Una semplice e rapida il protocollo per la misurazione lipidi neutri in cellule algali Uso fluorescenza

Riepilogo

Un semplice protocollo per determinare il contenuto di lipidi neutri di cellule algali utilizzando una procedura di colorazione rosso Nilo è descritto. Questa tecnica consente di risparmiare tempo offre un'alternativa ai protocolli di quantificazione lipidi basato gravimetrici tradizionali. E 'stato progettato per la specifica applicazione di monitoraggio delle prestazioni bioprocess.

Abstract

Le alghe sono considerati ottimi candidati per fonti di energia rinnovabili a causa della loro capacità di stoccaggio dei lipidi naturali. Un efficiente monitoraggio dei processi di fermentazione algali e screening per nuovi ceppi ricchi di petrolio richiede un protocollo veloce e affidabile per la determinazione del contenuto lipidico intracellulare. Pratiche attuali si basano in gran parte su metodi gravimetrici per determinare il contenuto di olio, tecniche sviluppati decenni fa che richiedono molto tempo e richiedono grandi volumi di campione. In questo lavoro, Nilo rosso, un colorante fluorescente che è stato utilizzato per identificare la presenza di corpi lipidici in numerosi tipi di organismi, è incorporato in un protocollo semplice, veloce, affidabile per misurare il contenuto di lipidi neutri di protothecoides Auxenochlorella, una verde alga. Il metodo utilizza etanolo, un solvente relativamente mite, per permeabilize membrana cellulare prima della colorazione e un 96 ben micropiastra per aumentare la capacità campione durante fluorescenza misure di intensità. E 'stato il designed con l'applicazione specifica di monitoraggio delle prestazioni bioprocess. Campioni precedentemente essiccati o campioni dal vivo da una coltura in crescita possono essere utilizzati nel saggio.

Introduzione

Grazie alla loro capacità di immagazzinare corpi lipidici in determinate condizioni di stress, alghe hanno ricevuto molta attenzione negli ultimi anni come potenziale fonte di combustibile rinnovabile ^1,2. Lipidi neutri possono rappresentare oltre il 60% del peso secco cella sotto opportune condizioni di crescita ^3. Ma l'industria non ha un protocollo standardizzato semplice, pulito, veloce e affidabile per quantificare il contenuto lipidico delle cellule algali al fine di monitorare adeguatamente le prestazioni bioprocess, analizzare le culture, e lo schermo per nuovi ceppi.

Il metodo gravimetrico Bligh-Dyer ha sviluppato circa 50 anni fa, rimane tra le tecniche più comuni utilizzate oggi ^4,5. Mentre questo procedimento è semplice, affidabile, e facile da realizzare, che richiede tempo, richiede grandi volumi di campione, e fa uso di solventi tossici. Non è pratico per analizzare molti campioni da una corsa di fermentazione o di screening per nuovi ceppi ricchi di petrolio. Altri metodi hanno bEEN sviluppato, ma di solito richiedono attrezzature avanzate e non sono stati standardizzati ^6.

Un'alternativa che ha raccolto un grande interesse è la macchia Nile Red. Nilo Red, un colorante che reagisce preferenzialmente in ambienti non polari, è stato usato per identificare o quantificare corpi lipidici in vari organismi tra nematodi ^7, lievito ^{8, 9,} batteri e alghe ^10-19. Tecniche iniziali coinvolgono Nile Red erano per lo più qualitativa o semi-quantitativa, che unisce la macchia con una sola cuvetta spettrofotometria o citometria a flusso. Inoltre, alcune classi di alghe come alghe verdi hanno pozzi cellulari spesse che sono per lo più impermeabile al colorante, che limita la gamma della tecnica ^10.

Recenti miglioramenti al metodo di colorazione rosso Nilo sono stati segnalati che bypassare le carenze iniziali del protocollo ^10,11. Colorazione delle cellule in presenza di un carrier solvente come DMSO ¹⁰ o etanolo ^10,11 linearizza il rapporto tra contenuto di olio e l'assorbanza, consentendo misurazioni quantitative affidabili. Il solvente aiuta permeabilize membrana cellulare in modo che le molecole Nilo rossi possono passare attraverso. Inoltre, incorporando uno spettrofotometro con capacità di lettura micro-piastra consente protocolli di throughput elevate adatte per l'analisi quantitativa.

