Um simples e rápido protocolo para medir lipídios neutros em algas células usando fluorescência

Resumo

Um protocolo simples para determinar o teor de lípidos neutros de células de algas com um procedimento de coloração com Vermelho do Nilo é descrito. Esta técnica de poupança de tempo, oferece uma alternativa aos protocolos de quantificação de lípidos tradicionais à base gravimétrica. Ele foi projetado para a aplicação específica do desempenho do monitoramento de bioprocessos.

Resumo

As algas são consideradas excelentes candidatos para as fontes de combustível renováveis, devido às suas capacidades de armazenamento de lipídios naturais. Monitoramento robusto de processos de fermentação de algas e de triagem para novas linhagens ricas em petróleo requer um protocolo rápido e confiável para a determinação do teor de lipídios intracelulares. As práticas atuais dependem em grande parte de métodos gravimétricos para determinar o teor de óleo, técnicas desenvolvidas décadas atrás, que são demoradas e exigem grandes volumes de amostra. Neste papel, Vermelho do Nilo, um corante fluorescente que foi usado para identificar a presença de corpos de lípidos em vários tipos de organismos, é incorporado um protocolo simples, rápido e fiável para a medição do teor de lípidos neutros de protothecoides Auxenochlorella, um verde alga. O método utiliza o etanol, um solvente relativamente suave, para permeabilizar a membrana da célula, antes da coloração e uma de 96 cavidades de micro-placa para aumentar a capacidade da amostra durante as medições da intensidade de fluorescência. Ele foi projetoed com a aplicação específica do desempenho do monitoramento de bioprocessos. As amostras previamente secas ou amostras vivas de uma cultura de crescimento pode ser utilizado no ensaio.

Introdução

Devido à sua capacidade de armazenar corpos lipídicos sob certas condições de estresse, as algas têm recebido uma grande atenção nos últimos anos como uma potencial fonte de combustível renovável ^1,2. Lípidos neutros pode representar mais de 60% ​​do peso seco da célula sob condições de crescimento apropriadas ^3. No entanto, a indústria não tem um protocolo padronizado simples, limpo, rápido e confiável para quantificar o conteúdo lipídico de células de algas, a fim de monitorar adequadamente o desempenho de bioprocessos, analisar as culturas, e na tela de novas linhagens.

O método gravimétrico Bligh-Dyer desenvolvido há 50 anos permanece entre as técnicas mais comuns usados ​​hoje ^4,5. Enquanto este processo é simples, confiável e fácil de transportar para fora, que é demorada, necessita grandes volumes de amostra, e faz uso de solventes tóxicos. Não é prático para analisar muitas amostras de uma corrida de fermentação ou a triagem para novas linhagens ricas em petróleo. Outros métodos têm been desenvolvido, mas geralmente necessitam de equipamento avançado e não foram normalizados ^6.

Uma alternativa que tem atraído uma grande quantidade de interesse é a mancha Nilo Vermelho. Vermelho do Nilo, um corante que fluoresce preferencialmente em ambientes não-polar, foi utilizado para identificar ou quantificar corpos de lípidos em vários organismos incluindo nemátodos ^{7, 8} leveduras, bactérias e algas ^{9, 10-19.} Técnicas iniciais envolvendo Nilo Red eram na maior parte qualitativa ou semi-quantitativa, combinando a mancha com uma única tina espectrofotometria ou citometria de fluxo. Além disso, algumas classes de algas, tais como algas verdes têm poços com células de espessura, que são principalmente impermeável à do corante, que limitam o alcance da técnica ^10.

As recentes melhorias para o método de coloração Vermelho do Nilo foram relatados que ignorar as deficiências iniciais do protocolo ^10,11. Coloração das células na presença de um carrier solvente tal como DMSO a ¹⁰ ou ^10,11 etanol lineariza a relação entre o teor de óleo e de absorção, permitindo medições quantitativos fiáveis. O solvente ajuda a permeabilizar a membrana da célula de modo a que as moléculas de Nile Red pode passar. Além disso, a incorporação de um espectrofotómetro com capacidade de leitura de micro-placa permite protocolos adequados de alto rendimento para a análise quantitativa.

Neste artigo, detalhe um método simples para medir o teor de óleo de células de algas por coloração de culturas com Vermelho do Nilo, na presença de etanol, um solvente leve. A fim de mais precisão representam ruído de fundo nas medições, uma curva padrão relacionando a intensidade de fluorescência para o teor de óleo é desenvolvido utilizando células de algas da composição de óleo conhecidos. O método é adaptado a partir de protocolos publicados anteriormente ^10,11. Usando um espectrofotómetro de 96 poços, é capaz de analisar a mesma quantidade de amostras num tha horat levaria dias para monitorar por métodos gravimétricos. Além disso, através da calibração com amostras representativas das espécies de algas desejado este método produz medições relativamente precisas que são directamente interpretável. Existem muitos protocolos descrevendo os métodos de coloração de algas com Nile Red otimizado para diferentes cepas e aplicações; o protocolo aqui apresentado foi desenvolvido originalmente por de la Hoz Siegler et al. ¹¹ para protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus e Scenedesmus oblíquo, embora seja provável adequado para muitas outras espécies e classes. Ele foi projetado com a aplicação específica de desempenho de monitoramento de bioprocessos e funciona igualmente bem para amostras previamente secas e molhadas amostras de uma crescente cultura.

