hücrelerinin biyo enerjisini değerlendirmek için, tam kan, EDTA vacutainer ACD ya da bir toplama tüpü içinde damar delme ile insan deneklerden toplanır. Protokol ayrıntılı olarak lökositlerin, kan toplama aşağıdaki plakalarının izolasyon işlemi Şekil 1A görüntülenmiştir. Tüm kan numuneleri hücre ölümü ve aktivasyonunu önlemek için toplama 8 saat içinde işlenir. 8 saat daha fazla genişletilmiş depolama kez test edilmiş değil ama değişmiş Bioenerji yol ve fizyolojik koşulların daha az temsilcisi olabilir. Asit sitrat dekstroz (ACD-8 mi) ve EDTA vacutainer tüpler izole edilmiş hücrelerin bioenergetic fonksiyonu üzerinde gözlenen etkisi ile hücre izolasyon için kullanılmıştır. Pıhtılaşması, elde edilen hücre sayısını azaltmak Ficoll gradyan santrifüj sırasında doğru faz formasyonu engelleyebilir ve santrifüj serum elde edilen herhangi bir trombositler az neden olarak antikoagülanlar gereklidir. Tüm kan biyolojik bir temsil edernik tehlike ve uygun kişisel koruyucu ekipmanlar hücre popülasyonları izole edilir veya hücre lizatlan oluşturulur sonra bile tüm prosedür boyunca uygulanması gerekmektedir. Örnekleri kurumun insan atık bertaraf standartlarına uygun olarak bertaraf edilmelidir.

Tam kan buffy coat, lökositleri içeren sadece dolu kırmızı kan hücreleri üzerindeki beyaz tabakadan platelet bakımından zengin plazma ayırmak için santrifüj edilir. İnce beyaz tabaka yoğunluk dereceleri uygulanabilir ve periferal kan mononükleer hücreleri (monositler ve lenfositler) ve polimorfonükleer hücreleri (granülositler) elde etmek için santrifüjlenir. Bireysel MNC ve PMN hücre fazların RBC kirlenmesi bu aşamada ortak ve MACS saflaştırılması sırasında çözülmesi gerekir. Çeşitli hücre tipleri daha sonra saf elde etmek üzere, manyetik antikorlar ile kuluçkaya yatırılması ile elde edilir. Monositler CD14, t ileri akış ile PBMC fraksiyonu inkübasyon ile toplanıro da eritrosit ve trombosit tükenmiş lenfositler, monositler içerir. Nötrofiller CD15 antikoru (Şekil 1A) ile polimorf hücre tabakasının kuluçkaya yatırılması ile elde edilir. Bundan sonra, trombositler trombosit açısından zengin plazma santrifüj ile topaklanır ve diğer plazma bileşenleri çıkarmak için yıkanabilir. Bu seçimler sonra trombositler, CD14 +, monositler, lemfositler, CD15 + nötrofil oksidatif patlama biyoenerjitiklerin ve analizi için bir hücre yapışma orta kaplı XF analiz plaka üzerinde sayılır ve kaplama olabilir.

Prosedürün her bir aşaması, steril koşullarda gerçekleştirilmelidir ve monositler ve nötrofillerde oksidatif patlama tepkisinin vaktinden önce aktivasyonunun engellenmesi için teşvik edilmektedir. Bazal koşullar altında herhangi bir oksijen tüketimine az olması, nötrofiller,, yüksek OCR ölçümleri ile hücre dışı akı tahlili başlar izolasyonu sırasında, steril koşullar altında bir göstergesi belirgin olduğunuyavaş yavaş artırmak veya tahlil boyunca düşüş. Biz bir aktivasyon morfolojik işaretleri önce tahlil meydana gelmiş olmasını sağlamak için 200X veya daha fazla bir ışık mikroskobu kullanarak hücrelerin görüntülenmesi önemini vurgulamak. Şekil 1B 'de görüldüğü gibi, örneğin, nötrofiller, normal belirgin hücre sınırları ile düzensiz bir şekle yuvarlak gösterir. Bununla birlikte, bu hücreler aktive edildiğinde, plakanın yüzeyine karşı düzleştirmek ve ayrı hücre morfolojisi kaybeder. Biz daha önce bu protokolü kullanarak aktive lökositlerin ve trombositlerin morfolojik değişiklikler rapor ve aktivasyonunu ⁸ karşılaşmadan ise ek önlemler steril koşulları sağlamak için alınmalıdır.