In questo articolo abbiamo dettaglio un metodo semplice per misurare il contenuto di olio di cellule algali mediante colorazione culture con Nile Red in presenza di etanolo, un solvente delicato. Per più esattamente conto di rumore di fondo nelle misure, una curva standard correlazione intensità di fluorescenza al contenuto di olio è stato sviluppato utilizzando cellule algali di nota composizione di olio. Il metodo è adattato da protocolli precedentemente pubblicati ^10,11. Utilizzando uno spettrofotometro a 96 pozzetti, si è in grado di analizzare la stessa quantità di campioni in un tha un'orat avrebbe preso giorni di tempo per monitorare con metodi gravimetrici. Inoltre, calibrando utilizzando campioni rappresentativi della specie algale desiderato questo metodo produce misurazioni relativamente precise che sono direttamente interpretabili. Esistono molti protocolli che descrivono i metodi di colorazione alghe con Nile Red ottimizzato per i ceppi e le diverse applicazioni; il protocollo qui presentato è stato originariamente sviluppato da de la Hoz Siegler et al. ¹¹ per protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, e Scenedesmus obliquo, anche se è probabile adatto a molte più specie e classi. E 'stato progettato con l'applicazione specifica di monitoraggio delle prestazioni bioprocessi e funziona altrettanto bene per i campioni precedentemente essiccati e campioni bagnato da una cultura in crescita.

Protocollo

1. Isolamento di lavaggio a biomassa algale per essere utilizzato come standard per la fluorescenza Letture

1. Rimuovere un volume di campione dalla crescente coltura algale che fornirà almeno 200 mg di biomassa secca, 400-600 mg è preferibile.
2. Centrifugare campione a 4 ° C per 10 min a 10000 x g. Eliminare il supernatante e lavare il pellet con un volume uguale di tampone fosfato formulato per lo stesso pH come i mezzi di crescita.
3. Ripetere passo 1.2 per un totale di 3 fasi di lavaggio.
4. Risospendere il pellet in acqua deionizzata e trasferire ad un piatto pre-tarato pesare. Lasciare asciugare a 50 ° C per 48 ore. NOTA: Essiccazione sotto vuoto si riduce il tempo di asciugatura ed essiccazione della cultura a temperature superiori a 50 ° C può rendere difficile la risospensione.
5. Conservare secca colture algali a temperatura ambiente per un utilizzo futuro.

2. Quantificazione gravimetrico di lipidi neutri da esano estrazione (Adattato da Bligh e Dyer ⁴⁾

1. Misura circa 50 mg di alghe secca biomassa in un piatto di pesatura. NOTA: Le masse che vanno 40-80 mg possono essere utilizzati senza perdita di riproducibilità.
2. Trasferire la biomassa di una malta pre-lavato con esano. Se necessario, lavare il piatto pesare con una piccola quantità (1 ml) di esano con una pipetta Pasteur per trasferire completamente i biomassa alla malta. NOTA: esano è una sostanza altamente volatile e tossico. Si deve essere gestita in cappa con abbigliamento protettivo adeguato.
3. Macinare la biomassa algale per 5 minuti utilizzando un pestello. Inizia con macinazione dolce e aumentare gradualmente l'intensità. Macinare la biomassa in una pasta fine e liscia nel periodo di 5 min. Se eccesso esano viene utilizzato quando si trasferisce la biomassa alla malta, è meglio attendere la esano evapori prima della macinazione.
4. Aggiungere alcuni ml di esano al mortaio e mescolare l'impasto risultante con il pestello finché non viene omogeneizzato. Assicurarsi che tutti i detriti cellulari aderito alle pareti della mortar sono bussò libero e sospeso nel liquido.
5. Trasferire la miscela esano-massa cellulare in una provetta da centrifuga. NOTA: Il tubo da centrifuga deve essere di vetro o un polimero adatto compatibile con esano come il Teflon.
6. Ripetere le fasi 2.4 e 2.5 finché tutta la biomassa è stata trasferita al tubo da centrifuga (3-5x).
7. Centrifugare il campione a 4 ° C per 20 min a 10.000 x g.
8. Pipetta con attenzione il surnatante in un metallo pre-tarato pesare piatto. Conservare nella cappa.
9. Eseguire un'estrazione 2 ^nd esano aggiungendo 3 ml di esano al pellet e vortex vigorosamente per 1 min.
10. Ripetere i punti 2.7 e 2.8. Se necessario, eseguire gli esempi per 30 minuti nella centrifuga durante la seconda estrazione per garantire che tutti i detriti cellulari deposita completamente. Determinare la massa di petrolio estratto gravimetrica dopo esano è completamente evaporata.

