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Method Article
Un protocole simple de déterminer la teneur en lipide neutre de cellules d'algues en utilisant une procédure de coloration rouge Nil est décrite. Cette technique de gagner du temps offre une alternative aux protocoles de quantification des lipides traditionnels à base gravimétriques. Il a été conçu pour une application spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance.
Les algues sont considérés comme d'excellents candidats pour les sources de carburants renouvelables en raison de leurs capacités de stockage des lipides naturels. Un suivi rigoureux des processus de fermentation des algues et le dépistage de nouvelles souches riches en pétrole nécessite un protocole rapide et fiable pour la détermination de la teneur en lipides intracellulaires. Les pratiques actuelles reposent en grande partie sur les méthodes gravimétriques pour déterminer la teneur en huile, techniques développées il ya des décennies qui sont de temps et nécessitent de grands volumes d'échantillons. Dans le présent document, le rouge Nil, un colorant fluorescent qui a été utilisé pour identifier la présence de corps lipidiques dans de nombreux types d'organismes, est incorporé dans un protocole simple, rapide et fiable pour la mesure de la teneur en lipides neutres de protothecoides Auxenochlorella, un vert algue. Le procédé utilise de l'éthanol, un solvant relativement doux, pour perméabiliser la membrane cellulaire avant coloration et un puits de micro-plaques 96 pour augmenter la capacité de l'échantillon pendant les mesures d'intensité de fluorescence. Il a été la conceptioned à la demande spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance. Échantillons préalablement séchés ou des échantillons vivants à partir d'une culture en croissance peuvent être utilisées dans le dosage.
En raison de leur capacité à stocker corps lipidiques sous certaines conditions de stress, les algues ont reçu beaucoup d'attention ces dernières années comme une source de carburant renouvelable potentiel de 1,2. Lipides neutres peuvent représenter plus de 60% du poids sec de la cellule dans des conditions de croissance appropriées 3. Pourtant, l'industrie n'a pas de protocole simple, propre, rapide, fiable et standardisée pour quantifier la teneur en lipides des cellules d'algues afin de surveiller correctement le rendement des bioprocédés, analyser les cultures, et l'écran de nouvelles souches.
La méthode gravimétrique Bligh-Dyer développé il ya 50 ans reste parmi les techniques les plus couramment utilisés aujourd'hui 4,5. Bien que cette procédure est simple, fiable et facile à mettre en oeuvre, il prend du temps, nécessite de grands volumes d'échantillons, et rend l'utilisation de solvants toxiques. Il n'est pas pratique pour l'analyse de nombreux échantillons à partir d'un essai de fermentation ou de criblage de nouvelles souches riches en huile. D'autres méthodes ont been développé, mais le plus souvent besoin d'équipement de pointe et n'ont pas été normalisés 6.
Une alternative qui a suscité beaucoup d'intérêt est la tache rouge Nil. Nile Red, un colorant qui émet une fluorescence de manière préférentielle dans des milieux non polaires, a été utilisée pour identifier ou quantifier les corps lipidiques dans différents organismes, y compris des nématodes 7, 8 levures, les bactéries et les algues 9, 10-19. Techniques initiales impliquant Nil Rouge étaient essentiellement qualitative ou semi-quantitative, combinant la tache avec une seule cuvette spectrophotométrie ou la cytométrie de flux. En outre, certaines classes d'algues telles que les algues vertes ont des puits de cellules d'épaisseur qui sont essentiellement imperméable au colorant, ce qui limite la portée de la technique 10.
Récentes améliorations apportées à la méthode de coloration rouge Nil ont été signalés qui contournent les lacunes initiales du protocole 10,11. La coloration des cellules en présence d'un carrier solvant tel que le DMSO 10 ou éthanol 10,11 linéarise la relation entre la teneur en huile et l'absorbance, ce qui permet des mesures quantitatives fiables. Le solvant permet de perméabiliser la membrane cellulaire de façon que les molécules Nile Red peuvent passer à travers. En outre, l'incorporation d'un spectrophotomètre avec des capacités de lecture de micro-plaque permet protocoles à haut débit appropriés pour l'analyse quantitative.
