蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単​​かつ迅速なプロトコル

要約

ナイルレッド染色手順を使用して藻の中性脂質含有量を決定するための簡単​​なプロトコルが記載されている。この時間節約の技術は、従来の重量ベースの脂質定量化プロトコルに代わるものを提供しています。これは、バイオプロセスの性能を監視する特定の用途のために設計されている。

要約

藻類は、彼らの自然な脂質貯蔵能力による再生可能な燃料源のための優れた候補と考えられている。藻類発酵プロセスと新しいオイルが豊富な株をスクリーニングするための堅牢なモニタリングは、細胞内の脂質含有量の測定のための高速かつ信頼性の高いプロトコルが必要です。現在の慣行は、油含有量を決定するために、重量法に大きく、時間がかかり、大量の試料を必要とする数十年前に開発された技術に頼る。本稿では、ナイルレッド、多数のタイプの生物における脂質体の存在を同定するために使用されている蛍光色素は、緑色、Auxenochlorellaのprotothecoidesの中性脂質含量を測定するための、簡単、迅速、かつ信頼性の高いプロトコルに組み込まれている藻類。この方法は、染色前に細胞膜と蛍光強度測定中に試料容量を増加させる96ウェルマイクロプレートを透過性にするために、エタノール、比較的穏やかな溶媒を使用する。それがデザインされているバイオプロセスのパフォーマンスを監視する特定のアプリケーションに編成長している培養物から、以前に乾燥されたサンプルやライブのサンプルをアッセイに使用することができます。

概要

による一定のストレス条件下で脂質体を格納するためのそれらの能力のために、藻類は、潜在的な再生可能な燃料源^1,2として近年注目を集めている。中性脂質は、適切な成長条件³の下で細胞乾燥重量の60％以上を占めることができます。しかし業界では、適切にバイオプロセスのパフォーマンスを監視するために、藻類の細胞の脂質含有量を定量文化を分析し、新しい株をスクリーニングするために、シンプルなきれいな、迅速で、信頼性の高い標準化されたプロトコルを持っていません。

ブライ·ダイアー重量法は、いくつかの50年前に開発、現在^4,5使用される最も一般的な技術の中に残っている。この手順は、単純で信頼性が高く、実施が容易であるが、それは時間がかかり、大量の試料を必要とし、有毒な溶媒を使用する。これは、発酵実行から多くのサンプルを分析したり、新しい油を多く含む株をスクリーニングするための実用的ではありません。他の方法は、bは有するEENを開発するが、通常は先進的な設備を必要とし^、6を標準化されていない。

大きな関心を集めている選択肢は、ナイルレッド染色である。ナイルレッド、非極性環境で優先的蛍光を発する染料は、線虫^7、8、酵母、細菌^9、10-19および藻類を含む様々な生物における脂質体を同定または定量するために使用されている。ナイルレッドを含む初期の技術は、単一キュベット分光光度法、またはフローサイトメトリー染色を組み合わせて、主に定性的または半定量的であった。また、このような緑藻類などの藻類のいくつかのクラスは、技術¹⁰の範囲が制限されて染料に大部分が不透過性で厚い細胞井戸を持っている。

ナイルレッド染色法への最近の改善は、プロトコル^10,11の初期の欠点をバイパスすることが報告されている。カーの存在下で細胞を染色するIERは、DMSOの¹⁰系溶媒またはエタノール^10,11は、信頼性の高い定量的な測定を可能にし、油含有量と吸光度との関係を線形化する。溶媒は、ナイルレッド分子が通過できるように、細胞膜を透過性にするのに役立ちます。さらに、マイクロプレート読み取り機能を備えた分光光度計を組み込むこと定量分析に適した高スループットプロトコルを可能にする。

この記事の我々の詳細にエタノール、穏やかな溶媒の存在下でナイルレッドと文化を染色することにより、藻の油含有量を測定するための簡単​​な方法。最も正確にするために、測定におけるバックグラウンドノイズを考慮し、油含有量を蛍光強度を相関させる標準曲線は、既知油組成物の藻類細胞を用いて現像される。この方法は、以前公開されたプロトコル^10,11から採用されている。 96ウェル分光光度計を使用することにより、時間の股関節内のサンプルと同じ量を分析することができるTは、重量法により監視するために何日もかかるでしょう。さらに、所望藻類種の代表的なサンプルを使用して校正することにより、このメソッドを直接解釈可能である比較的正確な測定値を生成します。異なる株およびアプリケーション向けに最適化されたナイルレッドで藻類を染色する方法を概説し、多くのプロトコルが存在する;ここで紹介するプロトコルは、もともとデラHOZまちがいなくらによって開発されました。Auxenochlorellaのprotothecoides、クロレラ·ブルガリス 、 セネデスムスのdimorphus、及びセネデスムス斜ための^11を 、それがより多くの種やクラスのための可能性が適しているが。これは、監視、バイオプロセスのパフォーマンスの特定のアプリケーションで設計されており、それが成長している培養物から、以前に乾燥した試料と湿潤試料でも同様に動作します。

