في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

Summary

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Abstract

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

Introduction

علم البصريات الوراثي قد أحدثت ثورة على مستوى النظم علم الأعصاب في بحثها عن عناصر الدارة العصبية المحركة الدول السلوكية الطبيعية والأمراض ذات الصلة. قدم اكتشاف أن opsins الميكروبية حساسة للضوء ¹ يمكن التعبير عن وظيفيا في خلايا الثدييات منصة لاستخدام الضوء لسيطرة غير مسبوقة من النشاط العصبي مع درجة عالية من الدقة المكانية والزمانية ^2. على عكس النهج الكهربية أو الدوائية التقليدية إلى التلاعب في النشاط العصبي، علم البصريات الوراثي يسمح للتحكم في أنواع معينة من الخلايا (على أساس وراثي أو تحديد المكاني الإسقاط) ضمن السكان غير متجانسة وعلى فترات زمنية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. قدم مقدمة لاحق من واجهة العصبية البصرية أداة عملية لإيصال الضوء إلى تتصرف الحيوانات ^3. وقد سمح هذا في الوقت الحقيقي للتعديل الدوائر العصبية المحددة في القوارض التصرف مستيقظا من أجل اختبار سببيا لدور هذه الدوائر العصبية في الحكم من الدول السلوكية ذات الصلة للأمراض العصبية والنفسية ^4-6. علم البصريات الوراثي، وبالتالي، يمثل أداة قوية لتقديم داخل أي مختبر مهتمة في التحقيق في العلاقة الوظيفية بين نشاط الدماغ والتدابير السلوكية أو الفسيولوجية في النماذج الحيوانية.

تصميم ناجح والانتهاء من تجربة optogenetic ينطوي على الخطوات والاعتبارات المختلفة (انظر الشكل 1). والهدف من هذا البروتوكول الحالي هو تزويد الأفراد بالأدوات والمكونات، جنبا إلى جنب مع المعرفة النظرية والعملية، اللازمة لأداء التحفيز optogenetic في القوارض التصرف مستيقظا. حاليا، هناك نوعان من نطاقات الطول الموجي السائدة المستخدمة لتنشيط قنوات أوبسين الميكروبية: في أطياف الأزرق (عادة 473 نانومتر) والأخضر والأصفر الأطياف (عادة 532 أو 591 نانومتر). كل من الليزر والتي ينبعث منها ضوء الثنائيات (المصابيح) ويمكن استخدام مصادر الضوء لدeliver موجات محددة من الضوء لأنسجة المخ. ضوء غير متماسك المنبعث من المصابيح، ومع ذلك، يجعل انتقال الفعال للضوء صعوبة عندما اقتران في الألياف الأساسية الصغيرة اللازمة لفي الجسم الحي القوارض التحفيز. البت في التجمع الليزر المناسب هو الخطوة الأولى الحاسمة وسوف تعتمد على الاستخدام المقصود من علم البصريات الوراثي في ​​المختبر. يصف البروتوكول الحالي طرازين الأساسية التي تختلف في سهولة بهم التجمع والاستخدام: الليزر إلى جانب ما قبل واحد وأنظمة ليزر مزدوج (انظر الشكل 2). أنظمة ليزر واحدة أن تقترن مسبقا من قبل الشركة المصنعة جاهزة للذهاب أساسا لدى وصوله مع قليل من دون مجموعة المتابعة المطلوبة ولكن لديها عيب الحد الأدنى من التخصيص للمستخدم النهائي. وهناك نظام ليزر مزدوج يتيح تسليم اثنين من أطوال موجية مختلفة أسفل نفس الألياف. هذا وسوف تصبح ذات أهمية متزايدة مع ظهور علم البصريات الوراثي اندماجي حيث يمكن أن تستخدم أطوال موجية مختلفة لتفعيل / تمنع distincأنواع الخلايا التائية التي هي مكانيا شارك المترجمة. وهذا أمر ضروري للاستخدام مع ثنائية مستقرة opsins وظيفة الخطوة حيث يتم البدء photocurrents وإنهاء بواسطة الضوء الأزرق والأصفر، على التوالي ^7،8 أيضا. أنظمة ليزر المزدوجة هي أيضا قابلة للتخصيص كما يمكن للمستخدم إضافة أو إزالة مكونات (على سبيل المثال، مصاريع الخارجية، والمرشحات شعاع، لقياس الطاقة مضمنة) من مسار الشعاع كما هو مطلوب. نظرا لتنوعها، فمن المستحسن ليزر مزدوج انشاء إذا علم البصريات الوراثي سيكون أداة استمرار المستخدمة في المختبر. اقتران من الليزر، ومع ذلك، يمكن أن يمثل تحديا وحتى يتم توفير آلية اقتران سريعة وسهلة، ويمكن الاعتماد عليها في هذا البروتوكول. ملاحظة، هذا البروتوكول تفاصيل تجميع المكونات البصرية ويستخدم التصحيح بالحبال والمكونات التي هي الأمثل للألياف خطوة مؤشر المتعدد مع 200 ميكرون الأساسية والفتحة العددية (NA) من 0.22. أحجام الأساسية المختلفة وNA متاحة للشراء، ولكن جميع مكونات يجب أن تتطابق بشكل مثالي من حيث الأساسيةحجم وNA لتجنب فقدان الخفيفة في نقاط اتصال الألياف. بدلا من ذلك، في اتصال الألياف، يمكن أن الضوء يمر من أصغر إلى حجم الأساسية أكبر؛ و / أو من-NA السفلي إلى أعلى-NA الألياف دون خسارة إضافية.

