Простой и быстрый протокол для измерения нейтральных липидов в клетках водорослей с помощью флуоресцентной

Резюме

Простой протокол для определения нейтрального содержания жиров водорослевых клеток, используя процедуру Нил красные пятна описывается. Это экономия времени техника предлагает альтернативу традиционным гравиметрических основе липидов протоколов количественного. Она была разработана для конкретного применения мониторинга производительности биотехнологических.

Аннотация

Водоросли считаются превосходными кандидатами для возобновляемых источников топлива из-за их природных возможностей хранения липидов. Прочная мониторинг водорослей процессов брожения и скрининга новых богатых нефтью штаммов требуется быстрый и надежный протокол для определения внутриклеточного содержания липидов. Существующие методы полагаться в значительной степени от гравиметрических методов определения содержания масла, методы, разработанные десятилетий назад, что занимает много времени и требует больших объемов образцов. В данной работе, Нил красный, флуоресцентный краситель, который был использован для идентификации присутствия липидов органов в многочисленных видов организмов, включена в простой, быстрой и надежной протокола для измерения нейтрального содержания жиров Auxenochlorella protothecoides, зеленый водоросли. Метод использует этанол, относительно мягкий растворитель, чтобы проницаемыми клеточную мембрану перед окрашиванием и 96 также микро-пластина для увеличения потенциала образца в процессе измерений интенсивности флуоресценции. Это был дизайнред с конкретного применения мониторинга производительности биотехнологических. Ранее высушенные образцы или живые образцы из растущей культуры могут быть использованы в анализе.

Введение

Благодаря своей способности хранить липидов тела при определенных условиях стресса, водоросли получили большое внимание в последние годы в качестве потенциального источника возобновляемой топливной ^1,2. Нейтральные липиды могут составлять более 60% от сухого веса клеток при соответствующих условиях роста ^3. Тем не менее, промышленность не есть простой, чистый, быстрый и надежный стандартный протокол для количественного содержания жиров водорослевых клеток для того, чтобы должным образом контролировать работу Биопроцесс, анализа культур, и на экране, новых штаммов.

Гравиметрический метод Блай-Дайер разработан около 50 лет назад, остается одним из наиболее распространенных методов, используемых сегодня ^4,5. Хотя эта процедура проста, надежна и легко осуществить, это отнимает много времени, требует больших объемов выборки, и делает использование токсичных растворителей. Это не практично для анализа много образцов из ферментации или скрининг для новых богатых нефтью штаммов. Другие методы бееп разработан, но, как правило, требуют современного оборудования и не были стандартизированы ^6.

Альтернатива, которая собрала большое интерес представляет Нил красное пятно. Нил красный, краситель, который флуоресцирует преимущественно в неполярных средах, была использована для идентификации или количественной липидов тела в различных организмов, включая нематод ^7, дрожжей ^8, бактерий ⁹ и водорослей ^10-19. Первоначальные методы с участием Нила Red были в основном качественными или полуколичественный, сочетая пятно с одной кюветы спектрофотометрии или проточной цитометрии. Кроме того, некоторые классы водорослей, таких как зеленые водоросли имеют толстые клеточные скважин, которые в основном непроницаемым для краски, что ограничивало диапазон технике ^10.

Последние улучшения в методе Нил Красной окрашивания сообщалось, что обойти начальные недостатки протокола ^10,11. Окрашивание клеток в присутствии CarrИОС растворителе, таком как ДМСО или этаноле ^{10 10,11} линеаризует взаимосвязь между содержанием масла и абсорбции, что позволяет надежных количественных измерений. Растворитель помогает проницаемыми клеточную мембрану так, что молекулы Нил Красные может пройти. Кроме того, включение спектрофотометра с возможностью считывания микро-пластин обеспечивает высокую пропускную способность протоколы, подходящие для количественного анализа.

В этой статье мы подробно простой метод для измерения содержания нефти в клетках водорослей путем окрашивания культур с Нила красный в присутствии этанола, мягким растворителем. Для того, чтобы наиболее точно учитывать фонового шума в измерениях, стандартная кривая корреляции интенсивности флуоресценции для содержания масла разработан с использованием водорослей клетки известного состава нефти. Метод заимствован из ранее опубликованных протоколов ^10,11. С помощью спектрофотометра 96-луночный, один способен анализировать такое же количество образцов в час тхат бы занять несколько дней, чтобы следить по гравиметрических методов. Кроме того, при калибровке с использованием репрезентативных образцов желаемого вида водорослей этот метод производит относительно точные измерения, которые непосредственно интерпретировать. Там существует много протоколов с изложением методов окрашивания водоросли с видом на Нил красный, оптимизированный для различных штаммов и приложений; Протокол, представленные здесь был первоначально разработан де ла Ос Siegler др.. ¹¹ для Auxenochlorella protothecoides, хлорелла, Scenedesmus dimorphus и Scenedesmus Obliquus, хотя вполне вероятно, подходит для многих больше видов и классов. Она была разработана с конкретного применения мониторинга производительности биотехнологических и она работает одинаково хорошо для ранее высушенных образцов и влажных образцов из растущего культуры.

