Une simple et rapide Protocole de mesure de lipides neutres dans les cellules algales par fluorescence

Résumé

Un protocole simple de déterminer la teneur en lipide neutre de cellules d'algues en utilisant une procédure de coloration rouge Nil est décrite. Cette technique de gagner du temps offre une alternative aux protocoles de quantification des lipides traditionnels à base gravimétriques. Il a été conçu pour une application spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance.

Résumé

Les algues sont considérés comme d'excellents candidats pour les sources de carburants renouvelables en raison de leurs capacités de stockage des lipides naturels. Un suivi rigoureux des processus de fermentation des algues et le dépistage de nouvelles souches riches en pétrole nécessite un protocole rapide et fiable pour la détermination de la teneur en lipides intracellulaires. Les pratiques actuelles reposent en grande partie sur les méthodes gravimétriques pour déterminer la teneur en huile, techniques développées il ya des décennies qui sont de temps et nécessitent de grands volumes d'échantillons. Dans le présent document, le rouge Nil, un colorant fluorescent qui a été utilisé pour identifier la présence de corps lipidiques dans de nombreux types d'organismes, est incorporé dans un protocole simple, rapide et fiable pour la mesure de la teneur en lipides neutres de protothecoides Auxenochlorella, un vert algue. Le procédé utilise de l'éthanol, un solvant relativement doux, pour perméabiliser la membrane cellulaire avant coloration et un puits de micro-plaques 96 pour augmenter la capacité de l'échantillon pendant les mesures d'intensité de fluorescence. Il a été la conceptioned à la demande spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance. Échantillons préalablement séchés ou des échantillons vivants à partir d'une culture en croissance peuvent être utilisées dans le dosage.

Introduction

En raison de leur capacité à stocker corps lipidiques sous certaines conditions de stress, les algues ont reçu beaucoup d'attention ces dernières années comme une source de carburant renouvelable potentiel ^{de 1,2.} Lipides neutres peuvent représenter plus de 60% ​​du poids sec de la cellule dans des conditions de croissance appropriées ^3. Pourtant, l'industrie n'a pas de protocole simple, propre, rapide, fiable et standardisée pour quantifier la teneur en lipides des cellules d'algues afin de surveiller correctement le rendement des bioprocédés, analyser les cultures, et l'écran de nouvelles souches.

La méthode gravimétrique Bligh-Dyer développé il ya 50 ans reste parmi les techniques les plus couramment utilisés aujourd'hui ^4,5. Bien que cette procédure est simple, fiable et facile à mettre en oeuvre, il prend du temps, nécessite de grands volumes d'échantillons, et rend l'utilisation de solvants toxiques. Il n'est pas pratique pour l'analyse de nombreux échantillons à partir d'un essai de fermentation ou de criblage de nouvelles souches riches en huile. D'autres méthodes ont been développé, mais le plus souvent besoin d'équipement de pointe et n'ont pas été normalisés ^6.

Une alternative qui a suscité beaucoup d'intérêt est la tache rouge Nil. Nile Red, un colorant qui émet une fluorescence de manière préférentielle dans des milieux non polaires, a été utilisée pour identifier ou quantifier les corps lipidiques dans différents organismes, y compris des nématodes ^{7, 8} levures, les bactéries et les algues ^{9, 10-19.} Techniques initiales impliquant Nil Rouge étaient essentiellement qualitative ou semi-quantitative, combinant la tache avec une seule cuvette spectrophotométrie ou la cytométrie de flux. En outre, certaines classes d'algues telles que les algues vertes ont des puits de cellules d'épaisseur qui sont essentiellement imperméable au colorant, ce qui limite la portée de la technique ^10.

Récentes améliorations apportées à la méthode de coloration rouge Nil ont été signalés qui contournent les lacunes initiales du protocole ^10,11. La coloration des cellules en présence d'un carrier solvant tel que le DMSO ¹⁰ ou éthanol ^10,11 linéarise la relation entre la teneur en huile et l'absorbance, ce qui permet des mesures quantitatives fiables. Le solvant permet de perméabiliser la membrane cellulaire de façon que les molécules Nile Red peuvent passer à travers. En outre, l'incorporation d'un spectrophotomètre avec des capacités de lecture de micro-plaque permet protocoles à haut débit appropriés pour l'analyse quantitative.