Protokolün basitleştirilmiş bir şeması, hücre izolasyonu, XF plaka hazırlanması ve XF tahlilin temel adımlar ayrıntılı olduğu bir zaman çizelgesi, Şekil 2'de görülmektedir. İzolasyon yoğunluk gradyan hücre tiplerinin ayrılması ve oluşmaktadırmanyetik ayırma ile takip edilir. Hücre izolasyon sürecine paralel, XF plaka hazırlama hücre kaplama veya XF tahlil başlayan gecikmeleri önlemek için gereklidir. Önemli gecikmeler hücre aktivasyonu ve azalmış biyoenerjetiğin parametreleri yol açabilir, çünkü bu önemlidir.

Izolasyondan sonra yetersiz hücre konsantrasyonları ortak bir sorun ve her santrifüj işleminin optimizasyonu hücre kaybını önlemek için gerekli bulunmaktadır. Başarılı izolasyon kan az 6 ml kadar gerçekleştirilen ancak değişiklikler arzu edilen hücre tipi dolaşım konsantrasyonları bağlı olarak yapılabilir. Yoğunluk gradyan yanlış hazırlanmış ise, farklı hücre fazlar görünür olmayabilir ve hücrelerin kaybı (bir görsel gösteri için vallahi öğretim video) oluşabilir. PRP izole yetersiz trombosit nadirdir fakat izolasyon oda sıcaklığının altında yer alırsa yıkama tamponu PGI ₂ içeren veya yoksa oluştu. Platelet a riskitrombosit izole edilmesi son hücre olup olmadığını ctivation genellikle engellenmektedir; trombosit uzun bir süre için yıkama tamponu içinde kalır, ancak, biyoenerji etkilenecektir. 1.500 xg santrifüj sırasında pelet vermedi ve bu hücrelerin biyoenerji yoğun karakterize edilmemiştir küçük trombosit nüfus örneği olmuştur. Daha eksiksiz bir sorun giderme kılavuzu için Tablo 2'ye bakınız.

Lökositlerin ve trombositlerin bioenergetic profilleri, invaziv olmayan hücrelerde gerçek zamanlı O ₂ tüketimini ölçer XF analiz kullanılarak belirlenebilir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, her bir hücre tipi beş kez tekrarlanmış olan XF24 plaka üzerine yerleştirilir. Tablo 1 göstermektedir Oyuk başına deneyde ve ortalama protein konsantrasyonları sırasında hücre tipi tarafından beklenen bazal ve oksidatif patlama değerleri. Daha yüksek verim sağlayan teknolojiler, XF96 olarak mevcutturŞekil 3B'de gösterildiği gibi, eş zamanlı olarak değerlendirilmelidir dört donör. Deneyinden sonra, veriler uygun XF yazılımı ve Microsoft excel kullanarak analizi için bir çalışma istasyonu bilgisayara ihraç edilmektedir. OCR değerleri tekabül eden gözleri içindeki toplam protein muhtevasına göre normalize ve pmol / dak / mg protein olarak ifade edildi. Her hücre tipinin temsilcisi bioenergetic-oksidatif patlama profilleri son zamanlarda bizim grupta ⁸ tarafından bildirilmiştir. Daha önce gösterildiği ve aşağıda tarif edildiği ^{gibi, 8} deneyi (bazal, ATP-bağlı, proton sızıntı, maksimal, nonmitochondrial ve oksidatif patlama) arasında bioenergetic parametrelerinin daha fazla analizi, her bir gözeneğinden için hesaplanabilir.