وتقدم استراتيجيات الربط التي تسمح لتحفيز وقت واحد من الفئران متعددة للالإنتاجية العالية اختبار السلوكي. تفترض البروتوكولات المقدمة استخدام الألياف القابلة للزرع المزمنة للاختبار السلوكي ولكن يمكن تعديلها لبروتوكولات التحفيز الحادة. الألياف مزروع تماما هي مفيدة للجمع بين تحفيز optogenetic مع التلاعب الدوائية، منذ نفس قنية يمكن أن تستخدم لتوصيل الأدوية وغيض من الألياف البصرية إلى نفس الموقع. و، ومع ذلك، ينصح بشدة استخدام الألياف مزروع مزمنة لعدة أيام الاختبارات السلوكية كما أنه يقلل من تلف الأنسجة المرتبطة الإدراج المتكررة وإزالة الألياف ويزيد من دقة من حيث وضع ثابت من الألياف لالإضاءة الأنسجة ^3. عندما يقترن مع تكوينات الربط الموصوفة هنا، يمكن تسجيل السلوك موثوق عبر أيام متعددة. أشهر وبالفعل، تم الإبلاغ عن انتقال الضوء يمكن الاعتماد عليها بعد الألياف زرع ⁹ بحيث التحفيز المزمن ونماذج الاختبارات السلوكية يمكن، نظريا، أن تنفذ عبر الأيام والأسابيع متعددة. تم إضافة ملاحظات إضافية على مكونات الأجهزة إلى بروتوكول للسماح للاختيار القارئ في أفضل المنتجات التي تناسب احتياجاتهم الفردية، بما في ذلك بدائل فعالة من حيث التكلفة والمنتجات التي يمكن أن يتم في المنزل. وتقدم أيضا النصائح الهامة التي هي مفيدة أثناء الإعداد والتنفيذ.

Protocol

! تنبيه: ويشمل هذا البروتوكول استخدام 3B فئة الليزر وسوف تتطلب المبادئ التوجيهية التدريب والسلامة المناسبة التي ينبغي اتباعها. يجب أن ترتديه نظارات السلامة في جميع الأوقات عندما تعمل أشعة الليزر، مع إجراءات المواءمة إهداء عالية المخاطر على وجه الخصوص. الاتصال بموفر ليزر لتحديد النظارات التي توفر توهين القصوى ليزر معين. إذا كان متوفرا، الانخراط في دورة تدريبية للسلامة الليزر المؤسسي. أبدا تشغيل الليزر دون نظارات السلامة المناسبة والتدريب.

1. جهاز ليزر لمجموعة المتابعة

عند الاقتضاء، يتم تعيين الخطوات في القسم (1)، (A) أو (B) للتمييز بين أنظمة ليزر واحدة أو مزدوجة، على التوالي.

1. نعلق وتأمين الليزر إلى اللوح. الألواح هي الموصلات الحرارة ممتازة وبمثابة بالوعة الحرارة لمنع تلف مكونات الليزر الداخلية مع الاستعمال لفترة طويلة.
2. (A) تأمين لاس جانب ما قبلإيه إلى 10 "× 12" اللوح (أو كما هو مطلوب) باستخدام ¼-20 "مسامير الغطاء وغسالات (الشكل 2A). إذا الثقوب اللوح لا تتماشى مع الليزر تصاعد الثقوب، واستخدام 'المشابك الجدول' صغيرة لتأمين الليزر لاللوح.
3. (ب) إذا كان ليزر 2 لاستخدامها أن يكون ارتفاعها شعاع مختلفة جدا (> ~ 1 سم)، واستخدام 4 "× 6" الألواح الصغيرة لخلق منصة للواحدة من الليزر. نعلق هذه المجالس إلى الرئيسية الكبيرة 12 "× 18" اللوح يستخدم ¼-20 "مسامير الغطاء مع غسالات، ثم إرفاق الليزر لوحات أصغر باستخدام البراغي أو المشابك الجدول كما هو موضح في الشكل 2B. إرفاق الليزر الأخرى مباشرة إلى اللوح باستخدام البراغي أو متغير الجدول ارتفاع المشبك.
   خطوة حاسمة: الألواح، ومسامير، والمكونات البصرية يمكن شراؤها كما الامبراطورية أو قياس بحيث تكون متسقة عند شراء مادة؛ الافتراضي لهذا البروتوكول هو الإمبراطوري.
4. (A)إرفاق سميكة تغلف مسطحة يلتصق / اتصال جسدي (FC / PC) التصحيح الحبل إلى مقرنة (ويشار إلى سلك مقرنة؛ انظر الشكل 3) التي يتم تركيبها فعليا إلى أمام ليزر (الشكل 2A).
5. (B) الموضوع مقرنة الصعود إلى ¾ "آخر البصرية، ثم الايبوكسي المشترك بين مقرنة والجزء العلوي من آخر باستخدام JB كويك، أو الايبوكسي مماثل، لمنع وتخفيف واختلال أثناء الاستخدام. إرفاق آخر إلى اللوح (كما سوف الثقوب اللوح لا خط دائما حتى مع وضع المطلوب من المكونات البصرية، حامل آخر، التمثال محول قاعدة، وتحامل شوكة تستخدم لتأمين مشاركة مقرنة والبصرية في المكان). إرفاق التصحيح الحبل سميكة جاكت (الحبل مقرنة) إلى الجزء الخلفي من مقرنة.
6. (B) إدراج أول مرآة التوجيهية للالليزر الأزرق في حامل الحركية، وإرفاقه اللوح باستخدام ¾ "آخر البصرية. نعلق هذه المشاركه اداب قاعدةثالثا وتحامل شوكة. ضع شوكة لقط والرد على التجمع مباشرة أمام الليزر الأزرق مع مرآة الزاوية في 45 درجة لتوجيه الليزر نحو المرآة مزدوج اللون. استخدام نمط الشبكة من الثقوب على اللوح كدليل محاذاة الخام. وضعه مرة تقريبا، واستخدام المسمار ¼ "-20 غطاء لتأمين شوكة تحامل على اللوح (انظر الأرقام 2B، C).
7. (B) إدراج المرآة مزدوج اللون إلى حامل الحركية ونعلق عليه إلى "آخر البصرية 1 وتأمين مباشرة إلى اللوح. ضع المرآة مزدوج اللون الى اقصى اليسار من، وتمشيا مع، ومرآة ليزر زرقاء. زاوية ينعكس المرآة مزدوج اللون في زاوية 45 درجة بحيث ينعكس الضوء الأزرق قبالة المرآة الأولى في مقرنة، ثم تشديد المسمار ربط حامل الحركية إلى آخر (انظر الأرقام 2B، C).
8. (B) إرفاق أول مرآة التوجيهية ليزر الأصفر إلى ¾ "آخر البصرية. إرفاق أوبتيآخر كال إلى محول قاعدة وتحامل شوكة. ضع شوكة لقط وبعد الفرقة مباشرة أمام الليزر الأصفر وزاوية المرآة في زاوية 45 درجة بحيث الضوء الأصفر ستوجه نحو المرآة التوجيه الثانية. تأمين شوكة لقط في مكان مع ¼ "-20 المسمار غطاء وغسالة.
9. (B) إرفاق مرآة القيادة الثانية للالليزر الأصفر إلى "ما بعد البصرية 1. زاوية المرآة بحيث شعاع ضوء أصفر من المرآة الأولى سوف تنعكس من خلال مزدوج اللون وإلى مقرنة (الشكل 2C). تأمين وظيفة مباشرة إلى اللوح وتشديد المسمار في تصاعد مستمر بمجرد أن المرآة هي الزاوية بشكل مناسب. سيتم إجراء تعديلات مرآة غرامة باستخدام يتصاعد مرآة الحركية في خطوة لاحقة.
10. (B) إرفاق عجلة تصفية الكثافة المحايدة إلى ¾ "آخر البصرية ووضع آخر إلى حامل آخر تعلق على قاعدة متزايدة. تأمين الفرقة إلى اللوح بين الأول وحد ذاتهاالمرايا الصفراء كوند باستخدام واحد ¼ "-20 سقف المسمار. وتستخدم هذه العجلة لضبط قوة أصفر ضوء الليزر الوصول إلى مقرنة.
    نصيحة: تشديد فردي كافة المكونات (مثل مسامير عقد أصحاب مرآة الحركية إلى أعلى المشاركات والمواضيع عقد محولات قاعدة إلى أسفل المشاركات) قبل ضمهم للقاعدة. استخدام رمح وجع عرافة صغير في المقدمة من خلال ثقوب في المشاركات البصرية للحصول على ما يكفي من عزم الدوران. هذا سوف يمنع مكونات التساقط أثناء الاستخدام، مما يستلزم إعادة.
11. إرفاق FC / PC إلى FC / PC محول L-قوس إلى اللوح.
12. اختياري: تأمين 1 × 2 50/50 مصغرة الألياف مكعب الخائن مباشرة إلى اللوح للفي وقت واحد التحفيز في الجسم الحي من اثنين أو أكثر من الحيوانات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة مقابض للمساعدة في حركة التجمع اللوح (كما رأينا في الشكل 2A).

