حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Summary

نحن هنا وصف للتكيف من البروتوكولات المستخدمة للحث على اللدونة التماثل الساكن في الخلايا العصبية لدراسة اللدونة من G مستقبلات البروتين يقترن نجمي. استخدمت مؤخرا لدراسة التغيرات في مجموعة نجمي أنا mGluRs في الفئران الأحداث، وطريقة يمكن تطبيقها لقياس التحجيم من مختلف GPCRs نجمي، في الأنسجة من الفئران الكبار في الموقع والحية، واكتساب فهم أفضل لحساسية مستقبلات نجمي للتغيرات في نشاط الخلايا العصبية.

Abstract

على مقربة من عقدين من البحوث التي أنشأت الخلايا النجمية في الموقع والحية تعبير عن العديد من G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) التي يمكن يحفزه الارسال صدر neuronally. ومع ذلك، فقد تلقت قدرة المستقبلات نجمي لعرض اللدونة في استجابة للتغيرات في نشاط الخلايا العصبية القليل من الاهتمام. نحن هنا وصف نظام نموذجي التي يمكن استخدامها لتوسيع نطاق عالميا صعودا أو هبوطا مجموعة نجمي أنا metabotropic مستقبلات الغلوتامات (mGluRs) في شرائح الدماغ الحادة. شملت طرق حول كيفية إعداد شرائح الحصين مجاور للسهمي، وبناء غرف مناسبة على المدى الطويل شريحة الحضانة، bidirectionally التلاعب عمل الخلايا العصبية تردد المحتملة، النجمية الحمل وعمليات نجمية مع الفلورسنت كا ^{2 +} المؤشر، وقياس التغيرات في النشاط جي كيو نجمي النوع من الاختزال التي كتبها تسجيل نجمية عفوية وأثار كا ^{2 +} الأحداث باستخدام متحد البؤر المجهري. في جوهرها، "ص الكالسيومoadmap "هو المقدمة لكيفية قياس اللدونة من GPCRs جي كيو نجمي. وتناقش تطبيقات هذه التقنية لدراسة الخلايا النجمية. وجود فهم كيفية تأثر نجمي الإشارات المستقبلة من قبل التغيرات في نشاط الخلايا العصبية آثار هامة على حد سواء وظيفة متشابك العادي فضلا عن عمليات الاضطرابات العصبية الكامنة والأمراض العصبية التنكسية.

Introduction

الخلايا النجمية الرد في غضون ثوان لتحفيز الخلايا العصبية أو المحاور العصبية مع زيادات في هيولي كا ^{2 +} الناتجة على وجه الحصر تقريبا من تفعيل GPCRs جي كيو نجمي. على سبيل المثال، مستقبلات أستيل المسكارينية ^{1، 2} مستقبلات القنب، α _1A مستقبلات الأدرينالية ^{3، 4،} والمجموعة الأولى mGluRs (انظر أدناه) كلها فرعية جي كيو النوع من الاختزال نجمي التي تستجيب تماما لنشاط الخلايا العصبية. وقد تجلى تفعيل مجموعة نجمي أنا mGluRs الأكثر على نطاق واسع، في أعقاب التحفيز من afferents الجلوتاميرجي العصبية في الموقع (مثل شرائح الحصين الحادة) ^5-7، وكذلك في القشرة الماوس الكبار في الجسم الحي التالية الحواس ^8. وكانت نتائج تفعيل نجمي جي كيو النوع من الاختزال مما يشير على علم الأحياء وعلم وظائف الأعضاء من الخلايا النجمية، الخلايا العصبية، أو تفاعلات نجمية الخلايا العصبية موضوع نقاش ^9-12. سيكون من قلى بعد وقت قبل وظيفة الخلايا العصبية، إلى نجمية مستقبلات الإشارات هو محل تقدير بالكامل.

في حين أنه من الواضح أن الخلايا العصبية يمكن تنشيط مستقبلات نجمي باستخدام البروتوكولات التجريبية، هناك جوانب من مستقبلات الخلايا العصبية التواصل إلى نجمية التي لا تزال غير مفهومة تماما. الأول، المبلغ الفعلي للنشاط الخلايا العصبية المطلوبة لتفعيل نجمي جي كيو GPCRs لم يتم تعريف بشكل جيد، والثاني، تلقت قدرة المستقبلات نجمي لعرض تعتمد على استخدام اللدونة القليل من الاهتمام. للبدء في معالجة هذه المسائل، ونحن وضعت مؤخرا بروتوكولا للحث على التحجيم ثنائية الاتجاه من مجموعة نجمي أنا mGluRs في شرائح الحصين الأحداث الحادة في استجابة للتغيرات طويلة الأجل في إمكانات العمل العصبية (ا ف ب) التي تعتمد على النشاط متشابك. على غرار ما تم اكتشافه لاللدونة استتبابي ثنائية الاتجاه من الخلايا العصبية مستقبلات الغلوتامات ionotropic ^{13، 14،} مجموعة نجمي أنا mGluRs زيادة FOالحصار النماذج التالية من إمكانات العمل وتقليص الخلايا العصبية عند عمل الخلايا العصبية تردد المحتملة يتم زيادة ^15. هذه التغيرات التعويضية في مستقبلات نجمي يمكن قياسها من خلال تسجيل عفوية وأثار نجمية كا ^{2 +} العابرين وبمقارنة خصائص هذه الأحداث لتلك الخلايا النجمية في ظروف من السيطرة. في هذا المخطوط، وصفنا منهجية كاملة لاستخدام هذا البروتوكول، بما في ذلك إعداد شرائح قرن آمون، وظروف الحضانة الحادة للحث نجمية مستقبلات التحجيم، نجمية كا ^{2 +} المؤشر صبغ التحميل، كا ^{2 +} تقنيات التصوير باستخدام متحد البؤر المجهري، والآثار المتوقعة على نجمية النشاط جي كيو النوع من الاختزال. الآثار المتوقعة على نجمية كا ^{2 +} خصائص إشارة - التي تتطابق مع تلك المسجلة سابقا في الخلايا المستزرعة transfected مع مستويات مختلفة من التعبير GPCRs جي كيو - تقديم "خارطة الطريق" التي يمكن استخدامها في الدراسات المستقبلية لفحص التغيرات في النحوtrocytic التعبير النوع من الاختزال. سوف تداعيات والتطبيقات المحتملة لاستخدام هذه التقنية تسهم في فهمنا للتفاعلات نجمية الخلايا العصبية في المخ السليمة والمريضة.

Protocol

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تتبع من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة كاليفورنيا، ريفرسايد.

1. بناء غرفة الحضانة وشريحة حامل

1. بناء غرفة الحضانة: بناء غرفة الحضانة من المواد التي هي غير سامة. تأكد من أن الغرفة قد تسيطر دوران الهواء، يحمل كمية كافية من ACSF لحامل شريحة لتعويم، وكبيرة بما فيه الكفاية بحيث حامل شريحة يمكن أن تطفو في نهاية واحدة من الغرفة في حين أن تشتت الغاز من خطوط الأوكسجين يحدث في الطرف الآخر. الجزء درج لتخزين الحاويات ماصة مع غطاء محكمة الغلق لها (الشكل 1A) يناسب هذه المعايير بشكل جيد.
   1. حفر حفرة صغيرة على جانب الحاوية حوالي 1 ¼ من أعلى و¼ في من الجانب. تناسب قطعة من أنابيب مرنة من خلال ثقب (الشكل 1B). كن حذرا لحفر منخفضة بما فيه الكفاية بحيث لا يتم ضغط الأنابيب عند إغلاق الغطاء، ولكن عالية بما فيه الكفاية لذلك هو فوق الحل.
   2. تطبيق سيليكون مانع التسرب التماس ("السداده التماس الحوض") لإنشاء ختم المياه محكم بين خط الأوكسجين والغرفة.
   3. ربط "خارج" نهاية الأنبوب إلى خزان الغاز (95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون) باستخدام يور المناسب الذكور. لصالح العرف، وقطع إلى تناسب الطبيعية مشطوف 200 ميكرولتر ماصة طرف (الشكل 1C).
   4. ربط "داخل" نهاية الأنبوب إلى البلاستيك خط مشعب واحد الى ستة. إلى خفض مناسبا ستة 20 ميكرولتر ماصة إيبندورف نصائح microloader إلى كل مدخل المتعددة (الشكل 1D). افتتاح غرامة من microloaders مثالية لإنتاج تيار مستمر من الفقاعات الصغيرة.
   5. للسماح للتهوية، حفر اثنين من الثقوب الصغيرة على غطاء الحاوية (الشكل 1E).
2. بناء شريحة حكبار السن: وتتكون من حامل شريحة من فقاعة عائمة حامل (الشكل 1F).
   1. إزالة "الساقين" أسفل رف فقاعة، وقطع رأس لحوالي 1 ¾ فيها.
   2. الغراء قطعة من النايلون مواد شبكة لأسفل رف جولة باستخدام الغراء فورية الغراء (مثل معيار كريزي الغراء) لإنشاء حامل شريحة ثمانية جيدا (الشكل 1G). كل بئر يمكن أن يصلح ماوس شريحة الحصين واحدة.
   3. تناسب شريحة حامل في نهاية واحدة من غرفة الحضانة وأجهزة-microloader متعددة في الطرف الآخر. السماح للنصائح microloader للراحة في الطابق غرفة (الشكل 1H). تم تصميم هذا الإعداد لضمان الأوكسجين كافية لكل من أعلى وأسفل شرائح الحصين الحادة، وتجنب فقاعات الخروج مباشرة تحت حامل شريحة من أجل تقليل شريحة التحريض ومنع الاتصال المباشر مع فقاعات شرائح الحصين.
   4. شطف غرف الحضانة ود أصحاب شريحة تماما مع DDH ₂ O بعد كل تجربة، وتطهير مع 70٪ ETOH الأسبوعية. في حالة احتضان الشرائح في الحلول المختلفة، وسوف تكون هناك حاجة إلى أصحاب غرف متعددة / شريحة.