Şekil 4A'da gösterildiği gibi, taban oksijen tüketim hızı (OCR) ilk 3 ölçümleri ile kurulur. Oligomycin (0.5 ug / ml), mitokondrial ATP-sentaz inhibitörü OCR ATP sentezi ve temsilcisi bağlanmış tahmin etmek için XF ortam enjekte edilir ted ATP-bağlı olarak. Kalan OCR eksi nonmitochondrial OCR proton sızıntısı isnat edilebilir. Daha sonra FCCP bir uncoupler oksijen tüketiminin nonmitochondrial kaynaklarını belirlemek için antimycin-A, ardından maksimum OCR, mitokondriyal solunum inhibitörü, belirlemek için ilave edilir. Yedek kapasite enerji talep altında üretilebilir ve solunum maksimum hızı ve bazal arasındaki fark olarak hesaplanır ATP miktarının bir ölçüsüdür. Oksidatif patlama kapasitesini belirlemek amacıyla, forbol 12-miristat 13-asetat (PMA), bir PKC agonist NADPH oksidaz etkinliği geliştirmek için enjekte edilir, ve PMA uyarımı şu oksijen tüketim oranı artış XF analiz cihazı kullanılarak ölçülebilir. Şekil 4b mitokondriyal fonksiyonu ve oksidatif patlama farklı parametreleri hesaplamak için nasıl göstereceğim.

1301/51301fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg "/>
Kandan lökosit ve trombosit Şekil 1.. İzolasyon. A) Taze toplanan örnekler santrifüj ile plazma ve hücre bileşenlerine ayrıldı ve Ficoll yoğunluk gradyanı ile arıtılmış ve trombosit yüksek izole edilir ise Manyetik Aktif Cell, pozitif (monosit ve nötrofil) ya da negatif seçim (lenfositler) tarafından (MACS) Sınıflandırma edilir kez XF DMEM yeniden süspanse ve belirtilen hücre yoğunluklarında kaplama izole hücre popülasyonlarının hızlı trombosit zengin plazmanın santrifüj. B) Görüntüler. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg "/>
Hücre izolasyon ve kaplama ve kartuş hidrasyon ve enjeksiyon noktası yükleme ile XF24 deney plakasının hazırlanması için lökositlerin ve trombositlerin Bioenerjetik çalışmaları için XF24 plakalar Şekil 2.. Hazırlanması. Ayrıntılı zaman çizgisi.

XF24 ve XF96 analiz plakaları. A) Lökosit (125 250k hücre / çukur) ve tek bir vericiden gelen trombositler için (25 x 10 ⁶ hücre / oyuk) üzerine, lökosit ve platelet Şekil 3,. Düzen arka arasında XF24 bir deney plakası üzerindeki plakalanır kontroller. 75 oligomycin 10x stok (0.5 ug / ml), FCCP (0.6 uM), antimycin-A (10 uM) ve ul ve XF ortam içinde seyreltilmiş PMA (100 ng / ml) yüklenirBelirtilen enjeksiyon noktalarına. B) lökositler (75-150K hücre / çukur) ve en fazla dört vericilerden de ⁶ hücre /) 180 ul DMEM içinde XF-toplam hacim içinde XF96 üzerinde kaplama olabilir trombositler (10 x10. Oligomycin (1.0 ug / ml) 10x stok 20 ul, FCCP (0.6 uM), antimycin-A (10 uM), ve PMA XF-DMEM içinde seyreltilmiş (100 ng / ml), belirtilen enjeksiyon girişine yüklenir.

Mitokondri ve monosit oksidatif patlama ile oksijen tüketim hızı (OCR) Şekil 4.. Bioenerjetik endeksleri analizi. A) Temsilcisi iz. Bazal OCR (çevrelerinde numaraları ile gösterilen ilk 3 oranları) kuruldu. Oligomycin of Daha sonra ardışık eklemeler (O, 0.5 ug / ml), FCCP (F, 0.6 uM) ve antibil-A (A, 10 uM) ve mitokondriyal aktive olmamış hücrelerin nonmitochondrial solunum belirlenmesi için enjekte edilmiştir. Son olarak, PMA (100 ng / ml) gösterildiği gibi mitokondriyal fonksiyon ve oksidatif patlama modüler analizi oranlarındaki farklar hesaplanır) oksidatif patlama. B ölçmek için ilave edilir.