2. الليزر اقتران (عدم الاتصال نمط اقتران)

ويتعلق هذا القسم إلى ثنائي ليزر انشاء (الشكل 2B). محاذاة طريق الليزر الأزرق الداخلي قبل محاذاة طريق الليزر الأصفر الخارجي.

! تنبيه: استخدام ضوء انخفاض اقتران السلطة (~ 1 ميغاواط) لضمان سلامة العين. ارتداء نظارات السلامة إلى السلطة على الليزر وحتى يتم قياس شدة الضوء ويعتبر أن تكون آمنة.

1. تعيين مفاتيح على الجزء الخلفي من الليزر ل"بالعملة" (التيار) ووضع الترانزستور الترانزستور المنطق (TTL) + لإضاءة ثابتة (على العكس من وضع النظير). تأكد من أن يتم تعيين مقبض الباب الطاقة على أمام السائق عند مستوى الصفر. بدوره على الليزر عن طريق تشغيل السائق أولا ثم مفتاح الليزر.
2. ضبط ببطء مقبض الطاقة الموجود على الجزء الأمامي من سائق ليزر بحيث يتم المنبعثة ضوء الليزر ~ 1 ميغاواط. الانتظار 10-15 دقيقة (أو كما هو محدد من قبل الشركة المصنعة) ليزر في عملية الاحماء.
3. قم بتوصيل كابل الألياف البصرية اختبار مباشرة إلى الصحائفه نهاية التصحيح الحبل مقرنة وبدوره على اختبار كابل (الشكل 3A). ضبط زاوية مقرنة بحيث شعاع أحمر يسافر مباشرة نحو العودة الى مركز المرآة مزدوج اللون. مسار الشعاع من الضوء الأحمر المنبعث من اختبار الكابل هو المسار الدقيق أن ضوء الليزر واردة سوف تحتاج إلى متابعة من أجل أن يقترن في الليزر.
4. إجراء محاذاة الخشنة: استخدام المقابض الجانبية والأفقي على المرايا الحركية لتوجيه شعاع من ضوء الليزر إلى مقرنة. قد تحتاج المشابك التمثال إلى أن خففت لإعادة قليلا المرايا ومقرنة. ينبغي أن يتصاعد الحركية لا تزال لديها بعض السفر متاحة للمزيد من التعديلات غرامة. لا يشعر بالقلق إذا تم المنبعثة أي ضوء أزرق من التصحيح الحبل المرفقة مقرنة في هذا الوقت.
5. وضع قطعة واحدة من الورق شبه شفافة مباشرة أمام المرآة مزدوج اللون، في فترة ما بين مزدوج اللون ومقرنة. سيكون هناك على حد سواء الأزرق وعإد نقطة على هذه الورقة من الليزر واختبار كابل، على التوالي. تستخدم ورق شفاف بما يكفي لرؤية كل من البقع الحمراء والزرقاء في وقت واحد من نفس الجانب من الورق.
6. إجراء تعديلات غرامة إلى المرآة التوجيهية الأولى (أي أقرب واحد ليزر، وليس مزدوج اللون) من خلال تعديل بعناية المقابض الجانبية والأفقي لمحاذاة وسط نقطة حمراء مع النقطة الزرقاء.
7. نقل الورق مرة أخرى نحو مقرنة بحيث يكون مباشرة أمام مقرنة وضبط المقابض في الثاني (أي، مزدوج اللون) مرآة لمحاذاة شعاع الليزر مع شعاع أحمر.
8. تكرار عبر الخطوات 2.6 و 2.7 حتى يتم محاذاة وسط الحزم الزرقاء / الصفراء والحمراء بالضبط في كل المواقف (أي حتى أشعة الحمراء والزرقاء هي colinear).
9. إزالة اختبار كابل من الحبل مقرنة. الآن يجب أن تنبعث ضوء الليزر من نهاية الحبل مقرنة التصحيح.
10. Determiكفاءة اقتران شمال شرق عن طريق قياس قوة الضوء المنبعث من غيض من الألياف من الحبل التصحيح مقرنة باستخدام السلطة متر. استخدام الإعداد 500 ميغاواط على الثنائي الضوئي السلطة متر وتغيير الإعداد الطول الموجي (λ) إلى اللون الأزرق (473 نانومتر) أو ضوء أصفر (635 نانومتر) الطيف اعتمادا على الليزر المستخدمة.
11. ضع غيض من الألياف عمودي على الثنائي الضوئي للحصول على القراءة السلطة. مقارنة بين قوة الضوء التي تدخل مقرنة إلى قوة الضوء المنبعث من نهاية الألياف. ويعتبر وكفاءة اقتران> 80٪ جيد جدا. تعديلات صغيرة جدا مزيد من المرآة التوجيه الثانية يمكن في بعض الأحيان تتحسن قليلا اقتران. بشكل عام، عندما نمط شعاع من نهاية الألياف اقتران هو، ضيقة، بقعة صغيرة المركزية (مع عدم وجود حلقات المحيطة به)، واقتران الكفاءة في صلب الألياف هو الأمثل.
12. كرر الخطوات 2،1-2،11 للأصفر اقتران الليزر، باستثناء استخدام اثنين من المرايا التوجيهية ليزر الأصفر (انظر الشكل 2C). هل لار ضبط سيتم فقدان موقف المرآة مزدوج اللون أو محاذاة الليزر الأزرق.

