بسيط وبروتوكول السريع لقياس الدهون في خلايا الطحالب المحايدة عن طريق الإسفار

Summary

يوصف بروتوكول بسيط لتحديد محتوى الدهن محايدة من خلايا الطحالب باستخدام إجراء تلطيخ النيل الأحمر. هذه التقنية لتوفير الوقت يوفر بديلا للدهون البروتوكولات التقليدية الكمي القائم على الجاذبية. وقد تم تصميمه لتطبيق معين من الأداء رصد العمليات الحيوية.

Abstract

وتعتبر الطحالب المرشحين ممتازة لمصادر الوقود المتجددة بسبب قدرات التخزين الدهون الطبيعية. مراقبة قوية من عمليات التخمير الطحالب والكشف عن سلالات الغنية بالنفط الجديد يتطلب بروتوكول سريعة وموثوق بها لتحديد محتوى الدهون داخل الخلايا. الممارسات الحالية تعتمد إلى حد كبير على أساليب الجاذبية لتحديد نسبة الزيت، وضعت التقنيات منذ عقود التي هي مضيعة للوقت وتتطلب كميات عينة كبيرة. في هذه الورقة، يتم تضمينها النيل الأحمر، صبغة الفلورسنت التي تم استخدامها لتحديد وجود هيئات الدهون في أنواع عديدة من الكائنات الحية، إلى بروتوكول بسيطة وسريعة، وموثوقة لقياس المحتوى الدهني محايدة من protothecoides Auxenochlorella، خضراء الطحالب. يستخدم الأسلوب الإيثانول، مذيب خفيف نسبيا، لpermeabilize غشاء الخلية قبل تلطيخ و96 جيدا لوحة صغيرة لزيادة القدرة عينة خلال قياسات كثافة مضان. فقد كان تصميمإد مع تطبيق معين من الأداء رصد العمليات الحيوية. عينات المجففة سابقا أو عينات حية من ثقافة متنامية يمكن أن تستخدم في الفحص.

Introduction

نظرا لقدرتها على تخزين الدهون تحت بعض الهيئات ظروف الإجهاد، تلقى الطحالب قدرا كبيرا من الاهتمام في السنوات الأخيرة كمصدر للوقود المتجددة المحتملة ^1،2. يمكن أن الدهون محايدة تمثل أكثر من 60٪ من الوزن الجاف خلية في ظل ظروف النمو المناسبة ^3. بعد صناعة لايوجد بروتوكول موحد بسيطة ونظيفة وسريعة، وموثوق بها ل quantitate المحتوى الدهني للخلايا الطحالب من أجل رصد أداء العمليات الحيوية بشكل صحيح وتحليل الثقافات، وشاشة لسلالات جديدة.

تطوير أسلوب بليغ-داير الجاذبية منذ نحو 50 عاما لا تزال من بين الأساليب الأكثر شيوعا المستخدمة اليوم ^4،5. في حين أن هذا الإجراء هو بسيط وموثوق بها، ويسهل حملها خارج، وأنها تستغرق وقتا طويلا، يتطلب حجم العينة كبير، ويجعل من استخدام المذيبات السامة. أنه ليس من العملي لتحليل العديد من العينات من شوط التخمير أو الكشف عن سلالات جديدة الغنية بالنفط. أساليب أخرى قد بالتابعين المتقدمة، ولكن عادة ما تتطلب المعدات المتطورة والتي لم يتم توحيدها ^6.

البديل الذي قد حصل قدرا كبيرا من الاهتمام هو وصمة عار النيل الأحمر. وقد النيل الأحمر، وهي الصبغة التي تتفلور تفضيلي في بيئات غير القطبية، وتستخدم لتحديد أو تقدير الهيئات الدهون في الكائنات المختلفة بما في ذلك الديدان الخيطية ^{7، 8} الخميرة والبكتيريا ^9، والطحالب ^10-19. كانت التقنيات الأولية التي تنطوي على النيل الأحمر الغالب النوعي أو شبه الكمي، والجمع بين وصمة عار مع واحد أو القياس الطيفي كفيت التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، بعض الفئات من الطحالب مثل الطحالب الخضراء لديهم آبار الخلية سميكة التي هي غير منفذة في الغالب إلى الصبغة، والتي تقتصر على مجموعة من تقنية ^10.