Protocolo

1. Isolamento de seco de algas biomassa a ser utilizadas como padrões de fluorescência Leituras

1. Retirar um volume de amostra a partir da cultura de crescimento de algas que vai proporcionar, pelo menos, 200 mg de biomassa seca, 400-600 mg é preferível.
2. Amostra Centrifugar a 4 ° C durante 10 min a 10.000 x g. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com um volume igual de tampão fosfato formulado para o mesmo pH que o meio de crescimento.
3. Repita o passo 1.2 para um total de 3 etapas de lavagem.
4. Re-suspender a pelete em água desionizada e transferir para um prato pré-pesado pesar. Deixar secar a 50 ° C durante 48 hr. NOTA: A secagem sob vácuo irá diminuir o tempo de secagem e a secagem da cultura, a temperaturas acima de 50 ° C, pode tornar difícil a ressuspensão.
5. Armazenar seco de algas culturas à temperatura ambiente para uso futuro.

2. Quantificação gravimétrica de lipídios neutros por hexano Extraction (Adaptado de Bligh e Dyer ⁴⁾

1. Medir aproximadamente 50 mg de biomassa algal seco em um prato de pesar. NOTA: Massas variando 40-80 mg pode ser utilizado sem perda de reprodutibilidade.
2. Transferir a biomassa para um almofariz pré-lavado com hexano. Se necessário, lavar a louça pesar com uma pequena quantidade (1 ml) de hexano, utilizando uma pipeta de Pasteur, a fim de transferir totalmente a biomassa para a argamassa. NOTA: Hexano é uma substância altamente volátil e tóxico. Ele deve ser tratado da coifa com roupa de proteção adequada.
3. Moer a biomassa de algas por 5 minutos usando um pilão. Comece com moagem suave e aumentar gradualmente a intensidade. Moer a biomassa em uma pasta fina e lisa no período de 5 min. Se o excesso de hexano é usado na transferência da biomassa para a argamassa, é melhor esperar para o hexano se evaporar antes de moagem.
4. Adicionar algumas ml de hexano para a argamassa e misturar a pasta resultante com o pilão até que é homogeneizada. Certifique-se que todos os restos de células aderidas às paredes da mortar são batidos livre e suspenso no líquido.
5. Transferir a mistura de massa de células-hexano para um tubo de centrífuga. NOTA: O tubo de centrifugação deve ser de vidro ou de um polímero adequado compatível com hexano, tais como Teflon.
6. Repita os passos 2.4 e 2.5, até que toda a biomassa ter sido transferida para o tubo de centrifugação (3-5x).
7. Centrifugar a amostra a 4 ° C durante 20 min a 10.000 x g.
8. Pipetar cuidadosamente o sobrenadante para um metal pré-pesado pesar prato. Guarde na coifa.
9. Realizar a extracção de um 2 ^nd hexano por adição de 3 ml de hexano para a pelota e vórtex vigorosamente durante 1 min.
10. Repita os passos 2.7 e 2.8. Se necessário, executar as amostras durante 30 minutos na centrífuga durante a segunda extracção para garantir todos os detritos célula resolve inteiramente. Determine a massa de óleo extraído por gravimetria após hexano tenha evaporado completamente.

3. Fluorometric Quantificação de lipídios neutros Usando Nilo Red (como Reported por de la Hoz Siegler et al. ¹¹⁾

NOTA: Apenas a 10 ul de uma suspensão de algas a 5 g / L é necessário para a leitura de fluorescência. Geralmente, o isolamento de biomassa de algas secas a partir de 1,5 ml de caldo de cultura é mais do que suficiente. Além disso, a intensidade da luz da lâmpada no espectrofotómetro podem degradar ao longo do tempo. Recomenda-se para incluir padrões em cada ensaio para garantir que as variações no instrumento não adicionar erro desnecessário para as medições.