3. في الجسم الحي تحفيز Optogenetic

ضمان أن يتم إجراء أي الإجراءات التي تنطوي على استخدام الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية والوطنية والموافقة عليها من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان المقابلة واستخدام اللجنة.

1. الألياف البصرية انشاء (انظر الشكل 3B للتعرف على أنواع مختلفة من الحبال التصحيح المشار إليها أدناه). لتحفيز ماوس واحدة، قم بتوصيل سلك مقرنة التصحيح إلى التصحيح الحبل سميكة جاكت باستخدام FC / FC محول L-قوس يعلق مباشرة على اللوح (انظر الشكل 4A). لتحفيز اثنين من الحيوانات من ليزر واحد، قم بتوصيل سلك التصحيح مقرنة لاثنين من الحبال التصحيح سميكة تغلف باستخدام المكعب 1 × 2 50/50 صغيرة (انظر الشكل 4B). لتحفيز ثلاثة أو أكثر من الحيوانات، ونعلق الحبل مقرنة إلى الخائن الألياف متعددة باستخدام 1 × 2 مترمكعب رسائل كتبها هذا المؤلف تعلق بالفعل إلى اللوح (انظر الشكل 4C).
2. إرفاق العاكس / مفصل دوار لينتهي خالية من التصحيح الحبل / ألياف سميكة تغلف الخائن. مفاتيح التحويل ضرورية لأنها تسمح دوران الألياف مع حركة القوارض، والذي يمنع تراكم من عزم الدوران على الحبل التصحيح. الكثير من عزم الدوران يمكن تحريف الحبال، وتؤدي إلى الكسر، وتتداخل مع الحركة الطبيعية للحيوان أثناء الاختبار.
3. إرفاق التصحيح الحبل الحيوان إلى العاكس.
4. إرفاق الانقسام كم الاتصال المجاني نهاية الطويق المعدنية من الحبل التصحيح الحيوان (الشكل 5). لا قوة كم على طول الطريق حتى الطويق. ترك ~ 0.5 سم من الأكمام كشفت لأن هذا هو ما يتصل الألياف البصرية مزروع الملصقة على الحيوان (الشكل 6).
   خطوة حاسمة: شراء دائما الأكمام التي تحتوي على الانقسام للسماح بتوسيع كم على زرع الألياف الطويق خلال الاتصال والإزالة. ضيقة جدا من نوبة يمكن أن يسبب صدمة شديدة للحيوان إذا كان زرع يزيح من الجمجمة عند محاولة فصل كم من الزرع. إذا كان هذا لا يحدث ذلك، يجب إزالة الحيوان من الدراسة والحصول على رعاية الطبيب البيطري على الفور. وبالمثل، وقبل استخدام كم جديد لأول مرة، "كسر في" عن طريق توصيل وفصل الطويق حتى فإنه قطع مع المبلغ المطلوب من القوة.
   نصيحة: فمن السهل للخروج من الألياف في حين إزالة كم والتي يتم تركيبها بإحكام إلى الطويق. لتجنب هذا، ودفع الطويق خارج عن طريق إدخال قضيب خشبي صغير في نهاية مفتوحة من الغلاف (مقبض مسحة القطن القياسية هو الحجم الصحيح).
5. ربط السائق الليزر الأزرق إلى مولد النبض باستخدام كابل BNC وتحويل مولد النبض جرا.
6. وضع نظارات السلامة المناسبة على. تعيين مفاتيح على الجزء الخلفي من الليزر ل"بالعملة" و "TTL +" واسطة. التأكد من ثاتي يتم تعيين مقبض الباب الطاقة على أمام السائق عند مستوى الصفر andturn الليزر على (تحويل السائق أولا ثم المفتاح ليزر).
7. ضبط مقبض الباب السلطة على الجبهة من الليزر بحيث 5 - يتم المنبعثة 10 ميغاواط من التصحيح الحيوان الألياف الحبل طرف مقاسا باستخدام السلطة متر الضوء. من 5 - 10 ميغاواط هو المبدأ التوجيهي العام - كثافة طاقة الدقيقة اللازمة للتأثير يجب حساب حجم معين من الأنسجة قبل بداية التجربة، كما هو الحال في Aravanis وآخرون ^3.
8. تبديل الليزر الأزرق إلى وضع "النظير" لتحفيز في الجسم الحي. ملاحظة: يتم تشغيلها ليزر DPSS صفراء في TTL + وضع لإضاءة ثابتة. الانتظار 10-15 دقيقة ليزر في عملية الاحماء.
9. بلطف كبح الماوس وتوصيل انقسام الأكمام على التصحيح الحبل الحيوان إلى الألياف زرع المزمن (انظر الشكل 6). تأكد من نهايات كل من الألياف تجعل الاتصال الجسدي مع بعضها البعض. استخدام الانقسام على كم يربط باعتبارهنافذة لتصور اتصال مباشر بين البلدين خطوة حاسمة: في بعض الأحيان يمكن أن الحطام جمع على الطويق المعدنية من الألياف زرع الحيوان وتتداخل مع اتصال المناسب. في هذه الحالة، استخدام الايثانول مسح لتنظيف بلطف الطويق على رأس الحيوان قبل المرفق. أبدا فرض كم الاتصال عبر الطويق لأن هذا يمكن أن يسبب صدمة شديدة للحيوان. إذا لا يمكن إجراء اتصال مادي بين نهايات الألياف بعد التنظيف، وإزالة الحيوان من الدراسة.
   نصيحة: تسرب الضوء يمكن أن تحدث عند نقطة اتصال بين زرع الألياف والحيوان التصحيح الحبل. تصور هذا الضوء عن طريق القوارض قد يشكل نخلط التجريبية ^10. يمكن تركيبها الحرارة يتقلص أنابيب إلى التصحيح بالحبال وانزلق على نقطة ربط لتقليل ضوء دخيلة.
10. السماح الماوس لاستعادة لبضع دقائق قبل بدء الاختبار السلوكي.
    نصيحة: Depending في الاختبار السلوكي على أن تدار، فمن الأفضل أن روض الفئران لعملية الاتصال والربط 2 - 3 أيام قبل، كما معالجة المطلوبة للاتصال الحيوان ربما تتسبب في التوتر والإرباك اختبار السلوكي.
11. ضع الماوس في جهاز الفحص السلوكي ضمان أن سلك موصل خال من عقبات. لا تترك حيوان غير المراقب خلال التحفيز. حتى مع استخدام مفاتيح التحويل، التصحيح بالحبال لا ديهم ميل إلى تطور خلال فترات طويلة من الزمن وربما يتعارض مع الاختبارات السلوكية.
12. استخدام مولد النبض إلى نبض الليزر الأزرق على تردد محدد سلفا من شأنها تفعيل أوبسين في الاختيار. للاستخدام الليزر الأصفر: نبض الليزر الأصفر مع مصاريع الخارجية أو ببساطة عن طريق عرقلة مسار الشعاع مع غير عاكس الكائن غير قابلة للاشتعال مبهمة، و.