En ce détail article de nous une méthode simple pour mesurer la teneur en huile des cellules algales par coloration cultures avec Nil Rouge en présence d'éthanol, un solvant doux. Afin d'expliquer plus précisément pour le bruit de fond dans les mesures, d'une courbe standard corréler l'intensité de fluorescence à la teneur en huile est développée à l'aide de cellules d'algues composition d'huile connue. La méthode est une adaptation de protocoles précédemment publiés ^10,11. En utilisant un spectrophotomètre à 96 puits, on est capable d'analyser la même quantité d'échantillons dans un tha heuresl faudrait jours pour surveiller par des méthodes gravimétriques. En outre, par une calibration en utilisant des échantillons représentatifs de l'espèce algale désiré ce procédé produit des mesures relativement précises qui sont directement interprétables. Il existe de nombreux protocoles décrivant les méthodes de coloration des algues avec Red Nil optimisé pour différentes souches et des applications; le protocole présenté ici a été développé à l'origine par de la Hoz Siegler et al. ¹¹ pour protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, et Scenedesmus obliquus, mais il est probable approprié pour de nombreuses autres espèces et les classes. Il a été conçu à la demande spécifique de la performance des bioprocédés de surveillance et il fonctionne aussi bien pour les échantillons préalablement séchés et des échantillons humides à partir d'une culture de plus en plus.

Protocole

1. Isolation de sec biomasse algale à servir de normes pour fluorescence Lectures

1. Supprimer un volume d'échantillon de la culture d'algues croissante qui fournira au moins 200 mg de biomasse sèche, 400-600 mg est préférable.
2. Extrait Centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 10 000 x g. Jeter le surnageant et laver le culot avec un volume égal de tampon phosphate formulé pour le même pH que le milieu de croissance.
3. Répétez l'étape 1.2 pour un total de 3 étapes de lavage.
4. Re-suspendre le culot dans de l'eau déminéralisée et transférer dans un plat préalablement pesé peser. Laissez sécher à 50 ° C pendant 48 heures. NOTE: Le séchage sous vide diminue le temps de séchage et le séchage de la culture à des températures supérieures à 50 ° C peut, par remise en suspension difficile.
5. Séché magasins algues cultures à la température ambiante pour une utilisation future.

2. Quantification gravimétrique des lipides neutres par hexane Extraction (Adapté de Bligh et Dyer ⁴⁾

1. Mesurer environ 50 mg de biomasse d'algues sèches dans un plat peser. REMARQUE: messes allant de 40 à 80 mg peuvent être utilisés sans perte de reproductibilité.
2. Transférer la biomasse à un mortier pré-lavé avec de l'hexane. Le cas échéant, laver le plat peser avec une petite quantité (1 ml) d'hexane à l'aide d'une pipette Pasteur afin de transférer totalement la biomasse au mortier. NOTE: L'hexane est une substance hautement volatile et toxique. Il doit être manipulé dans la hotte avec des vêtements de protection appropriés.
3. Broyer la biomasse algale pendant 5 minutes à l'aide d'un pilon. Commencez par broyage doux et augmenter progressivement l'intensité. Broyer la biomasse dans une pâte fine et lisse dans la période de 5 min. Si un excès d'hexane est utilisé lors du transfert de la biomasse dans le mortier, il est préférable d'attendre que l'hexane s'évaporer avant le broyage.
4. Ajouter quelques ml d'hexane pour le mortier et mélanger la suspension résultante avec le pilon jusqu'à ce qu'elle soit homogénéisée. Assurez-vous que tous les débris cellulaires adhère aux parois de la mortar sont frappé libre et en suspension dans le liquide.
5. Transférer le mélange de la masse de l'hexane-cellules dans un tube de centrifugeuse. NOTE: Le tube de centrifugation doit être en verre ou en un polymère approprié compatible avec de l'hexane tel que le Teflon.
6. Répéter les étapes 2.4 et 2.5 jusqu'à ce que toute la biomasse a été transféré dans le tube de centrifugation (3-5x).
7. Centrifuger l'échantillon à 4 ° C pendant 20 min à 10 000 x g.
8. Pipette avec précaution le surnageant dans un métal pré-pesée peser plat. Stocker dans la hotte.
9. Effectuer une extraction par l'hexane 2 ^ème ajout de 3 ml d'hexane à la pastille et vigoureusement au vortex pendant 1 minute.
10. Répétez les étapes 2.7 et 2.8. Si nécessaire, exécutez les échantillons pendant 30 min dans la centrifugeuse pendant la seconde extraction pour s'assurer que tous les débris cellulaires s'installe entièrement. Déterminer la masse d'huile extraite par gravimétrie après hexane s'évapore.