プロトコル

1。乾燥藻類バイオマスの分離は、蛍光読み取りのための基準として使用されるように

1. 乾燥バイオマスの少なくとも200ミリグラムを提供する成長藻類培養物からの試料体積を取り外し、400〜600 mgのが好ましい。
2. 万X gで10分間4℃で遠心分離サンプル。上澄み液を捨て、増殖培地と同じpHに策定リン酸緩衝液等容量のペレットを洗浄。
3. 3回の洗浄工程の全体について、手順1.2。
4. 再懸濁脱イオン水でペレットを皿の重量を量る予め秤量しに転送。 48時間50℃で乾燥させます。 NOTE：真空下で乾燥すると、乾燥時間を減少し、50°C以上の温度で培養物を乾燥させて再懸濁が困難になることができる。
5. 将来の使用のために室温で保存して乾燥させ、藻類培養。

ヘキサン抽出による中性脂質の2。重量測定定量（ブライとダイアー⁴より）

1. 量る皿に乾燥藻類バイオマスの約50ミリグラムを測定します。 NOTE：40〜80 mgの範囲の質量は、再現性を失うことなく使用することができる。
2. ヘキサンで予め洗浄乳鉢にバイオマスを転送します。必要であれば、完全に乳鉢にバイオマスを転送するために、パスツールピペットを用いて少量のヘキサン（1ml）で秤量皿を洗浄する。注：ヘキサン揮発性の高い有毒物質である。それは適切な防護服とドラフト内で処理する必要があります。
3. 乳棒を用いて5分間藻類バイオマスを挽く。穏やかな研削で始まり、徐々に強度を増加させる。 5分間で、微細で滑らかなペースト状にバイオマスを挽く。乳鉢にバイオマスを転送する際に、過剰のヘキサンを使用する場合は、ヘキサン、研削前に蒸発するのを待つのが最善である。
4. それが均質化されるまで、乳鉢にヘキサン数mlを加え、乳棒で得られたスラリーを混合する。すべての細胞破片がMORの壁に付着していることを確認してくださいタールは、遊離ノックして、液体中に懸濁する。
5. 遠心管にヘキサン細胞量混合物を転送します。注：遠心管は、ガラスやテフロンなどヘキサンと互換性の適切なポリマーのいずれかである必要があります。
6. すべてのバイオマスが遠心管（3-5X）に転送されるまで繰り返します2.4と2.5を繰り返します。
7. 遠心10,000倍gで20分間4℃で試料。
8. 慎重に、予め秤量した金属の皿の重さに、上清をピペットで。ドラフト内で保管してください。
9. ペレットにヘキサンの3ミリリットルを加えて、1分間激しくボルテックスして2 ^回目のヘキサン抽出を行う。
10. 繰り返します2.7と2.8を繰り返します。必要に応じて、すべての細胞破片が完全に安定することを確認するために第二の抽出の際に遠心分離器で30分間のサンプルを実行します。ヘキサンが完全に蒸発した後に重量測定抽出された油の質量を決定する。

ナイルレッドを使用した中性脂質の3。蛍光定量（Reporとしてテッド·デ·ラ·HOZまちがいなくら ¹¹による）

注：5グラム/ Lの藻類懸濁液のみ10μlの蛍光読み取りのために必要とされる。一般的には、培養液の1.5ミリリットルから乾燥藻バイオマスの分離は十分ではありません。また、分光光度計でのランプの光強度は経時的に分解することができる。これは、機器の変化が測定値に不必要なエラーを追加しないことを保証するためにすべての実験で基準を含めることをお勧めします。