وقد تم الإبلاغ عن التحسينات الأخيرة إلى أسلوب تلطيخ النيل الأحمر أن تجاوز أوجه القصور الأولي للبروتوكول ^10،11. تلطيخ الخلايا في وجود كارهيئة الإنصاف والمصالحة المذيبات مثل DMSO ¹⁰ أو الإيثانول ^10،11 linearizes العلاقة بين محتوى الزيت والامتصاصية، والسماح لقياسات كمية موثوق بها. المذيب يساعد permeabilize غشاء الخلية بحيث تكون جزيئات النيل الأحمر يمكن أن تمر من خلال. بالإضافة إلى ذلك، يشتمل على معمل مع قدرات القراءة لوحة صغيرة تمكن بروتوكولات إنتاجية عالية مناسبة للتحليل الكمي.

في هذه المادة ونحن من التفصيل طريقة بسيطة لقياس نسبة الزيت من الخلايا الطحلبية التي كتبها تلطيخ الثقافات مع النيل الأحمر في حضور الإيثانول، مذيب خفيف. من أجل معظم بدقة تمثل الضوضاء الخلفية في القياسات، تم تطوير منحنى القياسية ربط كثافة مضان لمحتوى الزيت باستخدام خلايا الطحالب من تكوين النفط المعروفة. ويتم تكييف طريقة من البروتوكولات نشرت سابقا ^10،11. باستخدام مطياف 96 جيدا، هو واحد قادرا على تحليل نفس الكمية من العينات في ثا ساعةر سيستغرق يوما لمراقبة من قبل وسائل الجاذبية. وعلاوة على ذلك، من خلال معايرة باستخدام عينات تمثيلية من أنواع الطحالب المطلوبة هذه الطريقة تنتج قياسات دقيقة نسبيا التي هي للتفسير مباشرة. توجد العديد من البروتوكولات تحدد أساليب تلطيخ مع الطحالب النيل الأحمر الأمثل لسلالات والتطبيقات المختلفة؛ بروتوكول المعروضة هنا وضعت أصلا من قبل دي لا هوز سيجلر وآخرون ¹¹ لprotothecoides Auxenochlorella، شلوريلا الشائع، Scenedesmus dimorphus، وScenedesmus المائلة، على الرغم من انها مناسبة المرجح لعدد أكبر من الأنواع والطبقات. قد تم تصميمه مع تطبيق معين من رصد الأداء والعمليات الحيوية أنها تعمل بشكل جيد على قدم المساواة للعينات المجففة سابقا وعينات الرطب من ثقافة متنامية.

Protocol

1. عزل الطحالب الكتلة الحيوية الجافة لاستخدامها معايير الإسفار قراءات

1. إزالة وحدة تخزين عينة من ثقافة الطحالب المتزايدة من شأنها أن توفر ما لا يقل عن 200 ملغ من الكتلة الحيوية الجافة، 400-600 ملغ هو الأفضل.
2. عينة الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 10،000 ز س. تجاهل طاف ويغسل بيليه مع حجم مساو من العازلة الفوسفات وضعت لنفس درجة الحموضة وسائل الاعلام النمو.
3. كرر الخطوة 1.2 ليصبح المجموع 3 خطوات الغسيل.
4. إعادة تعليق بيليه في غير المتأينة المياه ونقل إلى طبق وزنه قبل تزن. اسمحوا الجافة عند 50 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ملاحظة: التجفيف تحت فراغ سينخفض ​​وقت التجفيف وتجفيف الثقافة في درجات الحرارة فوق 50 درجة مئوية قد تجعل من الصعب إعادة تعليق.
5. متجر المجففة الثقافات الطحالب في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها في المستقبل.

2. الكمي الوزني من الدهون المحايدة التي كتبها الهكسين استخراج (مقتبس من بليغ وداير ⁴⁾