3. Fluorimetrica Quantificazione dei lipidi neutri Utilizzo Nile Red (come Reported da de la Hoz Siegler et al. ¹¹⁾

NOTA: Soltanto 10 ml di una sospensione algale a 5 g / L è necessario per la lettura della fluorescenza. Generalmente, l'isolamento di biomassa algale secco da 1,5 ml di brodo di coltura è più che sufficiente. Inoltre, l'intensità luminosa della lampada allo spettrofotometro può degradare nel tempo. Si raccomanda di includere standard in ogni esperimento per garantire che le variazioni dello strumento non aggiungono errore inutili alle misurazioni.

1. Preparare una soluzione Nilo rosso ad una concentrazione di 10 ug / ml disciolti in etanolo di grado reagente alcol. Conservare questa soluzione al buio a 4 ° C.
2. Preparare un 30% (v / v) di etanolo in acqua deionizzata e conservare a 4 ° C.
3. Preparare tutti i campioni algali alla stessa concentrazione di biomassa (si consiglia 5 g / L) e nello stesso modo dei campioni utilizzati nella misurazione. Per fare ciò, sia la sospensione dei campioni pre-essiccati in quantità appropriatadi tampone fosfato (0,6 g / l di potassio fosfato dibasico, 1,4 g / L di potassio fosfato monobasico), o regolando la concentrazione di una coltura algale crescente a 5 g / L di tampone fosfato dopo la misurazione della torbidità. NOTA: misure effettuate su colture algali vivi spesso hanno grande errore associato con loro a seconda della precisione della curva di calibrazione torbidità. Risospendere campioni essiccati può richiedere l'uso di un omogeneizzatore per disperdere completamente la biomassa.
4. Per ciascun campione, mescolare 80 ml di soluzione di etanolo al 30%, 10 ml di soluzione di rosso Nilo, e 10 ml di sospensione algale in un singolo pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Per rendere adeguatamente conto della variabilità della misurazione di fluorescenza, eseguire 5 repliche di ciascun campione.
5. Eseguire una curva di calibrazione a due punti con le norme preparate in precedenza, al fine di tener conto giorno per giorno le variazioni dello strumento e preparazione. Preparare gli standard per la misurazione della fluorescenza con il sProcedura ame come i campioni. NOTA: Generalmente due punti è sufficiente per la ricalibrazione dello strumento, tre punti possono essere eseguiti per verificare la linearità.
6. Eseguire le misure di fluorescenza in un multi-lettore di piastra ben spettrofotometro. Sono stati trovati i seguenti condizioni per produrre i risultati più coerenti ^11:
   1. Agitare a 1.200 rpm, orbita 3 mm per 30 sec.
   2. Incubare a 40 ° C per 10 min.
   3. Agitare a 1.200 rpm, orbita 3 mm per 30 sec.
   4. Record fluorescenza, eccitazione a 530 nm, emissione a 604 nm.
7. Convertire le misure di fluorescenza al contenuto di olio utilizzando i risultati degli standard interni.