3. Fluorometric quantification des lipides neutres Utilisation Nil Rouge (comme Rapported par de la Hoz Siegler et al. ¹¹⁾

NOTE: Seuls 10 pi d'une suspension d'algues à 5 g / L est nécessaire pour la lecture de fluorescence. En général, l'isolement de la biomasse d'algues sèches de 1,5 ml de bouillon de culture est plus que suffisante. Par ailleurs, l'intensité lumineuse de la lampe dans le spectrophotomètre peut se dégrader au fil du temps. Il est recommandé d'inclure des normes dans chaque expérience pour assurer que les variations de l'instrument n'ajoutent pas d'erreur inutile aux mesures.

1. Préparer une solution rouge Nil à une concentration de 10 pg / ml dissous dans de l'éthanol de qualité réactif à l'alcool. Conserver cette solution dans l'obscurité à 4 ° C.
2. Préparer une solution à 30% (v / v) d'éthanol dans de l'eau déminéralisée et stocker à 4 ° C.
3. Préparer tous les échantillons d'algues à la même concentration de la biomasse (il est recommandé de 5 g / L) et de la même manière que les critères utilisés dans l'évaluation. Pour ce faire, soit par des échantillons de suspension pré-séchés dans la quantité appropriéede tampon phosphate (0,6 g / L de phosphate de potassium dibasique, 1,4 g / L de phosphate de potassium monobasique), ou en ajustant la concentration d'une culture d'algues en croissance à 5 g / L de tampon phosphate après la mesure de la turbidité. REMARQUE: Les mesures effectuées sur des cultures d'algues vivantes auront souvent plus grande erreur qui leur est associé en fonction de la précision de la courbe d'étalonnage de la turbidité. La remise en suspension des échantillons secs peut nécessiter l'utilisation d'un homogénéisateur pour disperser complètement la biomasse.
4. Pour chaque échantillon, mélanger 80 ul de la solution d'éthanol à 30%, 10 ul de la solution rouge Nil, et 10 ul de suspension d'algues dans un seul puits d'une plaque à 96 puits. Afin de bien rendre compte de la variabilité de la mesure de fluorescence, effectuer 5 répétitions de chaque échantillon.
5. Exécutez une courbe d'étalonnage en deux points aux normes préalablement préparés afin de tenir compte des variations au jour le jour de l'instrument et de la préparation. Préparer les étalons pour la mesure de la fluorescence à l'aide de la sProcédure ame que les échantillons. REMARQUE: En général, deux points est suffisant pour un recalibrage de l'instrument, trois points peuvent être exécutés pour vérifier la linéarité.
6. Effectuer les mesures de fluorescence dans un multi-puits lecteur de plaque spectrophotomètre. Les conditions suivantes ont été trouvées pour obtenir les résultats les plus cohérents ^11:
   1. Agiter à 1200 rpm, orbite 3 mm, pour 30 sec.
   2. Incuber à 40 ° C pendant 10 min.
   3. Agiter à 1200 rpm, orbite 3 mm, pour 30 sec.
   4. fluorescence d'enregistrement, l'excitation à 530 nm, émission à 604 nm.
7. Convertir les mesures de fluorescence à la teneur en huile en utilisant les résultats des étalons internes.