En ce détail article de nous une méthode simple pour mesurer la teneur en huile des cellules algales par coloration cultures avec Nil Rouge en présence d'éthanol, un solvant doux. Afin d'expliquer plus précisément pour le bruit de fond dans les mesures, d'une courbe standard corréler l'intensité de fluorescence à la teneur en huile est développée à l'aide de cellules d'algues composition d'huile connue. La méthode est une adaptation de protocoles précédemment publiés 10,11. En utilisant un spectrophotomètre à 96 puits, on est capable d'analyser la même quantité d'échantillons dans un tha heuresl faudrait jours pour surveiller par des méthodes gravimétriques. En outre, par une calibration en utilisant des échantillons représentatifs de l'espèce algale désiré ce procédé produit des mesures relativement précises qui sont directement interprétables. Il existe de nombreux protocoles décrivant les méthodes de coloration des algues avec Red Nil optimisé pour différentes souches et des applications; le protocole présenté ici a été développé à l'origine par de la Hoz Siegler et al. 11 pour protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, et Scenedesmus obliquus, mais il est probable approprié pour de nombreuses autres espèces et les classes. Il a été conçu à la demande spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance et il fonctionne aussi bien pour les échantillons préalablement séchés et des échantillons humides à partir d'une culture de plus en plus.
1. Isolation de sec biomasse algale à servir de normes pour fluorescence Lectures
2. Quantification gravimétrique des lipides neutres par hexane Extraction (Adapté de Bligh et Dyer 4)
3. Fluorometric quantification des lipides neutres Utilisation Nil Rouge (comme Rapported par de la Hoz Siegler et al. 11)
NOTE: Seuls 10 pi d'une suspension d'algues à 5 g / L est nécessaire pour la lecture de fluorescence. En général, l'isolement de la biomasse d'algues sèches de 1,5 ml de bouillon de culture est plus que suffisante. Par ailleurs, l'intensité lumineuse de la lampe dans le spectrophotomètre peut se dégrader au fil du temps. Il est recommandé d'inclure des normes dans chaque expérience pour assurer que les variations de l'instrument n'ajoutent pas d'erreur inutile aux mesures.
4. Technique microscopie de fluorescence
REMARQUE: Le protocole de coloration décrit dans l'article 3 est conçu pour l'analyse quantitative, mais il peut aussi être utile de fournir des représentations visuelles des techniques basées taches pour unité centrale d'éducation et d'illustrationrposes. Pour produire des images de l'échantillon fluorescence nécessite un microscope optique avec des sources de transmission et d'éclairage à épifluorescence plus traditionnels. Excitation et d'émission filtres de lumière dans le 530 nm (vert) et 604 nm (rouge) gamme, respectivement, sont nécessaires pour la tache rouge du Nil ainsi que d'une caméra montée au microscope avec un logiciel associé. Les images présentées dans cette étude (figure 1) ont été acquises à l'aide d'un microscope en champ clair équipé d'une caméra et monochrome à l'unité de convertisseur RGB. Le procédé de production du Nil Red images de fluorescence à l'aide de ces outils est décrit ci-dessous:
Cellules d'algues représentatives colorées avec le colorant rouge Nil sont illustrés dans la Figure 1. Parties A et B de la figure 1 images d'affichage de A. protothecoides cultivées dans un excès d'azote, conduisant à très faible accumulation de lipides intracellulaires. Dans les parties C et D, des échantillons de A. protothecoides cultivées sous limitation d'azote sont prés...
Les algues utilisées dans la courbe standard doit être les mêmes espèces cultivées dans les mêmes conditions expérimentales que celles qui sont mesurées. Des changements significatifs dans la composition du milieu, la technique de la culture, et le protocole de coloration peuvent influer sur l'intensité de la lecture de fluorescence. extraction à l'hexane (décrit dans les sections 1 et 2) a été utilisé pour déterminer la teneur en lipide neutre d'échantillons utilisés dans la courbe standard...
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Les auteurs tiennent à remercier le Conseil de recherches en sciences naturelles et de fournir un soutien financier à ce projet.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dry Weight | |||
25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
Gravimetric Quantification | |||
Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
Hexanes | Fisher | H292-4 | |
Fluorometric quantification of oil content | |||
Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
Imaging Fluorescent cells | |||
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
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