2. حلول والمخدرات

1. السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF): إعداد 4 L من ACSF القياسية في DDH ₂ O باستخدام التالية (مم): 125 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 2.5 و CaCl _2، 1.3 MgCl _2، 1.25 ناه ₂ ص _4، 26.0 NaHCO _3، 15 الجلوكوز، و 0.1 Trolox. قياس الأسمولية من الحل باستخدام مقياس التناضح، بل يجب أن تأتي إلى ~ 310 الميلي أسمول. يتم وصف التراكيب ACSF لظروف تجريبية أدناه (انظر البروتوكول 3). تصفية جميع الحلول باستخدام 0.22 ميكرون زجاجة أعلى مرشح في الزجاجات تعقيمها. الحلول هي مستقرة في 4 درجة مئوية لمدة تصل الى شهر.
2. تشريح العازلة: إعداد شرائح باستخدام ACSF تعديل تحتوي على (مم): 125 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 3.8 MGC₂ لتر، 1.25 ناه ₂ ص _4، 26.0 NaHCO _3، 15 الجلوكوز، و 1.3 حمض الاسكوربيك. قياس الأسمولية من الحل باستخدام مقياس التناضح، بل يجب أن تأتي إلى ~ 310 الميلي أسمول. استبدال و CaCl ₂ مع MgCl ₂ في المخزن المؤقت تشريح يحسن الصحة شريحة.
3. يستخدم Sulforhodamine 101 (SR-101، 1 ميكرومتر) لتحديد الخلايا النجمية في قرن آمون شرائح حادة. جعل الأسهم 1 ملم من SR-101 عن طريق تمييع 60.67 ملغ SR-101 في 100 مل من ACSF منخفضة الكالسيوم تعديل أعدت على النحو التالي (مم): 125 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 0.5 و CaCl _2، 6 MgCl _2، 1.25 ناه ₂ ص _4، 26.0 NaHCO _3، 15 الجلوكوز، و 1.3 حمض الاسكوربيك. تحقق من أن الأسمولية من ACSF الكالسيوم منخفض ~ 310 الميلي أسمول. تمييع 1 ملم SR-101 الأسهم 1،000 مرات في تعديل منخفضة كا ^{2 +} ACSF للتحميل. تخزين النهائي SR-101 الحل في 4 درجة مئوية، ومحمية من الضوء لحين الحاجة إليها للتجربة.

3. التلاعب Lأونج الأجل العصبية الحادة في أسعار إطلاق شرائح الحصين

استخدام أحد بروتوكولين الحضانة في تجارب منفصلة لمعالجة معدلات إطلاق الخلايا العصبية طويلة الأمد:

1. تمنع إطلاق الخلايا العصبية: احتضان في سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX، 1 ميكرومتر): تنبيه: تعامل مع TTX الرعاية لأنها يمكن أن تكون قاتلة إذا تناولها بكميات كافية. ينصح قفازات ونظارات واقية. TTX يلغي تماما AP يحركها إطلاق الخلايا العصبية في شرائح حادة. احتضان الشرائح في 3.5 ملي K ⁺ ACSF، بالإضافة إلى 1 ميكرومتر TTX في حالة تجريبية. في حالة السيطرة، واحتضان الشرائح في 3.5 ملي K ⁺ ACSF دون TTX. المقارنة بين شرطين يكشف تأثير الارتقاء في النشاط جي كيو نجمي النوع من الاختزال. يقدم 3.5 ملي K ⁺ ACSF كشرط السيطرة (على العكس من القول، 2.5 ملي K ⁺⁾ من أجل تعظيم تأثير العلاج TTX.

- أو -

2. زيادة إطلاق الخلايا العصبية أعلاهمعدلات القاعدية: احتضان في ارتفاع البوتاسيوم: زيادة تركيز خارج الخلية K ⁺ depolarizes الخلايا العصبية ويزيد من معدل اطلاق القاعدية الخاصة بهم. الحضانة في 5.0 ملي K ⁺ ACSF يرفع بشكل كبير عمل الخلايا العصبية تردد المحتملة مقابل 2.5 ملي K ⁺ ACSF ^15. احتضان الشرائح في 5.0 ملي K ⁺ ACSF لحالة تجريبية، وبالنسبة للحالة السيطرة، واحتضان الشرائح في القياسية 2.5 ملم K ⁺ ACSF. المقارنة بين شرطين يكشف تأثير أسفل التحجيم في النشاط جي كيو نجمي النوع من الاختزال.

4. الحاد شريحة الحصين إعداد

1. إنشاء غرفة الإنعاش الحارة:
   1. تدفئة حمام مائي إلى 35 درجة مئوية، ثم ضع غرف الحضانة أعدت في الداخل. ملء حمام الماء مع الماء تصل إلى ذروة ACSF داخل غرف الحضانة (الشكل 1G).
   2. الأوكسجين في ACSF التجريبية والضابطة مع 95٪ O _2، 5٪ CO _2. يجب أن الفقاعات المنبعثة من جهاز-microloader متعددة تكون صغيرة وفيرة ولكن أيضا لطيف، وينبغي ألا يكون هناك أي تحرك واضح من ACSF داخل الغرفة.
2. إنشاء غرفة تشريح الجليد الباردة:
   1. تأخذ اثنين من دلاء من الجليد. وضع زجاجة من تشريح عازلة في دلو واحد من الجليد حوالي 300 مل وابقائه الاوكسيجين مع 95٪ O _2، 5٪ CO ₂ لمدة 20 دقيقة. يغرق 100 ملم طبق بتري في دلو الجليد أخرى، فقط تحت سطح الجليد. ضمان جانب طبق بتري هو على اتصال مباشر مع الجليد. صب بعض العازلة تشريح في طبق بتري وابقائه الاوكسيجين كذلك.
   2. هدئ طليعة من شفرة حلاقة واحدة حافة طريق غمر في المخزن المؤقت تشريح الجليد الباردة في طبق بتري لأكثر من 1 دقيقة.
3. Vibratome الإعداد:
   1. بدوره على vibratome والتأكد من إغلاق الصرف.
   2. تأمين القطع في غرفة فاتتومي وكيس من الثلج في جميع أنحاء الغرفة القطع. Precool إلى 0-4 درجة مئوية.
   3. إزالة الشحوم من مصنع أسلاك شائكة مزدوجة حافة شفرة عن طريق نقع عليه في 70٪ ETOH لمدة 5 دقائق ثم الشطف مع ddH2O. قطع عليه الى نصفين بعناية (لا ينحني النصل) وجبل نصف شفرة على كتلة القطع.
4. إزالة مخ الفأر:
   1. تخدير الماوس C57BL/6J القديمة ثمانية عشر يوما إلى اثني عشر في غرفة صغيرة مسبقة مع 0.5 مل isoflurane وغارقة في Kimwipe أو القطن الكرة. قرصة بلطف أصابع الحيوان للتأكد من عدم وجود منعكس الألم.
   2. قطع رأس الفأر باستخدام زوج من مقص حاد، ثم إزالة فروة الرأس باستخدام ملقط صغير. استخدام مقص لقطع صغيرة العظم الجمجمة من المخيخ إلى بصيلات الشم طول الشق الطولي. إزالة اللوحات الجمجمة باستخدام ملقط صغير. إزالة بلطف الدماغ مع ملعقة، وتغمره في المخزن المؤقت تشريح الاوكسيجين الجليد الباردة في طبق بتري.
   3. Bisecر مخ الفأر مع شفرة حلاقة المبردة في طبق بتري للسماح بمزيد من المساحة السطحية للتبريد والأوكسجين. دعونا نصفي الكرة الأرضية شطر الجلوس في المخزن المؤقت تشريح الجليد الباردة لمدة 2-3 دقيقة. وينبغي أن يصبح الدماغ بارد تماما وأكثر صلابة.
5. تطبيق طبقة رقيقة من الغراء cyanoacrylate على منصة من vibratome. الغراء نصفي الكرة الأرضية إلى قطع منصة الجانبين الجانبي يصل إلى أسفل الجانب و، مع البصلة الشمية التي تواجه الأمام. تأمين منصة في غرفة القطع، ثم ملء الغرفة مع قطع الثلج الباردة، جيد التهوية عازلة تشريح.
6. تواصل بالاكسجين غرفة القطع في حين تستعد 300 ميكرون شرائح مجاور للسهمي سميكة باستخدام vibratome. قطع شرائح على تردد 85 هرتز، وسرعة إلى الأمام من 0.20 مم / ثانية، والسعة من 1.40 ملم. ملاحظة: لقد وجدنا أن واحد المتغير الأهم في إعداد شرائح الحصين الحادة صحي هو نوعية vibratome. يستخدم لدينا مختبر S المغناطيس لايكا VT 1200جيم دفع vibratome مع vibrocheck للحد من "ض" الاهتزاز.
7. تشريح بعد، تشريح الحصين والقشرة المخية الأنفية الداخلية المتاخمة للخروج من كل شريحة مجاور للسهمي باستخدام ملقط حادة. تنفيذ هذا الإجراء في، الاوكسيجين بشكل جيد عازلة تشريح الجليد الباردة في غرفة قطع من vibratome. الحدة من ملقط مهم جدا لصحة شريحة لأنه يقلل من التعامل مع شرائح.
8. جعل ماصة نقل عن طريق كسر قبالة الطرف طويلة من ماصة باستير الزجاج وتتصدر جزء مكسور مع لمبة ماصة. وهذا يتيح استخدام نهاية كبير من ماصة لنقل شرائح. تأكد من أن تأمر ماصات دون المكونات القطن في نهاية الكبيرة (انظر الجدول مواد). كما يتم إعداد شرائح في ظروف غير المعقمة، فإنه ليس من الضروري الأوتوكلاف ماصة قبل استخدامها، على الرغم من ماصة جديدة ينبغي إعداد واستخدام لكل تجربة.
9. نقل كل شريحة الحصين إلى غرف الحضانة في 35 درجة مئوية الماءحمام، عن طريق غمس ماصة نقل في ACSF داخل كل بئر من صاحب شريحة وشريحة الشفط. تقليل حركة شريحة أثناء هذه العملية. النقل المباشر للشرائح إلى الحارة النتائج حمام الحضانة في شرائح نوعية أفضل من "التعلية" درجة الحرارة تدريجيا.
10. السماح للشرائح الحصين لاسترداد في حمام ماء دافئ لمدة ما مجموعه 45 دقيقة، موزعة على النحو التالي: احتضان شرائح لمدة 20 دقيقة في 1 ميكرومتر SR-101 مخففة في انخفاض ACSF الكالسيوم، ثم نقلها إلى ACSF الكالسيوم منخفضة (دون SR-101) لمدة 10 دقيقة. في وقت لاحق، نقل شرائح لمراقبة أو ACSF تجريبية لمدة 15 دقيقة المتبقية من الحضانة الدافئة.
11. بعد الانتعاش 45 دقيقة دافئة، تحرك بحذر غرف الحضانة من حمام الماء 35 درجة مئوية إلى الأعلى مقاعد البدلاء، ومن ثم السماح للشرائح على مواصلة احتضان في درجة حرارة الغرفة لفترة الحضانة مجموعه 3 ساعة قبل البدء في التحميل البلعة البروتوكول (انظر أدناه).