1. قياس ما يقرب من 50 ملغ من الطحالب الكتلة الحيوية الجافة في وزن الطبق. ملاحظة: الجماهير تتراوح 40-80 ملغ يمكن استخدامها دون فقدان للاستنساخ.
2. نقل الكتلة الحيوية إلى هاون غسلها مسبقا مع الهكسان. إذا لزم الأمر، وغسل تزن الطبق مع كمية صغيرة (1 مل) من الهكسان باستخدام ماصة باستور من أجل نقل تماما الكتلة الحيوية إلى الهاون. ملاحظة: الهكسين هو عبارة عن مادة شديدة التقلب والسامة. يجب التعامل معها في غطاء الدخان مع الملابس الواقية المناسبة.
3. طحن الكتلة الحيوية للطحالب لمدة 5 دقائق باستخدام مدقة. تبدأ طحن لطيف وزيادة كثافة تدريجيا. طحن الكتلة الحيوية إلى عجينة غرامة وسلس في الفترة 5 دقائق. إذا تم استخدام الهكسان الزائدة عند نقل الكتلة الحيوية إلى الهاون، فمن الأفضل أن ننتظر الهكسان لتتبخر قبل طحن.
4. إضافة بضع مل من الهكسان إلى الهاون ويخلط الناتج الطين مع مدقة حتى يتم المتجانس ذلك. التأكد من أن جميع الحطام الخلية انضمت إلى جدران موروطرقت القطران حرة وعلقت في السائل.
5. نقل الخليط كتلة خلايا الهكسان إلى أنبوب الطرد المركزي. ملاحظة: يجب أن يكون أنبوب الطرد المركزي إما الزجاج أو البوليمر مناسبة متوافقة مع الهكسان مثل التفلون.
6. كرر الخطوات من 2.4 و 2.5 حتى يتم نقل جميع الكتلة الحيوية إلى أنبوب الطرد المركزي (3-5X).
7. الطرد المركزي العينة عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في 10،000 ز س.
8. ماصة بعناية طاف في المعادن وزنه قبل تزن الطبق. تخزين في غطاء الدخان.
9. إجراء استخراج 2 ^{الثانية} الهكسان بإضافة 3 مل من الهكسان لبيليه وبقوة vortexing لمدة 1 دقيقة.
10. كرر الخطوات من 2.7 و 2.8. إذا لزم الأمر، قم بتشغيل العينات لمدة 30 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي أثناء استخراج الثاني لضمان كل الحطام الخلية يستقر بالكامل. تحديد كتلة من النفط المستخرج gravimetrically بعد الهكسان قد تبخرت تماما.

3. فلوروميتريك الكمي من الدهون المحايدة عن طريق النيل الأحمر (كما حرية تقريرتيد من قبل دي لا هوز سيجلر وآخرون ¹¹⁾

ملاحظة: هناك حاجة فقط 10 ميكرولتر لتعليق الطحالب في 5 ز / L لقراءة مضان. عموما، والعزلة من الكتلة الحيوية الطحالب الجافة من 1.5 مل من مرق الثقافة هي أكثر من كافية. أيضا، لشدة ضوء المصباح في معمل يمكن أن تتحلل بمرور الوقت. فمن المستحسن أن تشمل المعايير في كل تجربة للتأكد من أن الاختلافات في الصك لا تضيف الخطأ غير الضرورية إلى القياسات.

1. إعداد الحل النيل الأحمر بتركيز 10 ميكروغرام / مل الذائبة في الكحول كاشف الصف الايثانول. تخزين هذا الحل في الظلام في 4 درجات مئوية.
2. إعداد 30٪ (V / V) حل الإيثانول في الماء منزوع الأيونات وتخزينها في 4 درجات مئوية.
3. إعداد جميع عينات الطحالب في تركيز الكتلة الحيوية نفسها (ينصح 5 ز / L) وبنفس الطريقة والمعايير المستخدمة في القياس. القيام بذلك عن طريق إما بتعليق عينات ما قبل المجففة في كمية مناسبةمن العازلة الفوسفات (0.6 غرام / لتر ثنائي القاعدة فوسفات البوتاسيوم، و 1.4 غرام / لتر البوتاسيوم أحادى فوسفات)، أو ضبط تركيز ثقافة الطحالب المتزايدة إلى 5 ز / L مع العازلة الفوسفات بعد قياس العكارة. ملاحظة: القياسات التي أجريت على الثقافات الحية الطحالب وغالبا ما يكون خطأ أكبر المرتبطة بها اعتمادا على الدقة من منحنى المعايرة التعكر. إعادة التعليق عينات المجففة قد تتطلب استخدام الخالط لتفريق بالكامل الكتلة الحيوية.
4. لكل عينة، مزيج 80 ميكرولتر من الحل الايثانول 30٪، و 10 ميكرولتر من الحل النيل الأحمر، و 10 ميكرولتر من تعليق الطحالب في بئر واحدة من 96 لوحة جيدا. من أجل حساب صحيح لتنوع قياس مضان، نفذ 5 مكررات من كل عينة.
5. تشغيل منحنى المعايرة نقطتين مع معايير معدة مسبقا وذلك لحساب ليوم ليوم الاختلافات في الصك والتحضير. إعداد معايير لقياس مضان باستخدام قالإجراء AME كما العينات. ملاحظة: عموما نقطتين كافية لإعادة تقويم الصك، يمكن تشغيل ثلاث نقاط للتحقق الخطي.
6. إجراء قياسات مضان في متعددة جيدا قارئ لوحة طيفي. عثر على الشروط التالية لتسفر عن نتائج أكثر اتساقا ^11:
   1. يهز في 1،200 دورة في الدقيقة، مدار 3 مم، لمدة 30 ثانية.
   2. احتضان عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   3. يهز في 1،200 دورة في الدقيقة، مدار 3 مم، لمدة 30 ثانية.
   4. سجل مضان، الإثارة في 530 نانومتر، والانبعاثات في 604 نانومتر.
7. تحويل القياسات مضان لمحتوى الزيت باستخدام النتائج من المعايير الداخلية.