4. Technique microscopie de fluorescence

REMARQUE: Le protocole de coloration décrit dans l'article 3 est conçu pour l'analyse quantitative, mais il peut aussi être utile de fournir des représentations visuelles des techniques basées taches pour unité centrale d'éducation et d'illustrationrposes. Pour produire des images de l'échantillon fluorescence nécessite un microscope optique avec des sources de transmission et d'éclairage à épifluorescence plus traditionnels. Excitation et d'émission filtres de lumière dans le 530 nm (vert) et 604 nm (rouge) gamme, respectivement, sont nécessaires pour la tache rouge du Nil ainsi que d'une caméra montée au microscope avec un logiciel associé. Les images présentées dans cette étude (figure 1) ont été acquises à l'aide d'un microscope en champ clair équipé d'une caméra et monochrome à l'unité de convertisseur RGB. Le procédé de production du Nil Red images de fluorescence à l'aide de ces outils est décrit ci-dessous:

1. Préparer un échantillon de la culture avec la tache rouge Nil conformément à l'article 3 du protocole. REMARQUE: un échantillon de 5 g / L gamme de concentration produit des lames de densité adéquate des cellules sans surpopulation.
2. Après avoir terminé l'étape 3.6 du protocole de coloration, préparer une lame de microscope de l'échantillon traité selon les procédures standard de laboratoire.
3. En commençant par le microscope en transmission, charger la lame préparée dans le microscope, et de localiser les cellules à l'agrandissement souhaité (images présentées dans cet article ont été acquis avec l'objectif 100X).
4. Une fois la mise, passer le microscope de transmission en mode d'éclairage à épifluorescence. La source lumineuse doit maintenant être vient directement de la lentille d'objectif (ce qui peut être confirmé par l'observation visuelle de l'espace entre la lame et la lentille d'objectif).
5. Insérer un filtre d'excitation verte dans la source de lumière et un filtre d'émission de rouge dans le trajet de lumière d'observation; la fluorescence des cellules colorées devrait maintenant être directement visible à travers l'oculaire.
6. Changez le mode de l'observation au microscope de l'oculaire de l'appareil photo monté et utiliser un logiciel de visualisation pour capturer une image des cellules fluorescentes. Selon la sensibilité de la caméra, l'échantillon peut ne pas apparaître d'abord dans la fenêtre d'aperçu (c'est à dire l'écranêtre noir); pour remédier à cela, ajuster le temps et le gain de l'appareil d'exposition à un niveau où les cellules sont visibles. Paramètres spécifiques varient selon les instruments, du matériel et des types de cellules.

Résultats

Cellules d'algues représentatives colorées avec le colorant rouge Nil sont illustrés dans la Figure 1. Parties A et B de la figure 1 images d'affichage de A. protothecoides cultivées dans un excès d'azote, conduisant à très faible accumulation de lipides intracellulaires. Dans les parties C et D, des échantillons de A. protothecoides cultivées sous limitation d'azote sont prés...

Discussion

Les algues utilisées dans la courbe standard doit être les mêmes espèces cultivées dans les mêmes conditions expérimentales que celles qui sont mesurées. Des changements significatifs dans la composition du milieu, la technique de la culture, et le protocole de coloration peuvent influer sur l'intensité de la lecture de fluorescence. extraction à l'hexane (décrit dans les sections 1 et 2) a été utilisé pour déterminer la teneur en lipide neutre d'échantillons utilisés dans la courbe standard...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry Weight
25 ml disposable pipettes	Fisher	13-676-10K
Pipette Bulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes	Fisher	05-562-16A	Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene)	Fisher	2-202B
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Storage vials	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP)	Fisher	05-562-16A	Could also use glass tubes
Pasteur glass pipettes	Fisher	13-678-20C
Aluminum weigh dishes	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope	Leica	DMRXA2
Microscope slides	Fisher	12-550-15
Microscope cover slips	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Imaging software	Qimaging	QCapture v.1.1.8