5. بلعة تحميل من النجمية مع كا ^{2 +} المؤشر

1. إعداد كا ^{2 +} المؤشر بلعة التحميل صبغ:
   1. لكل قنينة من الصبغة (50 ميكروغرام)، إضافة 3.87 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل الطازجة (DMSO) ودوامة بدقة. نضارة DMSO المهم لتحميل جيدة، وبالتالي، صدع مفتوحة على أمبولة جديدة في كل مرة.
   2. خلط في 9 ميكرولتر من حمض بلورونيك 20٪ ودوامة بدقة. خلط الصبغة مع 100 ميكرولتر من ACSF ودوامة جيدا التجريبية أو التحكم المناسب، لتركيز الصبغة النهائية من 10 ميكرومتر.
   3. تحديد الحل باستخدام أنبوب تصفية الطرد المركزي. هذه الخطوة يمنع ماصة التحميل من انسداد خلال طرد الصبغة.
   4. إعداد ماصة من الزجاج الشعرية البورسليكات سحبت لمقاومة ما يقرب من 1.3 MΩ عندما تمتلئ محلول الصبغة.
2. وضع شريحة الحصين إلى غرفة تسجيل مصممة للاستخدام مع المجهرويروي باستمرار مع ACSF الاوكسيجين من نفس التركيبة التي تم المحتضنة في (1.5 مل / دقيقة). بالتناوب بين السيطرة والظروف التجريبية عند اختيار شريحة الحصين.
3. تجاهل غير صحية يبحث شرائح الحصين. نوعية شرائح سوف تختلف حتى داخل تجربة معينة. لا توجد معايير محددة لقياس الصحة شريحة، وبالتالي، تحديد شريحة الصحية هو ذاتي وتستند في معظمها على الخبرة.
   1. بصفة عامة، والحفاظ على شرائح التي لديها على نحو سلس السطح وتظهر نسبة عالية من الخلايا الهرمية CA1 صحية (الشكل 2A). الخلايا الهرمية CA1 حساسة بشكل خاص عرضة للإهانات والجهاز العصبي المركزي، وذلك بعد نسبة كبيرة (≥ 75٪) من الخلايا العصبية CA1 الهرمية صحية قد تكون مفيدة لمعايير قبول أو رفض شريحة.
   2. تجاهل شرائح التي لديها ما يقرب من> 25٪ الخلايا العصبية الميتة. الخلايا العصبية الميتة لديها مثل البيض المقلي المظهر (الشكل 2B). ملاحظة: نحن هالقد لوحظ أن زاوية خفض يلعب دورا رئيسيا في ما إذا كانت الخلايا العصبية تظهر صحية أم لا. إذا التشعبات العصبية وإسقاط صعودا (من شريحة)، ثم الخلايا العصبية سيكون معظمهم بالرصاص. هذا هو ربما لأن يرد هذه النسبة الكبيرة من حجم الخلايا العصبية داخل شجرة شجيري، أن قطع التشعبات هي قاتلة للخلايا. من ناحية أخرى، إذا كانت التشعبات هي إسقاط موازية لأو في زاوية الهبوط من على سطح شريحة، وسوف يكون هناك نسبة عالية من الخلايا العصبية السليمة. في بعض الأحيان، لذلك، سوف تكون الخلايا العصبية الميتة في الغالب على جانب واحد من شريحة وصحية تبحث على الجانب الآخر.
4. تحديد حقل مناسبة من الخلايا النجمية ريال 40-70 ميكرومتر تحت سطح شريحة على أساس الحجم والتشكل، والمكان باستخدام النقيض تدخل الفرق (DIC) البصريات.
5. تحميل ماصة الزجاج مع محلول الصبغة وخفضه على سطح شريحة فوق هذا الحقل باستخدام معيار التصحيح، المشبك مسرى مكروي holdeص. مع ماصة على سطح شريحة، وتطبيق الضغط الخلفي لماصة للبدء في إخراج الصبغة. وطرد من الصبغة تكون مرئية في إطار كل من مدينة دبي للإنترنت البصريات والليزر المناسبة مثل خط 488 للصبغة الخضراء.
6. خفض ببطء ماصة إلى ما يقرب من 40 ميكرومتر تحت سطح شريحة باستخدام مياداة مجهرية والسماح للصبغ لإخراج لحوالي 45-60 ثانية. ثم، وانخفاض ماصة على 35 ميكرومتر إضافية (75 ميكرومتر تحت سطح شريحة) وإخراج صبغ لحوالي 45-60 ثانية. التراجع ببطء غيض ماصة من شريحة. أقصر وقت حقن المرجح أن يؤدي إلى عدم كفاية صبغ التحميل، في حين حقن يعد يميل إلى زيادة التحميل الخلفية، مما يقلل نسبة الإشارة إلى الضوضاء من التسجيل.
7. لضمان أن عددا كبيرا من الخلايا النجمية تناول الصبغة، فإنه من المفيد عادة لحقن الصبغة بلعة الثانية على بعد مسافة قصيرة. رفع ماصة مرة أخرى إلى السطح من شريحة، تأكد من أن لا يتم انسداد ماصة، ثم مولقد ماصة حوالي 80-100 ميكرون بعيدا عن موقع الحقن الأولى، وعلى طول الطبقة المشععة. تكرار حقن بلعة في هذا الموقع.
8. تسمح 30-45 دقيقة قبل التصوير لالخلايا النجمية لتولي الصبغة وللإشارة الخلفية للحد. ترك شريحة في غرفة نضح خلال هذا الوقت. تأكد بنيت هذه المرة الحضانة في مجموع العلاج 4 ساعة التجربة. الحصول على شريحة وكرر الخطوات من 5،2-5،8 المقبل.