4. المشاركة في الجسم الحي اعتبارات تحفيز

ليس القصد من هذا القسم ليكون بروتو الكاملوتقدم العقيد ولكن كما توجيهات للإجراءات الإضافية التي ينبغي النظر التالية في الجسم الحي تحفيز optogenetic.

1. عند الانتهاء من تجربة، تأكيد تشريحيا التنسيب الفيروسي والألياف لتفسير دقيق للنتائج السلوكية. الموت ببطء الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ويروي هذا الحيوان مع المالحة الجليد الباردة الفوسفات مخزنة (PBS) و 4٪ (ث / ت) لامتصاص العرق في برنامج تلفزيوني.
2. إزالة الألياف البصرية المزروع من قبل يمسك بحزم الطويق المعدنية المكشوفة مع كماشة أو المرقأة. سحب ما يصل في واحدة على نحو سلس، بعد سريعة، والحركة. من المهم لاختبار سلامة الألياف زرعها عن طريق قياس الناتج ضوء في نهاية كل تجربة.
3. بعد إصلاح العقول في امتصاص العرق لا يقل عن 24 - 48 ساعة قبل باجتزاء من خلال المنطقة من اهتمام. (إذا كنت تستعمل مشراح التجميد، واحتضان العقول في محلول السكروز 30٪ لعدة أيام قبل باجتزاء). أداء المناعية باستخدام standaبروتوكولات الثالثة للكشف عن fluorophores الموسومة أوبسين المناسبة، أي البروتين الأخضر الفلورسنت (GFP)، وتعزيز الأصفر بروتين الفلورسنت (EYFP) أو mCherry.
4. تحقق من الموقع التعبير أوبسين والألياف زرع تحت المجهر والتأكد بصريا الموضع المناسب من حقن الفيروس والزرع بناء على إحداثيات المختار.