1. Prepara-se uma solução de Vermelho do Nilo, a uma concentração de 10 mg / ml dissolvidos em etanol de grau reagente álcool. Conservar a solução no escuro a 4 ° C.
2. Prepara-se uma solução de etanol a 30% (v / v) em água desionizada e armazenar a 4 ° C.
3. Preparar todas as amostras de algas com a mesma concentração da biomassa (é recomendado 5 g / L) e do mesmo modo que os padrões utilizados na medição. Faça isso por qualquer suspensão amostras pré-secas na quantidade adequadade tampão de fosfato (0,6 g / l de fosfato dibásico de potássio, 1,4 g / L fosfato de potássio monobásico), ou o ajustamento da concentração de uma cultura de crescimento de algas que 5 g / L com tampão de fosfato após a medição da turbidez. NOTA: medições realizadas em culturas de algas vivas, muitas vezes, têm maior erro que lhes estão associados, dependendo da precisão da curva de calibração de turbidez. Ressuspender as amostras secas podem requerer o uso de um homogeneizador para dispersar completamente a biomassa.
4. Para cada amostra, misturar 80 mL de solução de etanol a 30%, 10 ul da solução de Vermelho do Nilo, e 10 ul de suspensão de algas em um único poço de uma placa de 96 poços. A fim de justificar adequadamente a variabilidade da medição de fluorescência, realizar 5 repetições de cada amostra.
5. Executar uma curva de calibração de dois pontos com os padrões previamente preparados para dar conta para o dia-a-dia variações no instrumento e preparação. Prepare os padrões de medição de fluorescência usando o sprocedimento ame como as amostras. NOTA: Geralmente dois pontos é suficiente para a recalibração do instrumento, três pontos podem ser executados para verificar a linearidade.
6. Execute as medições de fluorescência em um multi-bem espectrofotômetro leitor de placas. As condições seguintes foram encontradas para se obter os resultados mais consistentes ^11:
   1. Agitar a 1.200 rpm, a órbita de 3 mm durante 30 segundos.
   2. Incubar a 40 ° C durante 10 min.
   3. Agitar a 1.200 rpm, a órbita de 3 mm durante 30 segundos.
   4. Fluorescência Record, excitação a 530 nm, emissão em 604 nm.
7. Convertem-se as medições de fluorescência para o conteúdo de óleo, utilizando os resultados dos padrões internos.

4. Técnica microscopia de fluorescência

NOTA: O protocolo de coloração descrito na seção 3 é projetado para a análise quantitativa, mas também pode ser útil para fornecer representações visuais de técnicas baseadas em mancha de educativo e ilustrativo purposes. Para produzir imagens de fluorescência da amostra requer um microscópio óptico com fontes de transmissão e iluminação epifluorescência adicional tradicionais. Filtros de excitação e de emissão de luz na 530 nm (verde) e 604 nm (vermelho) gama, respectivamente, são necessários para a mancha vermelha do Nilo, bem como uma câmara montada microscópio com software associado. As imagens apresentadas neste estudo (Figura 1) foram obtidas utilizando um microscópio de campo claro equipado com uma câmera e Monochrome a unidade conversor de RGB. O procedimento para a produção de imagens de fluorescência Nilo Red uso dessas ferramentas é descrito abaixo:

1. Prepare uma amostra de cultura com a mancha Nilo Red acordo com a secção 3 do protocolo. NOTA: uma amostra na faixa de concentração de 5 g / L produz lâminas de densidade celular adequada, sem superlotação.
2. Após concluir o passo 3.6 do protocolo de coloração, preparar uma lâmina de microscópio da amostra processada de acordo com os procedimentos padrão de laboratório.
3. Começando com o microscópio no modo de transmissão, coloque o slide preparado para o microscópio, e localizar as células com a ampliação desejada (imagens mostradas neste artigo foram adquiridos com o objetivo 100X).
4. Uma vez que o foco, mudar o microscópio de transmissão para o modo de iluminação de epifluorescência. A fonte de luz deve agora ser directamente provenientes da lente objetiva (isso pode ser confirmado visualmente através da observação do espaço entre a lâmina ea lente objetiva).
5. Insira um filtro de excitação verde para a fonte de luz e um filtro de emissão vermelha no caminho da luz de observação; a fluorescência das células coradas deverão agora ser directamente visível através da ocular.
6. Mude o modo de observação do microscópio ocular para a câmera montada e usar software de visualização para capturar uma imagem das células fluorescentes. Dependendo da sensibilidade da câmera, a amostra pode não parecer inicialmente na janela de visualização (ou seja, a tela seráser preto); para remediar esta situação, ajustar o tempo de exposição e ganho da câmera para um nível em que as células são visíveis. Configurações específicas irá variar de acordo com os instrumentos, aparelhos, e tipos de células.

Resultados

Células de algas representativos coradas com o corante Vermelho do Nilo estão representados na Figura 1. Partes A e B da Figura imagens de A. um visor protothecoides crescido em excesso de nitrogênio, o que leva ao acúmulo de lipídios intracelulares muito baixo. Em partes C e D, as amostras de A. protothecoides cultivadas sob limitação de nitrogênio são mostradas. Sob...

Discussão

As algas utilizadas na curva padrão devem ser as mesmas espécies cultivadas sob as mesmas condições experimentais, como os que estão sendo medidos. As mudanças significativas na composição do meio, a técnica de cultivo, e protocolo de coloração pode afectar a intensidade da leitura de fluorescência. Extracção com hexano (descrito nas secções 1 e 2) foi utilizado para determinar o teor de lípidos neutros de amostras usadas na curva padrão. Para as medições da intensidade de fluorescência precisos, to...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dry Weight
25 ml disposable pipettes	Fisher	13-676-10K
Pipette Bulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes	Fisher	05-562-16A	Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene)	Fisher	2-202B
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Storage vials	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP)	Fisher	05-562-16A	Could also use glass tubes
Pasteur glass pipettes	Fisher	13-678-20C
Aluminum weigh dishes	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope	Leica	DMRXA2
Microscope slides	Fisher	12-550-15
Microscope cover slips	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Imaging software	Qimaging	QCapture v.1.1.8