6. تسجيل العفوي وجي كيو النوع من الاختزال ناهض أثار نجمي كا ^{2 +} آخر في شرائح الحصين

1. إنشاء المجهر متحد البؤر التصوير:
   1. الحد من التعرض لضوء الليزر شريحة أمر في غاية الأهمية، والتعرض الشديد يمكن أن يؤدي إلى صبغ تبيض و / أو الضيائية. باستخدام أعلى التكبير البصري أو زيادة إعداد التكبير والتصغير يزيد التعرض للضوء إلى الميدان المصورة. لذلك، تعيين القيم الافتراضية لكل ليزر لمضخم settin عاليةز، 1x أداة المكسب و0.5٪ انتاج الليزر السلطة.
   2. تطبيق التكبير 1.5X لتصور أفضل للعمليات نجمية.
   3. تعيين دقة الحقل إلى 512 X 512 بكسل.
   4. ضبط سرعة المسح الضوئي للأسرع وقت ممكن، والذي هو ~ 1.2 ثانية لكل المسح باستخدام وضع المسح الضوئي اتجاه واحد.
   5. جمع أطياف الانبعاثات باستخدام مرشحات ممر الموجة من 503-548 نانومتر ليزر 488 نانومتر، و624-724 نانومتر ليزر 559 نانومتر. تسمح هذه الإعدادات التصوير من حقل ~ 5-8 النجمية بسرعة كبيرة نسبيا في القرار كافية لمراقبة أجسام الخلايا نجمية والعمليات الرئيسية. من الناحية المثالية، سوف الخلايا النجمية في مجال يكون مشرقا يكفي أن ينظر إليها بشكل واضح، ولكن من دون أي التشبع بكسل.
   6. التأكد من هوية الخلايا محملة كا ^{2 +} صبغ كما النجمية من خلال وضع تصور للcolabeling SR-101 باستخدام الليزر 559 نانومتر.
2. تسجيل نجمية كا ^{2 +} النشاط:
   1. مربعات رسم الصورة باستخدام برنامج الحصول على أكثر من المناطق ذات الاهتمام (ROهو) داخل الخلية، في هذه الحالة على أجسام الخلايا نجمية. لا ينبغي أن تشمل صناديق خلفية بكسل، لتحقيق أفضل نسبة ممكنة إشارة إلى الضوضاء. رسم مربع واحد على خلفية كمرجع.
   2. تبديل نضح لACSF التجريبية زائد 1 ميكرومتر TTX (Abcam) من خلال ما تبقى من التجربة. هذا يلغي أي ردود نجمية الكالسيوم ممكن العصبية AP يحركها. سوف الزيادات المتبقية في نجمي كا ^{2 +} تركيز ثم يكون راجعا إلى الإفراج كمي الحويصلي، التأسيسية (القاعدية) النشاط النوع من الاختزال، أو مزيج من الاثنين معا بعض الآليات.
3. سجل مضان بمرور الوقت من كل رويس. وتشير أي زيادات في مضان على خط الأساس الزيادات في هيولي كا ^{2 +} تركيز ^16، وبالتالي النشاط النوع من الاختزال في الخلايا النجمية ^{10، 17، 18.} لتجنب أي آثار التحجيم مبكرة محتملة على مستقبلات نجمي بواسطة TTX، تجارب كاملة في غضون 40 دقيقة الابام الوقت عندما بدأ 1 ميكرومتر TTX الارواء.
   1. بعد الحصول على 10 دقيقة من خط الأساس من تسجيل عفوية كا ^{2 +} النشاط، تطبيق ناهض الفائدة (مثل DHPG) في زيادة تركيزات بالتتابع. ترك ما لا يقل عن 5 دقائق بين التطبيقات الممكنة للحد من الحساسية مستقبلات.
   2. في نهاية التسجيل، وتطبيق مزيج من منبهات أخرى لGPCRs جي كيو نجمي كعنصر تحكم إيجابية لنجمي سليمة جي كيو النوع من الاختزال مسارات الإشارات. سوف مكونات كوكتيل ناهض تعتمد على مستقبلات المصالح. 10 ميكرومتر من كل من جي كيو النوع من الاختزال ناهضات الهستامين، كرباكول، و2NA-ATP مستقبلات الهيستامين لتحفيز H1 [H1R]، مستقبلات أستيل المسكارينية [mAchR]، ومستقبلات purinergic [P2YR]، على التوالي، هو كوكتيل ناهض مستخدمة بشكل شائع.
4. بعد تجربة الحصول على الصور:
   1. عند الانتهاء من كا ^{2 +} تسجيل، واتخاذ الصور الثابتة مع نانومتر 488 و 559 نانومتر ليزر، وفي وقت لاحق أو تأكيد الهوية نجمية والتنسيب العائد على الاستثمار. يجوز تغيير إعدادات الطاقة الليزر وHV بحرية في هذه المرحلة للحصول على الصورة المثلى لcolocalization، كما لم يعد هناك قلق حول الليزر شدة الضوء التي تؤثر على البيانات (الشكل 2A).
5. كرر الخطوات من 6،1-6،3 ليصبح المجموع حوالي 8 شرائح والخلايا النجمية 40 / المجموعة. يجب أن تأتي من شرائح لا تقل عن 3 الفئران مختلفة.

7. تحليل نجمية كا ^{2 +} آخر

1. تعريف كا ^{2 +} الارتفاع: توحيد في تحديد كا ^{2 +} العابرين لم راسخة داخل المجتمع العلمي. ما يلي هو بروتوكول النموذجية التي يزيد حساسية مع الحد من الكشف عن الأحداث الإيجابية الكاذبة من الضوضاء الأساس.
   1. وعضو مختبر آخر تعيين كل شريحة رمز رقمي من أجل تحليلها بصورة عمياء. في ختام التحليل، فك كل شريحة.
   2. تحليل نجمية عفوية وأثار كا ^{2 +} الارتفاعات حاليا باستخدام برامج التحليل التصوير. رسم و / أو تعديل حجم وشكل وموقع رويس كما تريد.
   3. زيادات النتيجة في كثافة مضان على خط الأساس باعتباره كا ^{2 +} الارتفاع إذا ذروة السعة أكبر من اثنين الانحرافات المعيارية (SD) فوق متوسط ​​30 ثانية من متوسط ​​مضان خط الأساس لاثنين على الأقل من نقاط العينة على التوالي. في تسجيلات صاخبة ولا سيما (منخفض إشارة إلى الضوضاء)، قد تحتاج هذه المعايير إلى تعديل ل3 SD فوق مضان خط الأساس يعني. تحديد بداية كل كا ^{2 +} الارتفاع كنقطة البيانات الأخيرة قبل تجاوز كثافة مضان انحراف معياري واحد فوق المتوسط.
   4. التفريق بين multipeak مقابل المتعاقبة الأحداث أحادية الذروة. يسجل هذا الحدث بأنه "multipeak" عندما لا يرجع إلى كثافة مضان خط الأساس (أقل من متوسط ​​قيمة خط الأساس +2 SD) لو# 8804؛ 9 نقاط متتالية البيانات (10.8 ثانية) بين القمم. وبالتالي، فإن الأحداث ذروة واحدة لديها 10 نقطة أو أكثر في بيانات خط الأساس على التوالي بينهما.
   5. تصنيف الأحداث بأنها "الهضبة" من نوع الاستجابات عندما يحافظ على كثافة مضان ذروة السعة (± 10٪ من قيمة الذروة) ل3.6 ثانية على الأقل.
2. تحليل السعة، والتردد، وحركية العابرين الكالسيوم عفوية وأثار ناهض.
   1. تحديد الذروة اتساع كا ^{2 +} الارتفاع كنقطة البيانات وفقا لأعلى قيمة كثافة (في حالات الاستجابات "multipeak" استخدام الذروة الأولى، وانظر الشكل 2B).
   2. حساب الوقت الارتفاع بالفرق بين ظهور الاستجابة والوقت المقابلة لذروة السعة. ملاحظة: قد تحتاج 0 إلى 100٪ ارتفاع الوقت لاستخدامها من أجل الحصول على عدد كاف من نقاط البيانات للحصول على قيمة الوقت؛ سرعة المسح الضوئي هو متغير مهم هنا.
   3. حساب الكمون كوقتبين بدء ناهض نضح لظهور استجابة. زمن الصعود قد يكون تدبيرا أكثر فائدة في شرائح الدماغ، طالما غسل في أوقات خلق إرباك في حساب الإختفاء استجابة.
3. تحديد ما إذا كان هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعتين لكل معلمة باستخدام المستقلة اختبار t الطالب. استخدام عدد من الخلايا النجمية باسم 'ن'. استخدام خي مربع اختبار بيرسون لمقارنة أنماط كا ^{2 +} النشاط بين جماعات مراقبة والعلاج. استخدام الدقيق اختبار الذيل 2 فيشر لمقارنة النسب المئوية للأنماط كا ^{2 +} نشاط معين بين مجموعات المراقبة والعلاج. التعبير عن الاختلافات كما * ع <0.05، ** ع <0.01، و*** ع <0.001.

النتائج

نتائج ممثلة في الشكل 3 إظهار تأثير حضانة الحادة شرائح الماوس قرن آمون في TTX لمدة 4-6 ساعة على نجمية ريال كا ^{2 +} النشاط. وتشمل البيانات كلا عفوية كا ^{2 +} العابرين ومجموعة DHPG أثار-I mGluR كا ^{2 +} الردود، من شرائح المحتضنة في السيطرة ACSF مقابل ACSF زائد TTX. غيرها من الميزات المورفولوجية السمة الأساسية، والتجمع عملية النجمية والصغيرة الحجم سوما (~ 10 ميكرون)، ويتم تحديد الخلايا النجمية في ريال قبل تراكب من كا ^{2 +} المؤشر OGB-1:00 مع انتقائية نجمية علامة SR-101 ^{19، 20} ( الشكل 3A). مربعات مرقمة على أجسام الخلايا نجمية تتوافق مع مضان مرقمة على آثار الوقت هو مبين في الشكل 3B. يتم تطبيق mGluR ناهض المجموعة 1 (RS)-3.5-DHPG لتحديد الآثار التحجيم محددة بشأن مجموعة 1 mGluRs في الخلايا النجمية. للتمييز بين فيزiology في خصوصية تأثير التحجيم لمجموعة 1 mGluRs مقابل GPCRs جي كيو الأخرى، يتم تطبيق مزيج من منبهات في نهاية كل تجربة. نحن هنا استخدمت 10 ميكرومتر كل من جي كيو النوع من الاختزال ناهضات الهستامين، كلوريد carbamylcholine (كرباكول) والأدينوزين ATP 5'-ثنائي الصوديوم (نا ATP). يخدم كوكتيل ناهض أيضا كعنصر تحكم إيجابية لتحديد والخلايا النجمية استجابة قابلة للحياة في الحالات التي تكون فيها الخلايا لا تستجيب للDHPG، ربما لأن تلك الخلايا النجمية خاصة لا تعبر عن كميات كافية من مستقبلات للحصول على رد لDHPG.