протокол

1. Выделение сухой биомассы водорослей для использования в качестве стандартов для флуоресценции чтений

1. Удаление объем пробы из растущей культуры водорослей, который будет обеспечивать, по меньшей мере 200 мг сухой биомассы, 400-600 мг является предпочтительным.
2. Центрифуга образца при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 10000 х г. Жидкость над осадком сливают и промывают осадок с равным объемом фосфатного буфера, сформулированной в то же, что и рН питательной среды.
3. Повторите шаг 1.2 для в общей сложности 3 стадий промывки.
4. Повторное приостановить осадок в деионизированной воды и трансфер в предварительно взвешенную весят блюдо. Пусть сухой при 50 ° С в течение 48 часов. Примечание: сушки в вакууме уменьшится время сушки и сушки культуру при температуре выше 50 ° С может сделать ресуспендирования трудно.
5. Магазин сушат Культуры водорослей при комнатной температуре для дальнейшего использования.

2. Гравиметрическое Количественное определение нейтральных липидов гексаном Добыча (адаптировано из Блай и Дайер ⁴⁾

1. Измерьте приблизительно 50 мг сухой биомассы водорослей в весовой блюдо. Примечание: массой от 40-80 мг может быть использована без потери воспроизводимостью.
2. Передача биомассы в ступке, предварительно промытого гексаном. При необходимости промывать взвешивания блюдо с небольшим количеством (1 мл) гексана с помощью пипетки Пастера, чтобы полностью передать биомассы в ступке. ПРИМЕЧАНИЕ: гексан является крайне нестабильной и токсичным веществом. Это должны быть обработаны в вытяжной шкаф с надлежащей защитной одежды.
3. Измельчить биомассы водорослей в течение 5 мин с помощью пестика. Начните с бережного измельчения и постепенно увеличивать интенсивность. Измельчить биомассы в виде штрафа и однородной массы в течение 5 минут. Если избыток гексан используется при передаче биомассы в ступке, то лучше подождать гексан испариться перед шлифованием.
4. Добавить несколько мл гексана в ступке и смешать полученной суспензии с пестиком, пока она не гомогенизируют. Убедитесь, что все остатки клеток прилипают к стенкам мортар выбиваются бесплатно и взвешенных в жидкости.
5. Передача массовое смесь гексан-клеток в центрифужную пробирку. Примечание: центрифужные пробирки должны быть либо стекло или полимер подходит совместимы с гексаном, таких как тефлон.
6. Повторите шаги 2.4 и 2.5, пока вся биомасса не были переданы в центрифуге трубки (3-5х).
7. Центрифуга образца при температуре 4 ° С в течение 20 мин при 10000 х г.
8. Тщательно пипетки надосадочную жидкость в предварительно взвешенную металла взвешивания блюдо. Храните в вытяжной шкаф.
9. Выполните извлечение ^2-й гексан добавлением 3 мл гексана к осадку и энергично вортексе в течение 1 мин.
10. Повторите шаги 2.7 и 2.8. При необходимости выполнения образцов в течение 30 мин в центрифуге в течение второй экстракции, чтобы обеспечить все остатки клеток полностью решает. Определите массу нефти, добываемой гравиметрически после гексан высох.

3. Флуорометрический Количественное определение нейтральных липидов Использование Нила красный (как ReporТед по де ла Ос Siegler др.. ¹¹⁾

ПРИМЕЧАНИЕ: Только 10 мкл в суспензии водорослей на 5 г / л необходим для чтения флуоресценции. Как правило, изоляция сухой биомассы водорослей от 1,5 мл культуральной жидкости более чем достаточно. Кроме того, интенсивность света лампы в спектрофотометра может со временем ухудшаться. Рекомендуется включить стандарты в каждом эксперименте для того, чтобы изменения в приборе не добавлять ненужные ошибки в измерениях.