النتائج

النتائج السلوكية التي تم الحصول عليها مع المجراة optogenetic التحفيز تعتمد كليا على الدوائر العصبية استهدافهم، ونموذج حيواني المستخدمة، والمعلمات تعديل. بغرض الشرح الحالية، الخلايا العصبية الدوبامين في منطقة السقيفية البطنية، أو VTA، التيروزين هيدروكسيلاز :: تم transduced الفئران لجنة المساواة العرقية مع مستقرة خطوة وظيفة أوبسين (SSFO) ^8، أو فيروس التحكم (EYFP)، وكان زرع الألياف المزمن مزروع. استخدام TH :: لجنة المساواة العرقية الفئران المعدلة وراثيا يضمن أن أوبسين يقتصر التعبير إلى TH + الخلايا (الدوبامين) في VTA الشكل 7 يصور النتائج السلوكية التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام الحالي وصفه ليزر انشاء لتحفيز وقت واحد من الفئران متعددة. هنا، كانت الفئران المربوطة وحفزت في نفس الوقت باستخدام الليزر منفصلة (3 الفئران / ليزر كما في الشكل 4C) وكانت قد سجلت السلوك الحركي لمدة 1 ساعة. أدى التحفيز المتكرر من الخلايا العصبية الدوبامين في VTA فيالنمط الظاهري مفرط التي استمرت طوال مدة التحفيز. واعتبر أي تغيير في السلوك الحركي في EYFP الفئران (انظر فيديو 1). وبعد اختبار السلوكي، تم تنفيذ المناعية للتحقق من دقة الاستهداف الفيروسي لVTA الخلايا العصبية الدوبامين والألياف التنسيب وأكد بصريا (انظر الشكل 7).

الشكل 1. الخطوات التجريبية لفي الجسم الحي تحفيز optogenetic. هناك أربع خطوات العامة المعنية عند تصميم وأداء في الجسم الحي تحفيز optogenetic. هذا البروتوكول تفاصيل تحديدا الخطوات المتبعة في إيصال الضوء من مصدر ضوء الليزر للهياكل الدماغ العميقة في القوارض التصرف ويشمل 1) التجمع نظام ليزر واقتران الخفيفة؛ 2) استراتيجيات الربط لجonnecting الحيوانات متعددة لمصدر الضوء للاختبار السلوكي عالية الإنتاجية و3) يقدم مبادئ توجيهية لتأكيد استراتيجية الاستهداف للتسليم الضوء - وهي خطوة ضرورية لتفسير البيانات. ملاحظة: على الرغم من أن هذا البروتوكول لا يقتصر على الألياف القابلة للزرع المزمنة لأغراض الربط، فمن المستحسن ويفترض عند الجمع بين التحفيز optogenetic مع اختبار السلوكي. كلا اونغ وArenkiel، 2012 ¹⁸ و سبارتا وآخرون. انظر، 2012 ⁹ للإنتاج في المنزل وزرع الألياف البصرية المزمنة. خطوط الصلبة = الخطوات التي يغطيها هذا البروتوكول.