4. Tecnica di microscopia a fluorescenza

NOTA: Il protocollo di colorazione descritto nella sezione 3 è progettato per l'analisi quantitativa, ma può anche essere utile per fornire rappresentazioni visive di tecniche basate macchie scopo didattico e illustrativo purposes. Per produrre immagini di fluorescenza del campione si richiede un microscopio ottico con fonti di trasmissione e aggiuntivi di illuminazione epifluorescenza tradizionali. Eccitazione e di emissione luce filtra nell'intervallo 530 nm (verde) e 604 nm (rosso), rispettivamente, sono necessari per la macchia rossa Nilo così come una telecamera montata microscopio con software associato. Le immagini mostrate in questo studio (Figura 1) sono state acquisite utilizzando un microscopio a campo chiaro dotato di una fotocamera e monocromatica di RGB convertitore di unità. La procedura per la produzione di immagini di fluorescenza Nile Red utilizzo di questi strumenti è descritto di seguito:

1. Preparare un campione di cultura con la macchia Nile Red secondo la sezione 3 del protocollo. NOTA: un campione nella gamma di concentrazione di 5 g / L produce diapositive di un'adeguata densità cellulare, senza sovraffollamento.
2. Dopo aver completato il punto 3.6 del protocollo di colorazione, preparare un vetrino da microscopio del campione processato secondo le procedure standard di laboratorio.
3. Partendo con il microscopio in modalità di trasmissione, caricare la slitta preparata nel microscopio, e individuare le cellule a l'ingrandimento desiderato (immagini mostrate in questo articolo sono state acquisite con l'obiettivo 100X).
4. Una volta messo a fuoco, spegnere il microscopio dalla trasmissione alla modalità di illuminazione epifluorescenza. La sorgente di luce deve ora essere provenienti direttamente dalla lente obiettivo (questo può essere confermata visivamente osservando lo spazio tra la slitta e la lente obiettivo).
5. Inserire un filtro di eccitazione verde la fonte di luce e un filtro per le emissioni rosso nel percorso ottico di osservazione; La fluorescenza delle cellule colorate dovrebbe essere direttamente visibile attraverso l'oculare.
6. Cambiare la modalità di osservazione al microscopio dall'oculare alla telecamera montata e utilizzare software di visualizzazione per catturare un'immagine delle cellule fluorescenti. A seconda della sensibilità della telecamera, il campione non si può visualizzare inizialmente nella finestra di anteprima (cioè lo schermo siessere nero); per ovviare a questo, regolare il tempo di esposizione e il guadagno della telecamera ad un livello in cui le cellule sono visibili. Impostazioni specifiche varieranno con strumenti, attrezzature e tipi di cellule.

Risultati

Cellule algali Rappresentante colorate con Nile Red colorante sono rappresentati in Figura 1. Parti A e B della figura 1 mostra immagini di A. protothecoides coltivate in eccesso di azoto, portando a molto basso accumulo di lipidi intracellulari. In parti C e D, i campioni di A. protothecoides coltivate sotto limitazione di azoto vengono visualizzati. Sotto illuminazione trasmissione, i corpi lipidici ...

Discussione

Le alghe utilizzate nella curva standard deve essere la stessa specie coltivate nelle stesse condizioni sperimentali come quelle oggetto di valutazione. Cambiamenti significativi nella composizione media, tecnica di coltivazione, e il protocollo di colorazione possono influenzare l'intensità della lettura della fluorescenza. Estrazione con esano (descritte ai punti 1 e 2) è stata utilizzata per determinare il contenuto di lipidi neutri di campioni utilizzati nella curva standard. Per misure di intensità di fluore...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry Weight
25 ml disposable pipettes	Fisher	13-676-10K
Pipette Bulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes	Fisher	05-562-16A	Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene)	Fisher	2-202B
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Storage vials	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP)	Fisher	05-562-16A	Could also use glass tubes
Pasteur Glass Pipettes	Fisher	13-678-20C
Aluminum weigh dishes	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (Alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope	Leica	DMRXA2
Microscope slides	Fisher	12-550-15
Microscope cover slips	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Imaging software	Qimaging	QCapture v.1.1.8