1. Готовят раствор Нил Красное при концентрации 10 мкг / мл, растворенных в спирт реагентной степени чистоты этанола. Храните это решение в темноте при 4 ° С.
2. Подготовка 30% (объем / объем) этанола раствор в деионизированной воде и хранить при температуре 4 ° С.
3. Подготовка всех образцов водорослей в той же концентрации биомассы (5 г / л рекомендуется) и таким же образом, как стандартами, используемыми в измерении. Сделать это, либо суспендирующими предварительно высушенных образцов в соответствующем количествефосфатного буфера (0,6 г / л двухосновной фосфат калия, 1,4 г / л фосфата одноосновного калия), или регулирования концентрации растущей культуре водорослей до 5 г / л фосфатным буфером после измерения мутности. ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения, проведенные на живых водорослей культур часто имеют большую погрешность, связанную с ними в зависимости от точности калибровки мутности кривой. Ресуспендирования высушенных образцов может потребоваться использование гомогенизатора, чтобы полностью диспергировать биомассу.
4. Для каждого образца, смешать 80 мкл 30% раствора этанола, 10 мкл Нил красный раствор, и 10 мкл суспензии водорослей в одном лунку 96-луночного планшета. Для того чтобы правильно учесть изменчивость измерения флуоресценции, выполните 5 повторов каждого образца.
5. Запустите калибровочной кривой по двум точкам с стандартов, разработанных ранее для того, чтобы учесть изо дня в день изменений в приборе и подготовки. Подготовка стандартов для измерения флуоресценции с помощью SAme процедура, как образцы. ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило две точки достаточно для калибровки прибора, три очка могут быть запущены, чтобы проверить линейность.
6. Выполните измерения флуоресценции в мульти-а планшет-ридер спектрофотометра в. Следующие условия были найдены, чтобы получить наиболее последовательные результаты ^11:
   1. Встряхнуть в 1200 оборотов в минуту, орбита 3 мм, в течение 30 сек.
   2. Инкубировать при 40 ° С в течение 10 мин.
   3. Встряхнуть в 1200 оборотов в минуту, орбита 3 мм, в течение 30 сек.
   4. Запись флуоресценции, возбуждения при 530 нм, эмиссия при 604 нм.
7. Преобразование измерения флуоресценции к содержимому нефти с использованием результатов от внутренних стандартов.

4. Флуоресцентной микроскопии Техника

Примечание: Протокол окрашивания описано в разделе 3 предназначен для количественного анализа, но он также может быть полезен для обеспечения визуального представления методов окраски основе по учебно-иллюстративный о.е.rposes. Для получения изображений образца флуоресценции одной требуется оптического микроскопа с традиционными передачи и дополнительное освещение эпифлуоресцентная источников. Возбуждения и эмиссии светофильтры в 530 нм (зеленый) и 604 нм (красный) диапазоне, соответственно, нужны для Нила красное пятно, а также предметное смонтированного камеры с соответствующим программным обеспечением. Изображения, приведенные в этом исследовании (рис. 1) были получены с помощью ярко-поле микроскопа, оборудованного с камерой и Monochrome к RGB конвертер блока. Процедура для получения флуоресцентных изображений Нил Красные использовании этих инструментов приводится ниже:

1. Подготовьте образец культуры с Нила красное пятно в соответствии с разделом 3 протокола. ПРИМЕЧАНИЕ: образец в 5 г / л диапазоне концентраций производит слайды адекватной плотности клеток без переполненности.
2. После выполнения шага 3.6 протокола окрашивания, подготовить микроскопа обрабатываемого образца в соответствии со стандартными лабораторных процедур.
3. Начиная с микроскопом в режиме передачи, загрузите подготовленный слайд в микроскоп, и найдите клетки в нужной увеличением (изображения показаны в этой статье были приобретены с целью 100X).
4. После фокусировки, переключите микроскоп от передачи в режим освещения эпифлуоресцентной. В качестве источника света должны теперь приходить непосредственно с объектива (это может быть подтверждено визуально наблюдая пространство между горкой и объектива).
5. Вставьте зеленый фильтр возбуждения на источник света и красным фильтром твердых в пути на наблюдение света; флуоресценция окрашенных клеток теперь должны быть видны непосредственно через окуляр.
6. Переключение режима микроскоп наблюдения от окуляра до смонтированного камеры и использовать программное обеспечение для просмотра, чтобы захватить изображение из флуоресцирующих клеток. В зависимости от чувствительности камеры, образец не может изначально появится в окне предварительного просмотра (т.е. на экране будетбыть черным); чтобы исправить это, регулировать время экспозиции и усиления камеры до уровня, когда видны клетки. Конкретные параметры будут меняться в зависимости от инструментов, оборудования и типов клеток.

Результаты

Представительства клетки водорослей окрашенные Нил Красного красителя изображены на рисунке 1. Части А и В из рис. 1 отображения изображений А. protothecoides выросли в избытке азота, что приводит к очень низким накоплением внутриклеточного окисления ...

Обсуждение

Водоросли, используемый в стандартной кривой должен быть того же вида культивируют в тех же экспериментальных условиях, как и измеряется. Существенные изменения в составе средств массовой информации, техники выращивания, и протокола окрашивания может повлиять на интенсивность чтени?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry Weight
25 ml disposable pipettes	Fisher	13-676-10K
Pipette Bulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes	Fisher	05-562-16A	Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene)	Fisher	2-202B
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Storage vials	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP)	Fisher	05-562-16A	Could also use glass tubes
Pasteur Glass Pipettes	Fisher	13-678-20C
Aluminum weigh dishes	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (Alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope	Leica	DMRXA2
Microscope slides	Fisher	12-550-15
Microscope cover slips	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Imaging software	Qimaging	QCapture v.1.1.8