الشكل 2. نظم الليزر المستخدمة لفي الجسم الحي تحفيز optogenetic. (A) نظام ليزر واحد لتحفيز في الجسم الحي. هذا الليزر هو الرقم الهيدروجيني ysically قبل الديناميكي من قبل الشركة المصنعة ويتطلب القليل المستخدم النهائي انشاء. (B) نظام ليزر ثنائي. تقترن اثنين من أشعة الليزر في واحد من الألياف من خلال استخدام المرايا التي تعمل على توجيه كل مسار الشعاع إلى نمط عدم الاتصال مقرنة. وهذا هو الأكثر تنوعا انشاء مثل المكونات البصرية يمكن حذف أو إضافة حسب الحاجة ولكن يعرض أكثر من تحد من حيث كفاءة اقتران الليزر. (C) تخطيطي لنظام ليزر مزدوج هو مبين في (B) مما يدل وضع الليزر والمرايا مع المقابلة مسار شعاع ضوء الليزر (السهام) يصور. هنا، يتم استخدام مرآة مزدوج اللون "D" لتحويل الأطوال الموجية للضوء الأزرق في حين نقل موجات الصفراء من خلال لمقرنة "C" وإلى تعلق الحبل مقرنة التصحيح. B = الليزر الأزرق. C = عدم الاتصال على غرار مقرنة. D = مرآة مزدوج اللون. FW = مرشح عجلة. M = مرآة. Y = الليزر الأصفر.الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. اختبار (A) الكابلات المستخدمة في بروتوكول اقتران غير المادي القاع: اختبار كابل توصيل مباشرة إلى التصحيح الحبل. إدراج يصور نقطة اتصال من اختبار إلى كابل الحبال (B) التصحيح المشار إليها في جميع أنحاء بروتوكول من الخارجي إلى الداخلي:.. الألياف متعددة الخائن، أسود جاكت الحيوان التصحيح الحبل مع الأبيض زركونيا انقسام كم المرفقة إلى يلتصق شقة (FC) نهاية، التصحيح الحبل سميكة تغلف (يشار إليه أيضا على أنه "الحبل مقرنة"). والمغلفة التصحيح بالحبال سميكة جاكت مع البولي فينيل كلورايد (PVC) أنابيب لحماية إضافية. لهذه الكابلات، وتستخدم صناعة رموز الألوان القياسية للتمييز بين أنواع الألياف المختلفة، حيث البرتقال = الألياف متعددة. التصحيح بالحبال الحيوانية تغلف أرق للسماح المرونة لحركة الحيوانات خلال التجارب السلوكية. لاحظ أن الغبار وتوضع قيود على FC / PC ينتهي عندما الكابلات هي لا تكون قيد الاستعمال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. استراتيجيات الربط لفي الجسم الحي تحفيز optogenetic من (A) لحيوان واحد، (B) اثنين من الحيوانات. . (C) ثلاثة أو أربعة حيوانات تكوينات المحتملة ليست مقصورة على تلك المبينة أعلاه - تكوينات متعددة ممكنة من خلال مزيج فريد من المحولات، الخطان الألياف، والمتفرعة التصحيح بالحبال المتوفرة تجاريا أو ترتيب مخصص. ملاحظة: التصحيح بالحبال والخطان الألياف تحتوي على وصلات FC / PC على طرفي (يصور نهاية واحدة فقط).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. الاتصال الصحيح وغير الصحيح (أحمر خ) من التصحيح الحبل إلى الألياف البصرية زرع باستخدام انقسام الأكمام. وتستخدم (لوحة اليسار) وزركونيا انقسام كم لربط الحبل التصحيح إلى الطويق من الألياف البصرية زرع (كما هو موضح هنا لا الملصقة على حيوان). السهم يشير إلى نقطة اتصال بين الحبل التصحيح والألياف البصرية زرع. قارن إلى (اللوحة اليمنى) حيث توجد فجوة بين الحبل التصحيح والألياف البصرية زرع، كما تصور من خلال انقسام كم يربط. لاحظ تسرب الضوء التي يمكن أن تحدث مع اتصال غير لائق (أسفل اليمين). إدراج السفلي في شpper اللوحة اليسرى يصور المكونات الفردية المستخدمة. من أعلى إلى أسفل إدراج: دوريسي زرع قنية الألياف البصرية، بيضاء زركونيا تقسيم الأكمام، شقة كليف (FC) نهاية التصحيح الحبل الحيوان الأسود جاكت (الحبل التصحيح الكامل هو مبين في الشكل 3B). في جميع لوحات، لاحظ أن كم يربط ليس مطاردة مع نهاية FC من الحبل التصحيح. ترك ~ 0.5 سم من الإفراط في تعليق للاتصال الألياف البصرية زرع الملصقة على الحيوان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6. الجانبية (يسار) وأمامي (يمين) عرض على فأرة الحاسوب مع الألياف البصرية مزروع متصلة التصحيح الحبل استخدم الانقسام على الكم ربط للمساعدة في تصور اتصال السليم للر التصحيح الحبلس الطويق من الألياف البصرية مزروع. يتم تمييز نقطة الاتصال عن طريق مربع متقطع أحمر وصفت أيضا في إدراج العلوي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7. ممثل النتائج. (يسار) قراءات السلوكية للفي الجسم الحي تحفيز optogenetic. مثال السلوك التي يمكن الحصول عليها باستخدام الليزر وصفها انشاء وبروتوكول الربط. تم تسجيل النشاط الحركي خلال التحفيز optogenetic من منطقة السقيفية البطنية (VTA) في هيدروكسيلاز التيروزين (TH) :: الفئران لجنة المساواة العرقية (ن = 7-8 / مجموعة) transduced مع أي خطوة وظيفة أوبسين (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) أو السيطرة فيروس (AAV5-DIO-EYFP) في VTA. تم المربوطة مجموعات من ثلاثة الفئران في وقت واحد إلى واحدالليزر كما هو مبين في الشكل 4C وحفز مع نبض 5 ثانية من 447 أو 473 نانومتر ضوء تسليمها مرة واحدة كل 15 دقيقة. في اتجاهين التدابير المتكررة ANOVA كشفت مجموعة كبيرة التفاعل س الوقت (F = _3،39 15.27، ص <0.0001) والتأثير الرئيسي كبيرا من الوقت (F = _3،39 4.67، ع = 0.007) حيث التحفيز optogenetic زيادة النشاط الحركي فقط في الفئران SSFO (ص bonferroni بعد مخصص <0.0001، نسبة إلى T = 0-15 مرة بن) مما أدى إلى زيادة إجمالية في النشاط الحركي مقارنة مع الفئران EYFP (الأثر الرئيسي للمجموعة: F = _1،39 10.69، ص = 0،0061، ص bonferroni بعد خاص-<0.01 في تي = 15-30 و p <0.001 في ر = 30 - 45 و t = 45 - 60). المواصفات الألياف: 200 ميكرون الأساسية، 0.22 NA. ضوء الإشعاع = 6-66 ميغاواط / مم ^2، الموافق الألياف المسافة غيض من 0،1-0،6 مم من الفيروسي موقع الحقن مع 5 ميغاواط طاقة الضوء المنبعث في الألياف غيض قبل الربط. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. EYFP مقابل SSFO: ** p <0.01. *** P <0.001. تأثير الوقت: #### ص <0.0001 (يمين) تأكيدا النسيجي من وضع الفيروسي والألياف البصرية. تم استخدام صورة مضان مبائر المكتسبة على لايكا TCS SP5 مجهر المسح بالليزر لتصور الألياف التنسيب (الخط المنقط) والتعبير الفيروسي بوساطة (الأخضر) في الماوس منطقة الجوفية السقيفية التالية في الجسم الحي تحفيز optogenetic. وينظر إلى الخلايا العصبية الدوبامين (TH +) باللون الأزرق. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1. في الجسم الحي تحفيز optogenetic: فرط النشاط خلال التحفيز VTA باستخدام SSFO في الفئران TH :: لجنة المساواة العرقية الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

الجدول 1. irradiances الخفيفة المطلوبة لتفعيل opsins شائعة الاستخدام.
أوبسين البديل	λ	كثافة الطاقة (/ ​​مم 2)		عقارات
			تشغيل / إيقاف حركية
الإثارة البصرية: channelrhodopsins سريع المفعول
ChR2 2	470	1 - 5mW المؤشر	1.21 / 12 ميللي ثانية	الحرائق تصل إلى 40 هرتز
ChETA 19	490	5 ميغاواط	0.86 / 8.5 مللي ثانية	حرائق يصل إلى 200 هرتز
الرئيس 20	450	1.65 ميغاواط	1.62 / 12 ميللي ثانية	شكل غير مزيل للتحسس من ChR2
C1V 18	540-630	8 ميغاواط (540nm)	5/34 ميللي ثانية في 540nm	الأحمر تحولت-
		3.2 ميغاواط (630nm)	67 ميللي ثانية (على) في 630nm
الإثارة البصرية: بطيء المفعول rhodopsins قناة
مستقر خطوة ظيفة أوبسين (SFO) 8	470/590	8 μW (470nm)	20 ميللي ثانية / 29 دقيقة	البديل SFO جديد؛ الدولة تعد مفتوحة. افتتح 470 نانومتر، التي أغلقتها 590 نانومتر
تثبيط البصري
eNpHR3.0 21	560-630	5 - 3 ميغاواط	2.5 ميللي ثانية / <10 ميللي ثانية	تثبيط مستمرة لمدة 30 دقيقة مع 22 ضوء مستمر *
ArchT3.0 11، 23	520-560	1-5 ميغاواط	2 / <10 ميللي ثانية	أكثر حساسية مع photocurrents أكبر من eNpHR3.0
يتم توفير هذا الجدول كدليل فقط؛ irradiances ضوء المحددة اللازمة لتعديل العصبي وينبغي تأكيد مستقل.
التحقق التجريبي مهم للتحقق من أن أوبسين، وتستهدف الاستراتيجية، والمعلمات التحفيز الخفيفة تعدل اطلاق العصبي بالطريقة المقصودة 5.
كثافة الطاقة (ميغاواط / مم 2) يشير إلى قوة ضوء مضيئة على منطقة معينة من أنسجة المخ، ولا تشير إلى قوة الضوء المنبعث من غيض من الألياف.
* دائما استخدام كثافة أدنى ضوء ممكن، وخصوصا مع التحفيز ضوء لفترة طويلة.