4. مضان المجهري تقنيات

ملاحظة: تم تصميم بروتوكول تلطيخ الموضحة في قسم 3 للتحليل الكمي، ولكن يمكن أيضا أن تكون مفيدة لتوفير تمثيل مرئي من التقنيات المعتمدة وصمة عار للمؤسسات التعليمية والتوضيحية بوrposes. لإنتاج صور من عينة واحدة يتطلب مضان المجهر الضوئي مع انتقال وإضاءة إضافية epifluorescence المصادر التقليدية. الإثارة وانبعاث ضوء المرشحات في 530 نانومتر (الأخضر) و 604 نانومتر (الأحمر) مجموعة، على التوالي، وهناك حاجة لنهر النيل وصمة عار الأحمر فضلا عن كاميرا محمولة المجهر مع البرامج المرتبطة بها. تم الحصول على الصور المبينة في هذه الدراسة (الشكل 1) باستخدام مجهر حقل مشرق مجهزة الكاميرا وأحادية اللون لتحويل RGB حدة. ويرد الإجراء لإنتاج النيل الأحمر الصور مضان باستخدام هذه الأدوات أدناه:

1. إعداد عينة الثقافة مع وصمة عار النيل الأحمر وفقا للمادة 3 من البروتوكول. ملاحظة: عينة في نطاق تركيز 5 جم / لتر تنتج الشرائح من كثافة الخلية كافية دون اكتظاظ.
2. بعد الانتهاء من الخطوة 3.6 من البروتوكول تلطيخ، وإعداد شريحة المجهر من العينة المجهزة وفقا لإجراءات المختبر القياسية.
3. بدءا من المجهر في وضع الإرسال، تحميل أعدت الشريحة في المجهر، وتحديد موقع الخلايا على التكبير المطلوب (تم الحصول عليها الصور المبينة في هذه المادة بهدف 100X).
4. مرة واحدة مركزة، تبديل المجهر من انتقال لوضع الإضاءة epifluorescence. مصدر الضوء ينبغي الآن تأتي مباشرة من العدسة الشيئية (هذا يمكن التأكد بصريا من خلال مراقبة الفضاء بين الشرائح وعدسة الهدف).
5. إدراج مرشح الإثارة الخضراء في مصدر الضوء ومرشح الانبعاثات الحمراء في مسار الضوء المراقبة؛ يجب أن يكون مضان من الخلايا الملون الآن مرئية مباشرة من خلال العدسة.
6. تبديل وضع المراقبة المجهر من العدسة إلى كاميرا محمولة واستخدام برامج عرض لالتقاط صورة للخلايا الاستشعاع. تبعا لحساسية الكاميرا، قد لا تظهر العينة في البداية في إطار المعاينة (أي الشاشة سوفتكون سوداء)؛ لتصحيح هذا، وضبط وقت التعرض وكسب الكاميرا إلى المستوى الذي كانت الخلايا مرئية. سوف تختلف إعدادات محددة مع الأدوات والمعدات، وأنواع الخلايا.

النتائج

وصفت الخلايا الطحلبية ممثل ملطخة النيل الأحمر صبغ في الشكل 1. الجزأين ألف وباء من الشكل 1 عرض الصور A. protothecoides نمت في النيتروجين الزائد، مما يؤدي إلى تراكم الدهون منخفضة جدا داخل الخلايا. في أجزاء C و D، وعينات من A. ...

Discussion

يجب أن تكون الطحالب المستخدمة في منحنى القياسية نفس الأنواع المزروعة تحت نفس الظروف التجريبية مثل تلك التي يجري قياسها. تغييرات كبيرة في تكوين وسائل الإعلام، وتقنية زراعة، وبروتوكول تلطيخ يمكن أن تؤثر على شدة القراءة مضان. وقد استخدم استخراج الهكسان (الموصوفة في ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry Weight
25 ml disposable pipettes	Fisher	13-676-10K
Pipette Bulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes	Fisher	05-562-16A	Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene)	Fisher	2-202B
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Storage vials	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP)	Fisher	05-562-16A	Could also use glass tubes
Pasteur glass pipettes	Fisher	13-678-20C
Aluminum weigh dishes	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope	Leica	DMRXA2
Microscope slides	Fisher	12-550-15
Microscope cover slips	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Imaging software	Qimaging	QCapture v.1.1.8