	Optimal Seeding Yoğunluk	Ort. Bazal OCR (pmol O 2 / dak)	Ort. Oksidatif Burst OCR (pmol O 2 / dak)	Ort. protein (ug) / yuva
Monositler	250K hücre / çukur	83.9 (13.0 ±)	300.3 (58,8 ±)	19.0 (2.4 ±)
Nötrofiller	250K hücre / çukur	6.1 (2.2 ±)	1411,8 (233,3 ±)	20.6 (2.7 ±)
Lenfositler	250K hücre / çukur	52.9 (7.7 ±)	15 (4.1 ±)	13.2 (± 2.1)
Trombositler	25 x 10 6 hücre / çukur	199.4 (20,3 ±)	24 (2.7 ±)	47.5 (3.1 ±)

Tablo 1. XF24 tahlil için normal parametreleri: ortalama bazal (Oran 3) ve oksidatif patlama (Oran 7) OCR nonmitochondrial OCR veya proteine ​​düzeltilmiş değil belirtilen hücre yoğunluklarında kaplama hücre tipine göre gösterilmektedir. Bir DC Lowry testi ile gerçekleştirilmiştir olarak oyuk başına ortalama protein içeriği gösterilir. Bu veriler, ortalama değerleri temsil etmektedir± SEM içeren parantez ile 6-8 sağlıklı donörler.

Adım	Sorun	Olası neden	Çözüm
1.2	net plazma	Santrifüj sırasında topak haline trombosit	10 dakika ya da 400 x yavaş için santrifüj süresini azaltmak
	sütlü plazma	aşırı lipidler	tokluk toplama önlemek
1.6	eksik hücre bantları oluşturulmuştur	küçük şeytanroper gradyan hazırlık, soğuk reaktif	pipetleme, kullanımı oda sıcaklığı ayıracı sırasında degrade bozmamak
	hücre bantlarında kümeleri	kan pıhtılaşması meydana gelmiş olabilir	Böyle ACD veya EDTA gibi antikoagülan kullanan kan toplayın
1.10	herhangi bir hücre peleti	adım 1.6 bakınız	Yüzer puslu aşağıya görürseniz
	puslu yüzer	Ağır Ficoll gradyan kirlilik, platelet kirlenme	900 xg, di santrifüj hızını artırınDaha RPMI ile lavta
1.16, 1.17	lökositlerin düşük verim	Ağır RBC kontaminasyon, yeterli değil tam kan, pıhtılaşma	Çift antikor ve RPMI-BSA hacimleri, antikoagülan eklemek, daha fazla kan toplamak
1.19	platelet agregasyon	PGI 2 ihmal, soğuk ortam, plazma içinde uzun süreli depolama için maruz	trombosit yıkama tamponu, kullanımı oda sıcaklığı ayıraçlara PGI 2 eklemek
1.20	düşük trombosit sayısı	Birincil santrifüj, trombosit toplama sırasında zarar	Görmek1.2 ve 1.19 adımları
2.3	RBC kirlenme		MACS ayırma tekrarlayın

Tablo 2. Lökosit ve trombosit izolasyon sorun giderme. Tablo tam kan ve sorun giderme sürecinde kullanıcılara rehberlik edebilir çözümleri lökosit ve trombosit hücre izolasyonu sırasında karşılaşılan ortak sorunlar listelenmektedir.

Tartışmalar

Bu protokol, biyoenerji analizi için uygun olan bir şekilde kan hücre izolasyonu için çeşitli yaygın olarak kullanılan tekniklerin derleme temsil eder. Sunulan bitişik teknikleri izole edilmiş hücreleri üzerine yerleştirilmiş en az stres ile kontrol edilen ortam koşullarında hücrelerin çok sayıda izole etme kabiliyetleri açısından diğer izolasyon yöntemleri (örneğin, FACs analizi) avantajlıdır. Hatta az kesinti ile uzun izolasyonların dezavantajı vardır. Bu protokol, klinik ve translasyon araştırma içine ekstrapole edilebilir, insan hastalar, birincil kan hücrelerinin izolasyonu için bir temel olarak hizmet vermektedir.