كنا تركيزات مختلفة من DHPG، بما في ذلك 5 ميكرومتر و 15 ميكرومتر (الشكل 3B)، فضلا عن 30 ميكرومتر و 50 ميكرومتر (الشكل 4A) للمساعدة في الكشف عن التغييرات في مجموعة نجمي أنا mGluRs. وقد بحثت في العلاقة بين الخلوية كا ^{2 +} الردود ومستويات التعبير جي كيو النوع من الاختزال سابقا في المختبر ^21-24. أولا،عتبة للرد على تركيز ناهض خاص يعتمد على كثافة المستقبلات التي أعرب عنها كل خلية. في عدد السكان من الخلايا، الخلايا أكثر استجابة مع كا ^{2 +} الارتفاع إلى تركيز معين من ناهض عندما و transfected الخلايا مع كثافة أعلى من المستقبلات. بعد احتضان الشرائح في TTX، نسبة الخلايا النجمية في عدد السكان ردا على تركيز ثابت من الزيادات ناهض (أرقام 3B و 3C). لقد وجدنا أن 5 ميكرومتر و 15 ميكرومتر DHPG تكشف عن اختلافات واضحة في نسبة الخلايا النجمية استجابة بين السيطرة والخلايا TTX المعالجة، في حين أن المطلوب 30 و 50 ميكرومتر DHPG لمقارنة مجموعة الاستجابات أنا mGluR في 5.0 ملي K ⁺ يعامل مقابل السيطرة الخلايا (الشكل 4A).

كما تم فحص العلاقة بين نجمي أنماط كا ^{2 +} استجابة وتركيز ناهض في الموقع. زيادة ناهضتركيز تحولات نمط من كا ^{2 +} استجابة في الخلايا النجمية من ذروة واحدة كا ^{2 +} الارتفاعات لmultipeak وهضبة كا ^{2 +} الارتفاعات ^25-27. بناء على هذه النتائج السابقة، توقعنا أن نمط استجابة لتركيز واحد من ناهض سيتحول إذا كانت هناك تغييرات في مستوى مستقبلات التعبير. وهكذا، وهذا يتوقف على أي من أساليب القياس اثنين يجري استخدام (تثبيط إطلاق الخلايا العصبية أو زيادة عليه)، فإن تركيز ناهض اللازمة لإنتاج نمط استجابة معينة تزيد أو تنقص. على سبيل المثال، الخلايا النجمية المحتضنة في TTX تحول DHPG أثار كا ^{2 +} نمط استجابتها لأكثر الهضبة من نوع كا ^{2 +} الارتفاعات والاستجابة لخفض تركيزات ناهض مقارنة للسيطرة على الخلايا النجمية (الشكل 3C). مع الأخذ في الاعتبار الدراسات السابقة، تشير هذه الملاحظات إلى أن المجموعة الأولى mGluR مستويات مستقبلات الخلايا النجمية في التعبير قد ازداد.

زمن الصعود وبداية (الكمون) من الارتفاعات ⁺ كا ² كما تم أظهرت لربط مباشرة إلى التغيرات في مستويات التعبير جي كيو النوع من الاختزال في الخلايا المستزرعة ^22-24. أعلى مستويات مستقبلات التعبير تؤدي إلى الإختفاء استجابة أقصر وأسرع الأوقات الارتفاع بينما الانخفاض في كثافة مستقبلات تنتج تأثير معاكس. لالنجمية المحتضنة في TTX، كا ^{2 +} العابرين التي حركها تطبيق DHPG يكون أسرع بكثير ترتفع مرات مقابل الخلايا النجمية المحتضنة في السيطرة ACSF (الشكل 3D). تبقى كما ذكر سابقا، سعة كا ^{2 +} استجابات أثار ناهض دون تغيير بغض النظر عن تركيز ناهض أو نموذج القياس ¹⁵ (الشكل 3D).

بالإضافة إلى التغييرات التي لاحظها فريق تفعيل مباشرة أنا mGluRs مع DHPG، كما تتأثر نجمية عفوية كا ^{2 +} النشاط بشكل كبير من هذا التلاعب. نلاحظدا زيادة 2.26 أضعاف في نسبة الخلايا النجمية نشاطا عفويا المحتضنة في TTX مقابل السيطرة. هذا هو زيادة من 12.9٪ فقط من الخلايا النجمية السيطرة واظهار النشاط العفوي في سوما ل42.1٪ في TTX حضنت الخلايا النجمية (الشكل 3E). لأنه من المعروف أن GPCRs معرض "الجوهرية" أو النشاط التأسيسية في غياب ناهض ^{21، 26، 28،} وأن مستوى هذه الزيادة الجوهرية مع زيادة مستويات نشاط مستقبلات التعبير، وتشير هذه البيانات إلى أن كثافة نجمي زيادات جي كيو GPCRs بعد تقليل المدى الطويل في العمل العصبية اطلاق المحتملة. مماثلة لاستجابات أثار ناهض، وزيادة مرات ظهور عفوية كا ^{2 +} الارتفاعات أيضا (الشكل 3E).

بيانات تمثيلية باستخدام بروتوكول الثاني، الحضانة في البوتاسيوم خارج الخلية مرتفعة (5.0 ملم)، وصفت في فايجوري 4. زيادة في K ⁺ خارج الخلية 2،5-5،0 ملم في النتائج زيادة كبيرة في الخلايا العصبية القاعدية CA3 العمل المحتملة تردد ^15. تركيزات أعلى من DHPG (30 ميكرومتر و 50 ميكرومتر) ضرورية من أجل استحضار المجموعة الأولى mGluR كا ^{2 +} الاستجابات من الخلايا النجمية المحتضنة في ارتفاع البوتاسيوم (أرقام 4A و 4B). وهذا يتفق مع مستوى منخفض من المجموعة الأولى mGluR استجابة الخلايا النجمية في أعقاب زيادة طويلة الأجل في إمكانات العمل العصبية. بالإضافة إلى ذلك، أثار نمط استجابة إلى تركيز ثابت من DHPG التحولات من الاستجابات مثل هضبة لأضعف الاستجابات أحادية الذروة (الشكل 4B). فحص نسبة الخلايا النجمية النشطة تلقائيا في الظروف البوتاسيوم اثنين يكشف أن عددا أقل من الخلايا النجمية المحتضنة في ارتفاع K ⁺ تنشط بصورة عفوية بالمقارنة مع حالة السيطرة (الشكل 4C). هذا التأثير هو في oppositالاتجاه (ه) من حالة TTX فيه نسبة الخلايا النجمية واظهار عفوية كا ^{2 +} الارتفاعات هو زيادة. الماضي، أثار كل من وعفوية كا ^{2 +} الارتفاعات الحصول على أوقات ارتفاع أبطأ في الخلايا النجمية المحتضنة في K ⁺ عالية مقابل حالة التحكم (أرقام 4C و 4D). عموما تشير هذه البيانات إلى أن نجمي مستويات التعبير جي كيو العملية من الحجم اعتمادا bidirectionally على مستوى العمل العصبية النشاط المحتملة على مدى فترة زمنية طويلة.