1. アルコール試薬グレードのエタノールに溶解した10μgの/ mlの濃度でナイルレッド溶液を調製する。 4℃の暗所でこのソリューションを保存する
2. 4℃の脱イオン水およびストア内の30％（v / v）エタノール溶液を調製
3. 同じバイオマス濃度全く藻類のサンプルを準備します（5グラム/ Lをお勧めします）と測定で使用される規格と同様に。適切な量​​のいずれかで中断予備乾燥したサンプルでこれを行うリン酸緩衝液（0.6グラム/ Lのリン酸カリウム二塩基、1.4グラム/ Lのリン酸二水素カリウム）、または濁度を測定した後、リン酸緩衝液では5g / Lまで成長藻類培養物の濃度を調整する。注：ライブ藻類培養物に対して実行される測定は、多くの場合、濁度検量線の精度によって、それらに関連する大きな誤差を持つことになります。乾燥サンプルを再懸濁する完全にバイオマスを分散させるホモジナイザの使用を必要とし得る。
4. 各サンプルについて、96ウェルプレートの単一のウェル中の30％エタノール溶液80μL、ナイルレッド溶液10μl、および藻類懸濁液10μlを混ぜて。適切に蛍光測定のばらつきを考慮するために、各試料の5回の反復を実行する。
5. 楽器と準備中の日々の変動を考慮するために、以前に調製した標準との2点較正曲線を実行します。秒を用いた蛍光測定のための標準を調製サンプルとしてAME手順。注：一般的に2つの点が、機器の再校正のために十分である、3点が直線性を検証するために実行することができます。
6. マルチウェルプレートリーダー分光光度計で蛍光測定を行う。以下の条件が最も安定した結果^11が得られることが分かった。
   1. 30秒間、1,200 rpmで、軌道3ミリメートルで振る。
   2. 10分間40℃でインキュベートする。
   3. 30秒間、1,200 rpmで、軌道3ミリメートルで振る。
   4. レコード蛍光、530nmでの励起、604 nmでの発光。
7. 蛍光測定は、内部標準からの結果を使用して、油含有量へ変換する。

4。蛍光顕微鏡法

NOTE：項3に記載の染色プロトコルは、定量分析のために設計され、それはまた、教育、例示puのための染色に基づいた技術の視覚表現を提供するのに有用であり得るrposes。サンプルの蛍光1の画像を生成するためには、従来の伝送および追加の落射蛍光照明光源と光学顕微鏡を必要とします。 530ナノメートル（緑）、604ナノメートル（赤）の範囲内の励起および発光光フィルターは、それぞれ、ナイルレッド染色だけでなく、関連するソフトウェアを有する顕微鏡に取り付けられたカメラのために必要とされる。この研究（ 図1）に示す画像は、RGB変換部にモノクロカメラとを備えた明視野顕微鏡を用いて取得した。これらのツールを使用してナイルレッド蛍光画像を生成するための手順を以下に概説する。

1. プロトコルのセクション3に係るナイルレッド染色で培養試料を準備します。 NOTE：5g / Lの濃度範囲の試料が過密することなく、適切な細胞密度のスライドを生成する。
2. 染色プロトコールのステップ3.6を完了した後、標準的な実験手順に従って処理された試料の顕微鏡スライドを準備する。
3. 透過モードで顕微鏡を皮切りに、顕微鏡にプレパラートをロードし、（この記事に示されている画像は、100Xの目的で取得された）所望の倍率で細胞を探します。
4. 集中すると、落射蛍光照明モードへの送信から顕微鏡を切り替える。光源は、現在の対物レンズ（このスライドと対物レンズとの間の空間を観察することによって視覚的に確認することができる）から直接来るべきである。
5. 観察光路に、光源と、赤色発光フィルタに緑色励起フィルターを挿入する;染色された細胞の蛍光は、今接眼レンズを介して直接表示されるはずです。
6. 車載カメラに接眼から顕微鏡観察モードを切り替えて蛍光を発する細胞の画像をキャプチャするために閲覧ソフトウェアを使用しています。カメラの感度に応じて、サンプルが最初に（ つまり画面の意志プレビューウィンドウに表示されない場合があります）黒;これを改善するために、細胞が見えるレベルまで露出時間やカメラのゲインを調整します。具体的な設定は、機器·設備、および細胞型によって変化するであろう。

結果

ナイルレッド染料で染色した代表的な藻体を図1に示されている。A. 図1の表示画像のパーツA及びB protothecoidesは非常に低い細胞内脂質の蓄積につながる、過剰窒素中で増殖させた。部品CとD、Aのサンプルにおける窒素制限下で増殖させprotothecoidesが示されている。透過照明の下では、細胞の?...

ディスカッション

標準曲線に使用される藻類は測定されているものと同じ実験条件下で栽培し、同じ種でなければなりません。有意な培地組成の変化、栽培技術、および染色プロトコルが蛍光読み取りの強度に影響を与えることができる。 （セクション1および2に記載されている）ヘキサン抽出は、標準曲線に使用した試料の中性脂質含量を測定した。正確な蛍光強度測定のために、すべてのサンプルが同じ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry Weight
25 ml disposable pipettes	Fisher	13-676-10K
Pipette Bulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes	Fisher	05-562-16A	Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene)	Fisher	2-202B
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Storage vials	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP)	Fisher	05-562-16A	Could also use glass tubes
Pasteur glass pipettes	Fisher	13-678-20C
Aluminum weigh dishes	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope	Leica	DMRXA2
Microscope slides	Fisher	12-550-15
Microscope cover slips	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Imaging software	Qimaging	QCapture v.1.1.8