MACS ayırma tam kan ile irtibata hücrelerin izole edilmesi olanağını sunan güvenilir bir hücre izolasyonu bir tekniktir, ancak bu yöntem, antikorun daha fazla miktarda gerektirir ve bu yöntem de tarif edildiği gibi, dört farklı hücre tiplerinin izolasyonu için uygun değildir. B var olaneen bir kanıt aktivasyonuna MACS ayırma sonuçları ile lökositlerin, pozitif seçim eden izolasyon protokol kullanılarak olduğunu göstermek için kullanılır. MACS sütun 50 nm süperparamanyetik parçacıklar konjüge edilmiş antikorlar kullanılarak bir manyetik alan içinde işaretli hücrelerin tecrit edilmesiyle çalışır. Etiketli hücreleri, kolona kapalı elüte edilir. Pozitif ve negatif seçimleri hızlı izolasyon ve saflığı sağlamak için bu protokolü uygulanmaktadır. Vasat hücre sayıları izolasyonu elde edilen veya saflıkta söz konusu olduğunda ise, daha fazla antikor, yüksek saflıkta (Tablo 2) neden olabilir LS kolonu boyunca satıcının talimatları ve ikinci geçit göre numuneye ilave edilebilir. Bizim laboratuvar FACS analizi ⁸ ile son hücre süspansiyonları analiz ederek, mevcut protokolü kullanarak yüksek saflık ve kaplama verimliliği bulundu.

Ekstrasellüler akı analizörleri ot o zamanla gerçek oksijen tüketimini ve medya asitleştirmenin hem izlemek için yeteneği varonun elektrotlar. DPI ⁸ ile engellenmesi ile gösterildiği gibi, monositler ve nötrofillerde oksidatif patlama tepki ile görüldüğü gibi, oksijen tüketimi, NADPH oksidaz bağlıdır. Biz uzun süreli izolasyonların veya genişletilmiş XF deneyleri ile oksidatif patlama kapasitesi bir zamana bağlı kaybını gördük. Bu protokol tasarlanmış ve geliştirilmiş XF24 üzerinde kullanım için değil, aynı zamanda, yaklaşık olarak üçte yoğunlukları tohumlama XF24 hücrenin bir yarısı (Şekil 3) XF96 uyumlu edildi.

Bu protokolün tasarımında, her bir teknik için mevcut protokollere bağlılık sadece bioenergetic analizi için ortam koşullarını kontrol için yapılan değişiklikler ile optimum performans için gerekli oldu. Teknikleri mastering sonra, böyle bir protokol, tedavi stratejilerinin toksisite veya etkinliğini ölçmek hastalığı metabolik özelliklerini keşfetmek ve monosit ve neut'ait oksidan üretimi için öteleme ve araştırma uygulamaları geniş bir yelpazede kullanılabilirenflamatuar koşullarda rophils.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-094-833
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-501
CD61 MicroBeads, human  for platelets	Miltenyi Biotec	130-051-101
CD14 MicroBeads, human  for monocytes	Miltenyi Biotec	130-050-201
CD15 MicroBeads, human  for granulocytes	Miltenyi Biotec	130-046-601
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes	Fisher	02-684-26
RPMI 1640	Gibco	11835-030	with L-glutamine and without phenol red
Prostaglandin I2, sodium salt	Cayman	18220
1.5 ml semi-micro cuvettes	Phenix Research Products	SC-2410
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077	Sigma	10771
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119	Sigma	11191
Bovine Serum Albumin Fraction V	Roche	3117405001	fatty-acid ultra-free
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma	P8139
XF24 FluxPak	Seahorse Biosciences	100850-001
DMEM	Fisher	MT90113PB	w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate
L-Glutamine, 200 mM (100x)	Invitrogen	25030-081
D-Glucose	Sigma	G7528
Sodium Pyruvate	Sigma	P8574
Cell-Tak (cell adhesive)	BD Biosciences	CB-40242
Oligomycin	Sigma	O4876
Antimycin A	Sigma	A8674
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma	C-2920
DC Protein Assay Reagent A	Bio-Rad	500-0113
DC Protein Assay Reagent S	Bio-Rad	500-0015
DC Protein Assay Reagent B	Bio-Rad	500-0114
Seahorse	Seahorse Biosciences
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-090-976 and 24039
Spectrophotometer