الشكل 1. تصنيع شريحة غرفة الحضانة واقامة. (A) ويستخدم الجزء درج لتخزين الحاويات ماصة برينكمان جنبا إلى جنب مع غطاء محكمة الغلق لبناء غرفة شريحة الحضانة. (B) Dغدير ثقب في جانب الحاوية حوالي 1 ¼ من أعلى و¼ في من الجانب. تناسب في قطعة من أنابيب مرنة. (C) قم بتوصيل جهاز-microloader متعددة إلى الطرف الداخلي للأنابيب مرنة. ملاحظة إلى خفض تناسب طبيعية 200 ميكرولتر ماصة (السهم الأبيض). وإلى خفض مناسبا (D) ستة 20 ميكرولتر microloaders إيبندورف إلى خط مشعب واحد الى ستة لإنشاء جهاز-microloader متعددة. (E) حفر اثنين من الثقوب الصغيرة على الغطاء. (F) A العائم حامل فقاعة لجعل حامل شريحة. (G) تتم إزالة "الساقين" أسفل العائمة رف فقاعة بحيث يمكن لصقها على قطعة من النايلون مواد شبكة إلى أسفل. (H) ملء غرفة الحضانة مع كمية كافية من ACSF بحيث يطفو حامل شريحة. ضبط طول الأنابيب حتى نصائح من microloaders يمكن أن تبقى في زاوية واحدة من الطابق غرفة. عندما وضع في غرفة الحضانةحمام الماء، يجب أن يكون مستوى المياه في الحمام في نفس المستوى مثل ACSF في الغرفة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الشكل 2. تقدير الصحية شريحة. (A) شريحة الحصين صحي المظهر باستخدام النقيض تدخل الفرق (DIC) البصريات. شرائح صحية ديها على نحو سلس، ومظهر مخملي ونسبة عالية من الخلايا العصبية CA1 الهرمية صحية. لاحظ التشعبات قمية إسقاط في الطبقة المشععة. التصحيح، المشبك من الخلايا العصبية التي تشبه تلك التي تظهر هنا تكشف عن وجود انخفاض يستريح غشاء المحتملة (-61 إلى -62 بالسيارات) في مستوى 2.5 ملي K ⁺ ACSF مع قليل من إمكانات العمل العفوي. سوف تختلف الأسعار غشاء المحتملة وإطلاق النار بوصفها وظيفة من السابقtracellular K ⁺ (شيه وآخرون ^15). تشير الأسهم إلى الخلايا النجمية المفترضة. الاختصارات: ريال، الطبقة المشععة؛ s.py.، الطبقة الهرمية. شريط النطاق، 10 ميكرومتر. (B) شرائح غير صحية سيكون لها نسبة عالية من الخلايا العصبية الميتة CA1 الهرمية، والتي لها مظهر من البيض المقلي (تشير الأسهم البيضاء إلى نوى الخلايا العصبية الاموات - "صفار" من البيض المقلي). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3. تسجيل تضخيم النشاط جي كيو النوع من الاختزال ومجموعة أثار أنا mGluR كا ^{2 +} الردود بعد تثبيط طويلة الأجل من نقاط وصول الخلايا العصبية عن طريق الحضانة في TTX. (A) وصور الممثل من الخلايا في مجال تسجيل المحتضنة في جontrol الظروف (لوحات العلوي) أو في TTX (لوحات أقل) التي تناولها ولاية أوريغون الأخضر BAPTA-1:00 كا ^{2 +} صبغ المؤشر (لوحات اليسار) وSR-101 (لوحات وسط). شريط النطاق هو 10 ميكرون. تراكب كل من اشارات ("دمج") يشير إلى أن الخلايا النجمية الحمل مع كا ^{2 +} المؤشر. يتم رسم مربعات على الفرد سوما نجمية لتسجيل كثافة مضان بمرور الوقت في قناة خضراء لمراقبة كا ^{2 +} النشاط في الخلايا النجمية. (ب) عينة من صناديق آثار التسجيل في أ) من كا ^{2 +} النشاط في الخلايا النجمية. الخلايا النجمية المحتضنة في المعرض TTX زيادة النشاط العفوي وأثار مجموعة أكثر قوة وأنا mGluR كا ^{2 +} الردود كما يتضح من التغييرات في نمط الاستجابة. وتظهر كا ^{2 +} العابرين أمثلة من ذروة واحدة (دائرة)، multipeak (المستطيل)، والهضبة (المستطيل المنقط). (C) التغيرات في أنماط استجابة واضحة وخاصة باستخدام تناسق مختلفةحصص من المجموعة الأولى mGluR ناهض DHPG. أكثر multipeak وهضبة استجابات واضحة بعد الحضانة في TTX مقارنة التحكم في تركيز ناهض معين. (D) ارتفاع أوقات DHPG أثار كا ^{2 +} الردود وأسرع في الخلايا النجمية المحتضنة في TTX مقارنة التحكم (اللوحة العليا)، بينما لا تتغير سعة (اللوحة السفلى)، مما يدل على "كل شيء أو لا شيء" سعة الاستجابة مرة واحدة تم الوصول إلى عتبة للرد. (E) الارتفاع أوقات نجمية عفوية كا ^{2 +} العابرين هي أيضا أسرع في TTX المحتضنة مقابل السيطرة حضنت الخلايا النجمية (اللوحة العليا)، في حين بلغت نسبة الخلايا النجمية في عدد السكان واظهار عفوية جي كيو النوع من الاختزال كا ^{2 +} زيادة النشاط (اللوحة السفلى). انقر هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الشكل 4. تسجيل تقلص النشاط جي كيو نجمي النوع من الاختزال ومجموعة أثار أنا mGluR كا ^{2 +} الردود التالية زيادة طويلة الأجل في نقاط وصول الخلايا العصبية عن طريق الحضانة في البوتاسيوم خارج الخلية مرتفعة. (A) آثار ممثل نجمية كا ^{2 +} تسجيلات من شرائح المحتضنة في 5.0 ملي K ⁺ ACSF ليزيل الاستقطاب الخلايا العصبية وزيادة معدل اطلاق القاعدية مقارنة للسيطرة ACSF (2.5 ملي K ⁺ ACSF). الخلايا النجمية حضنت مع 5.0 ملي K ⁺ ACSF المعرض أقل عفوية الجسدية كا ^{2 +} العابرين وأضعف DHPG أثار ردود مقارنة مع الخلايا النجمية المحتضنة في السيطرة ACSF. (ب) مقارنة بين أنماط من الاستجابات أثار لتركيزات متعددة من أنواع DHPG يكشف استجابة أضعف بعد زيادة طويلة الأجل في نقاط وصول الخلايا العصبية. (C) انخفاض في نسبة الخلايا النجمية في بوويلاحظ pulation اظهار عفوية كا ^{2 +} النشاط بعد حضانة طويلة الأجل في K ⁺ مرتفعة مقارنة للسيطرة ACSF (اللوحة العليا)، بينما في أوقات ارتفاع النشاط العفوي تصبح أبطأ (أقل لوحة). (D) ارتفاع أوقات نجمية أثار كا ^{2 +} الردود على تركيزات مختلفة من DHPG تصبح أبطأ التالية 5.0 ملي K ⁺ العلاج مقارنة مع الخلايا النجمية المحتضنة في السيطرة ACSF. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Discussion

نماذج القياس وصفها تمثل الطرق العملية للبحث اللدونة طويلة الأجل من مجموعة نجمي أنا mGluRs. التصوير عفوية وأثار كا ^{2 +} الأحداث يوفر مقايسة الحساسة لقياس التغيرات في النشاط جي كيو نجمي النوع من الاختزال، كما تم تأسيس دليلا راسخا على أن نجمية كا ^{2 +} الارتفاعات تحدث بعد الإفراج عن IP ₃ مخازن الحساسة-R المصب التنشيط جي كيو ¹⁰ النوع من ^{الاختزال، 12، 17، 18.} نسبة الخلايا النجمية في الاستجابة لسكان المجموعة الأولى mGluR ناهض ونمط مثل كا ^{2 +} الردود التبليغ عن أي تغييرات في المجموعة الأولى mGluRs بواسطة الخلايا النجمية.

تقنية معينة تستخدم في تحميل النجمية مع كا ^{2 +} المؤشر هو أحد الاعتبارات الهامة في تصميم التجارب للبحث عن التغيرات في النشاط جي كيو نجمي النوع من الاختزال. بلعة التحميل أو تحميل الجزء الأكبر النجمية متعددة، أو عATCH المشبك تحميل النجمية الفردية يمكن استخدامها لصورة كا ^{2 +} العابرين في الخلايا النجمية. كل نهج يقدم مزايا وعيوب معينة. ملء الخلايا النجمية مباشرة مع كا ^{2 +} المؤشر عبر المشبك التصحيح يسمح تحديد لا لبس فيه للخلية باعتبارها نجمية دون الحاجة لعلامة الثانوية مثل SR-101. تمكن تسليم التصحيح، المشبك مؤشر أيضا تسجيل كا ^{2 +} النشاط من المقصورات نجمي الصغيرة بما في ذلك العمليات غرامة خطها، يحتمل أن تكون أعمق في شريحة حيث الخلايا أكثر صحة وأكثر مع التفاعلات سليمة مع نقاط الاشتباك العصبي (اعتمادا على قوة الليزر متوفرة). ومع ذلك، والتصحيح، المشبك التحميل يعاني من انخفاض الإنتاجية كما يتم جمع البيانات خلية واحدة في كل مرة. الجزء الأكبر التحميل، على النقيض من ذلك، يسمح لعدد كبير من الخلايا النجمية لتكون محملة كا ^{2 +} المؤشر وتصويرها في وقت واحد. ومع ذلك، الخلايا النجمية فقط بالقرب من السطح (<20 ميكرون) من شريحة يتم تحميلها، مع القلق المرتبطةو حول صحة الخلايا ونقاط الاشتباك العصبي سليمة.

احداهما بروتوكول بلعة التحميل المقدمة هنا يقدم حلا وسطا، مع إنتاجية عالية نسبيا والقدرة على رصد كا ^{2 +} النشاط أعمق داخل شريحة (40-75 ميكرون). ويلاحظ وجود زيادة كبيرة في نسبة الخلايا النجمية نشاطا عفويا باستخدام تقنية بلعة التحميل مقارنة الأكبر التحميل، مما يدل على أن الاتصالات بين الخلايا العصبية ونقاط الاشتباك العصبي العمليات نجمي هي أكثر اكتمالا ^15. مع تحميل جيدة، يمكن للمرء في كثير من الأحيان مراقبة كا ^{2 +} النشاط في العمليات الرئيسية من الخلايا النجمية (لا تظهر البيانات) أو حتى يحتمل أن تكون مقصورات أصغر باستخدام 2 الفوتون المجهري. ومع ذلك، سوف تحتاج إلى أن تمارس الرعاية في إسناد عمليات أصغر إلى نجمية خاصة، وحدود الذوبان في تلوين الخلفية غير محددة. مصدر قلق إضافية مع استخدام إجراءات الأكبر التحميل أو البلعة التحميل هو الحاجة لمار الثانويةكير لتحديد نجمية. في حين كان معروفا لسنوات عديدة أن الخلايا النجمية تفضيلي تناول AM استر كا ^{2 +} المؤشرات، وغالبا ما يتم استخدام علامة الثانوية SR-101 للتحقق من الخلايا النجمية تحميلها كما. قد SR-101 في حد ذاته تغيير استثارة الخلايا العصبية الذاتية ^لل29. استخدام SR-101 يعزز الحاجة لأداء جميع نجمية كا ^{2 +} قياسات في TTX للحد ممكن SR-101 الآثار على استثارة الخلايا العصبية. على افتراض أن كلا من السيطرة والمجموعات التجريبية وتشمل SR-101، ينبغي علامة في حد ذاته لا تفسر تأثيرات لوحظت في نجمية كا ^{2 +} إشارات التالية التلاعب على المدى الطويل من إمكانات العمل العصبية. SR-101 قد يكون أكثر مدعاة للقلق في ارتفاع K ⁺ التجارب، ومع ذلك، لأنه قد تقليص الفارق بين 2.5 ملي K ⁺ مقابل 5.0 ملي K ⁺ إذا لم يتم تغيير معدل اطلاق القاعدية نسبيا.

وثمة نهج واعدة جدا لتقديم كا ^{2 +} المؤشر إلى الخلايا النجمية برزت مؤخرا والذي يقدم بديلا جذابا لنهج أكثر تقليدية باستخدام كا ^{2 +} الأصباغ. وقد تم إحراز تقدم كبير على مدى السنوات القليلة الماضية مع مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIS) تستهدف الخلايا النجمية ^30-32. يمكن أن يتم تسليم GECIS إلى الخلايا النجمية في الجسم الحي بواسطة Microinjection من الغدة المرتبطة ناقلات فيروسية في منطقة الدماغ ذات الأهمية مثل الحصين. ويتحقق التعبير عن GECIS بعد حوالي أسبوعين بعد الإصابة الفيروسية ^32. هناك العديد من المزايا التي قدمها استخدام GECIS في الخلايا النجمية. أولا، يتم استهداف ناقلات إلى الخلايا النجمية باستخدام المروج نجمية محددة، وبالتالي فإن الخلايا النجمية المسماة هي ^32. الثانية، يبدو أن الضجيج إشارة إلى الآن مقارنة لما يمكن الحصول عليها باستخدام تسليم التصحيح، المشبك من الصبغة، ولكن من دون الغازية بعد أن كان عنده ماصة التصحيح على الخلية ^32. الثالث، يمكن أن تكون مؤشرات ديلivered وأعرب في أنسجة البالغين، وهي إشكالية باستخدام أساليب تسليم الجزء الأكبر التحميل. وعلاوة على ذلك، والتعبير هو فسيفساء، وتقدم القدرة على التفريق بين الخلايا النجمية متعددة. وبالتالي، يمكن أن يحتمل يمكن تصوير العديد من الخلايا النجمية في وقت واحد، في حين تم تسجيل أيضا في سوما والأفرع غرامة في نفس الوقت. وبالتالي، يمكن أن تستخدم واحدة يحتمل أن تكون تقنية واحدة بدلا من ثلاث تقنيات منفصلة (بالجملة التحميل، البلعة التحميل، والتصحيح، المشبك التحميل) لتسجيل توسيع نطاق نشاط GPCRs جي كيو نجمي، وزيادة الكفاءة بشكل كبير.

عيب واحد المحتملة لاستخدام التسليم الفيروسي بوساطة من كا ^{2 +} مؤشرات لالنجمية هو تأثير ممكن على شريحة الصحية ^32. وقد ثبت ناقلات الغدة المرتبطة الفيروسية المستخدمة لتقديم GECIS سبق أن يسبب رد الفعل دباق من الخلايا النجمية ^33. إعداد شرائح الدماغ بشكل عام من المرجح يبدأ المراحل المبكرة من الأمراض بما في ذلك الافراج عن الوقود النووي المشعlammatory جزيئات ^10. لذا، جنبا إلى جنب مع العصر الحضانة الطويلة اللازمة للحث على التحجيم من المستقبلات نجمي، ألقى استخدام GECIS باستخدام ناقلات فيروسية في حاجة لتلقي مزيدا من الاعتبار في سياق الصحة شريحة في هذه الأنواع من التجارب.

عند استخدام هذا البروتوكول، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن الوقت لتطبيق ناهض على إنتاج رد فعل ستختلف بوصفها وظيفة من توافر مستقبلات. لتركيز معين من ناهض، ووقت التطبيق يجب أن تكون لفترة أطول إذا وقلصت مستقبلات أسفل، وأقصر إذا قلصت مستقبلات يصل، للدواء للوصول إلى تركيز كاف في الأنسجة لتنشيط مستقبلات بما فيه الكفاية لإنتاج كا ^{2 +} استجابة. لذلك، مرة تطبيق المخدرات، ويحتمل أن تكون تركيزاتها، قد يكون من الضروري تعديل تبعا للاتجاه المقصود من التحجيم. على سبيل المثال، قد تحتاج تركيز ناهض أن يكون خفضت في جبورصة عمان من TTX لتجنب تشبع الردود، وزادت بعد احتضان شرائح في ارتفاع K ⁺ لنرى حتى استجابة. على وجه التحديد، وقد تحول تركيز DHPG 5-15 ميكرومتر بعد العلاج TTX إلى 30-50 ميكرومتر بعد العلاج 5.0 ملي K ⁺ من أجل دراسة كا ^{2 +} أنماط ردا على ذلك، كما كان 5-15 ميكرومتر غالبا ما تكون منخفضة جدا لإنتاج استجابات يمكن الاعتماد عليها في الخلايا النجمية بعد تقليص من المجموعة الأولى mGluRs.

تسجيل نجمية كا ^{2 +} النشاط لا يقدم أي دليل مباشر على مستقبلات الإدراج أو استيعاب أو من غشاء البلازما. ومع ذلك، استنادا إلى تشابه لافت للبيانات مع البيانات من الدراسات السابقة في المختبر والتي بحثت في العلاقة المباشرة بين مستويات التعبير جي كيو النوع من الاختزال وعفوية وأثار كا ^{2 +} العابرين ^21-24، والتفسير الأكثر منطقية للتغيرات في كا ^{2 +} الإشارات هو أن مستويات التعبير سطح مستقبلات نجمية ديكتغيرت. قد يكون هناك نهج تكميلية من الاعتبارات المهمة إذا كان أحد يريد أن يقدم أدلة إضافية حول المكان من تأثير على كا ^{2 +} النشاط. وكان من الاستراتيجية التي استخدمناها لفحص تأثير TTX الحضانة على شرائح الحصين من الفئران MrgA1R نجمي. هذه الفئران المعدلة وراثيا تعبر عن جي كيو النوع من الاختزال الأجنبية (وMrgA1R) فقط في الخلايا النجمية. لأن هذا مستقبلات ليست أصلية في الدماغ، وليس هناك ناقل عصبي الذاتية الحاضر لتغيير مستويات نشاطها. اقترح العمل السابق أن هذا مستقبلات يشرك نفسه داخل الخلايا مما يشير جزيئات كمجموعة الذاتية أنا mGluRs في نفس الخلايا النجمية ^34. الحضانة بعد فترة طويلة الأجل لشرائح من الفئران MrgA1R في TTX، حضنت عدم وجود فروق في استجابات أثار ناهض MrgA1R مقارنة السيطرة littermate أن شرائح توفر أدلة على أن التأثير على نجمية هو كا ^{2 +} النشاط نتيجة للتغيرات المحلية لمستقبلات السطح، وخاصة إذا استجابات المجموعة الأولى mGluR لا تزال signifتعزيز icantly في نفس الخلايا النجمية. كبديل لذلك، على الرغم من استراتيجية ربما أكثر انخراطا سيكون لعزل الخلايا النجمية من شرائح لتحليل لطخة غربية، طالما كسر الغشاء يمكن تحليل التغيرات في مستويات التعبير سطح مستقبلات. مضان المنشط خلية الفرز (FACS) أو التدفق الخلوي قد تكون مفيدة هنا.

التطبيقات المحتملة لهذه التقنية لدراسة الخلايا العصبية، الخلايا النجمية والتفاعلات العصبية نجمية كثيرة. في تجاربنا، فقط مجموعة DHPG أثار-I mGluR تمت دراسة نجمي كا ^{2 +} الردود، في شرائح الحصين الحادة المعزولة من الفئران الأحداث. هذا التحضير لا يحتوي فقط على afferents سليمة (الضمانات شيفر)، ولكن أيضا الخلايا العصبية التي تثير لهم (خلايا CA3 الهرمي)، مما يجعل من الممكن لمعالجة معدلات إطلاق هذه الخلايا العصبية الجلوتاميرجي على الخلايا بعد المشبكي (الخلايا CA1 الهرمية) و والخلايا النجمية في الطبقة المشععة التي associat لعملياتالبريد مع هذه نقاط الاشتباك العصبي. شريحة الحصين الحادة قد لا يكون أفضل إعداد لمعالجة معدلات إطلاق أنواع أخرى من الخلايا العصبية، ومع ذلك، وقطعت العديد من afferents من الخلايا العصبية التي تؤدي إليها. ومع ذلك، قد يكون من الممكن في بعض الاستعدادات شريحة لمراقبة اللدونة أخرى فرعية جي كيو النوع من الاختزال نجمي. على سبيل المثال، يمكن إعداد شرائح مع الخلايا العصبية القاعدية الدماغ الأمامي كوليني واسقاطاتها لقرن آمون سليمة. أن الحضانة من هذه الشرائح في TTX أو مرتفعة K ⁺ تؤثر على معدلات اطلاق القاعدية من الخلايا العصبية كوليني، مما يؤدي إلى تقشر mAchRs في الخلايا النجمية من الطبقة المتجهة، التي تتلقى جزءا كبيرا من المدخلات كوليني ^1. بديل النهج لم تختبر حتى الآن لدراسة نجمي التحجيم مستقبلات داخل منطقة محددة من الدماغ، مع كل من وصلات سليمة أثناء حدوث تقشر، يمكن أن يكون لاستخدام نموذج في الجسم الحي حيث يتم التوصل إلى الإفراج مستمرة من قبل TTX غرس بلاستجيم البوليمر Elvax 40W فوق المنطقة ذات الاهتمام ^35. وقد استخدم هذا النهج مسبقا في دراسة الخلايا العصبية التحجيم ولكن ينبغي أيضا أن تنطبق على تحجيم نجمي. أخيرا، مع قراءات الصحيحة، يمكن أن تتحرى دراسات مستقبلية الأسر النوع من الاختزال الأخرى، بما في ذلك التغيرات في G _و G أو _ط GPCRs. يمكن للمرء أن يتنبأ نجمي GABA _B G _ط GPCRs أن تتأثر التالية تثبيط إطلاق النار في إسقاط محليا interneurons GABA داخل أي إعداد شريحة. وضع مؤشرات جديدة تستهدف الجزيئات يشير أخرى، مثل مؤشر في الوقت الحقيقي من مخيم رسول الثانية، سيفتح مجالا جديدا من البحوث على الخلايا العصبية مستقبلات الاتصالات، إلى نجمية.

التحجيم ثنائية الاتجاه من mGluRs نجمي بواسطة التلاعب في أسعار إطلاق الخلايا العصبية القاعدية يوفر مقياسا لحساسية الخلايا النجمية لإطلاق AP بوساطة من الناقل العصبي. الخلايا النجمية على ما يبدو يمكن الشعور العفوي ونقاط وصول glutamaإطلاق الشركة المصرية للاتصالات في شافر ضمانات-CA1 نقاط الاشتباك العصبي الخلية الهرمي حتى عندما خارج الخلية K ⁺ هو ضمن نطاق الفسيولوجية. في حين تطبيق الحاد في TTX لا يقلل من تواتر نجمية عفوية كا ^{2 +} النشاط ^{18، 36، 37،} كا ^{2 +} النشاط بين الخلايا النجمية في عدد السكان يصبح decorrelated ^36، وتوفير دليل على أن مستقبلات نجمي هي كشف AP. هذا يشير إلى أن الخلايا النجمية العصبية نقاط وصول الشعور العفوي مع عدم وجود تأثير على حالتهم كا ^{2 +} النشاط. ومن المقبول على نطاق واسع أن تركيزات داخل الخلايا من ₃ IP بحاجة للوصول إلى مستوى عتبة لتحفيز IP ₃ روبية بما فيه الكفاية ليؤدي إلى كشف كا ^{2 +} الارتفاع. يمكن نقاط وصول الخلايا العصبية عفوية تفعيل GPCRs نجمي دون إنتاج قابلة للقياس كا ^{2 +} الارتفاعات؟ يمكن الاستفادة من الدراسات المستقبلية الإسفار الرنين نقل الطاقة (الحنق) أو ميتاليك مماثلة النظام العالمي (مثل بريت) لدراسة العلاقة بين بروتين G اقتران لمستقبلات (مقياس لتنشيط مستقبلات) والكالسيوم ^{2 +} الإفراج عن مخازن الداخلية. وقد استخدم على نطاق واسع في المختبر بريت للكشف عن البروتين G إلى النوع من الاختزال اقتران ^38، على الرغم من أنه قد يكون هناك بعض الوقت قبل أن تصبح هذه التكنولوجيا متاحة للاستخدام في الأعمال التحضيرية الأنسجة سليمة. فمن الممكن أن GPCRs جي كيو نجمي يتم تفعيلها بشكل متكرر أكثر من يمكن تسجيلها باستخدام أدوات كا ^{2 +} التصوير المتاحة حاليا. بالإضافة إلى الاستشعار عن إمكانات العمل، قد يكون GPCRs جي كيو نجمي أيضا قادرة على الكشف عن الإفراج كمي مصغرة من الناقل العصبي كما ورد في دراسة حديثة ^39. طريقة التحجيم ثنائية الاتجاه وصفها هنا يمكن أن تستخدم في الدراسات المستقبلية لتوفير مقياس لمدى GPCRs نجمي جي كيو كشف الافراج الحويصلي كمي من الناقل العصبي، بما في ذلك عن طريق bafilomycin A1 في البروتوكول الحضانة.

ntent "> وحتى الآن، فقط تم استخدام بروتوكولات التوسع في شرائح قرن آمون من الفئران الأحداث (P12-P18). لذلك، فإنه غير معروف حاليا إذا يمكن أيضا أن يتسبب نجمي مستقبلات التوسع في الأنسجة التي تم الحصول عليها من فئران بالغة. دراسة مقنعة الأخيرة يوحي بأن المجموعة الأولى mGluR التعبير في الخلايا النجمية يقلل إلى حد كبير بعد الأسبوع الأول من العمر ويستمر في الانخفاض حتى سن البلوغ، مع مستويات منخفضة جدا من التعبير مستقبلات في الخلايا النجمية الكبار ^40. ولذلك سيكون من المثير للاهتمام أن تحديد ما إذا كان توسيع نطاق mGluRs نجمي في أعقاب فترة طويلة تثبيط مدة إطلاق الخلايا العصبية في قرن آمون الكبار شرائح الماوس إلى مستويات تقترب من تلك التي ظهرت في الخلايا النجمية من الفئران الأحداث. أن هذه النتيجة تشير إلى أن نجمي التعبير مستقبلات ليست ساكنة في سن معين ولكن يمكن أن تتغير بسرعة تبعا مستويات نشاط الخلايا العصبية. وعلى النقيض من انخفاض التعبير من المجموعة الأولى mGluRs في فئران بالغة، الأدلة الناشئة التي المستقبلات الأدرينالية، بما في ذلك & #945؛ _{1A، 2A} α، β ₁ وفرعية، وأعرب في الغالب عن طريق الخلايا النجمية في الدماغ الكبار ^{3، 4.} والأدرينالية α _1A جي كيو النوع من الاختزال قد يكون هدفا جذابا للدراسات المستقبلية من الاتصالات العصبية إلى نجمية، بما في ذلك ما إذا كانت هذه المستقبلات حساسة للتغيرات في معدلات هرمون التوتر إطلاق الخلايا العصبية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamber Supplies
Brinkmann pipette storage container	Fisher Scientific	03-491	Use the drawer portion as the incubation chamber
Electrical drill
Flexible tubing	Tygon	R-3603
Silicone seam sealant			Also called aquarium seam sealer
Gas tank			95% oxygen, 5% carbon dioxide
Natural beveled pipette tip	USA Scientific	1111-1000	Cut-to-fit to connect oxygenate lines
One-to-six lines manifold	Warner Instruments	64-0210 (MP-6)	For the microloader-manifold apparatus
Microloader	Eppendorf	5242 956.003	For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit
Floating Bubble Rack	Bel Art Scienceware	F18875-0400	For slice holder
600 µm Sefar Nitex Nylon mesh	ELKO Filtering Co.	06-600/51	For slice holder
Krazy Glue			For slice holder
Reagents
Isoflurane	Baxter	1001936060
NaCl	Fisher	S271-3
KCl	Fisher	P333-500
CaCl2	Fisher	C79-500
MgCl2	Fisher	M33-500
NaH2PO4	Fisher	S369-500
NaHCO3	Fisher	S233-500
Glucose	Fisher	Fisher
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)	Acros Organics	53188-07-1
Ascorbic acid	Acros Organics	401471000
Tetrodotoxin citrate (TTX)	Abcam	ab120055
Sulforhodamine 101 (SR-101)	Sigma-Aldrich	284912
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Pluronic Acid F-127	Invitrogen, Molecular Probes	P6867
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging)	Invitrogen, Molecular Probes	O6807
(RS)-3,5-DHPG	Abcam	ab120020
Histamine	Sigma-Aldrich	H7125
Carbamoylcholine chloride (Carbachol)	Sigma-Aldrich	C4382
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP)	Sigma-Aldrich	A7699
Dissection Tools
Single-edge razor blade	GEM	62-0161	For bisection
Double edge razor blade	TED PELLA, INC.	121-6	For cutting slices
Mayo Scissors, supercut	WPI	14010-15	For decapitation
Fine iris scissors, straight	Fine Science Tools	14094-11	For cutting the skull
Iris forceps, curved	WPI	15915	To remove the skin and skull
Small spatula			To remove/transfer the brain
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps	Fine Science Tools	11295-10	For hippocampus dissection
Glass Pasteur pipette	Fisher	13-678-20B	For transferring brain slices
Pasteur pipette rubber bulb	Fisher	03-448-22	For transferring brain slices
Polystyrene 100 mm tissue culture dishes	Corning	25020
Vibratome	Leica	VT 1200S
Water bath	Fisher	ISOTEMP 210	For warm incubation
Micropipette puller	Narishige	PC-10	For bolus-loading pipette
Confocal microscope	Olympus	Olympus Fluoview 1000
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform	Warner Instruments	RC-26GLP	diamond bath with low profile
Borosilicate glass pipette	World Precision Instruments	TW150F-4	For bolus-loading pipette
Micromanipulator	Sutter Instrument	ROE-200	For bolus-loading pipette
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate	Costar	8161