سرعة = "0">

الجدول 1. irradiances الخفيفة المطلوبة لتفعيل opsins شائعة الاستخدام.
الاختصارات
AAV = فيروس الغدة المرتبطة
DPSS = الحالة الصلبة ضخ الصمام الثنائي
EYFP = المعززة بروتين الفلورسنت الأصفر
FC / PC = يلتصق شقة / اتصال جسدي
GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر
PBS = الفوسفات مخزنة المالحة
PVC = البولي فينيل كلورايد
ميغاواط = ميلي واط
NA = الفتحة العددية
SSFO = مستقر خطوة وظيفة أوبسين
TH = التيروزين هيدروكسيلاز
TTL = الترانزستور الترانزستور المنطق
V = الجهد
VTA = منطقة الجوفية السقيفية

Discussion

الليزر وصفت مجموعة عمليات الحالية واستراتيجيات الربط متوافقة مع مجموعة واسعة من الاختبارات السلوكية القوارض. في الواقع، لقد تم استخدام مجموعة متنوعة من الاختبارات السلوكية التالية، أو المصاحبة، في الجسم الحي تحفيز optogenetic التي تشمل المهام الانفعالية السلوكية، تكييف السلوك والتعلم ونماذج الذاكرة، والنوم، والإثارة، والمهام مشهي على سبيل المثال لا الحصر (انظر نيه وآخرون. ⁶ لإجراء استعراض شامل). لقد تغير علم البصريات الوراثي ويمكن الآن الطريقة التي يتم بها إجراء الاختبارات السلوكية التقليدية في ذلك دراسات متعددة لمدة يوم وتكون مختصرة في جلسة واحدة حيث يتم مقارنة السلوك، داخل المواضيع، خلال حقب متميزة من الضوء 'على' مقابل 'قبالة ^"5. وتجدر الإشارة، أجهزة السلوكية التي تحتوي على المداخل، أغلقت مقصورات أو أي عوائق أخرى قد يكون من الضروري تعديلها لاستيعاب مرور الألياف المربوطة.

ووصف استراتيجيات الربط تصريح سيالتحفيز multaneous من الفئران متعددة من ليزر واحد. وبالتالي لا يمكن أن يتحقق عالية الإنتاجية الاختبار السلوكي optogenetic من خلال استخدام أشعة الليزر متعددة ومعدات الاختبار. عدد الحيوانات التي يمكن حفز في وقت واحد، ومع ذلك، سوف تكون محدودة بسبب أقصى قدر من السلطة الخفيفة التي يمكن تحقيقها في كل غيض من الألياف. انتاج الطاقة القصوى في غيض من الألياف يعتمد على 1) السلطة بدءا من الليزر. 2) كفاءة اقتران و3) عدد من الانشقاقات شعاع. ليزر أزرق 100 ميغاواط مع ~ 80٪ كفاءة اقتران وتصل إلى 4 انشقاقات شعاع (كما هو مبين في الشكل 4C)، متوسط ​​القوة في غيض من الألياف يمكن أن تتراوح بين 5-10 ميغاواط عند استخدام 200 ميكرون الأساسية، 0.22 NA حبال من الألياف التصحيح (ملحوظة تتوقع خسارة الإرسال من مفاصل دوارة لتكون <15٪). قياس ناتج الضوء على غيض من الألياف أمر ضروري لتحديد قوة الضوء الكافية لتفعيل أوبسين كما تختلف opsins في حساسيتها للضوء، وبالتالي فإن كثافة الطاقة الضوئية (ميغاواط/ مم ²⁾ المطلوبة لتفعيل ^11. على سبيل المثال، ومستقرة خطوة وظيفة أوبسين (SSFO) بمثابة تراكم الفوتون، وبالتالي يتطلب القليل جدا من كثافة الطاقة الخفيفة لتفعيل (<8 μW / مم ^{2) 8.} قارن هذا إلى رودوبسين قناة التقليدية (ChR2) الذي يتطلب حدا أدنى من 1 ميغاواط / مم ² للضوء لانتزاع امكانات العمل ^2. ويرد الجدول 1 كمرجع سريع لirradiances ضوء الحد الأدنى المعروف المطلوبة لتفعيل opsins الأكثر شيوعا حاليا في استخدام. وأخيرا، يجب على المرء أن نعتبر أن يفرق الضوء ويمتص لأنها تنتقل من خلال أنسجة المخ مثل ما هو مطلوب مزيد من السلطة الخفيفة لهياكل الدماغ أكثر عمقا ^3. مورد مفيد على الانترنت هو متاح في http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php التي سوف حساب شدة الضوء في أعماق مختلفة من خلال أنسجة المخ مع الأخذ فيحساب حجم الألياف الأساسية، والفتحة العددية، والطول الموجي للضوء المستخدمة، وانطلاق القوة ضوء في غيض من الألياف. لمحة عامة ممتازة من المبادئ النظرية الكامنة وراء هذه الحسابات، انظر Foutz وآخرون. (2012) ^12. وأظهر الأمثلة على كيفية تطبيق هذه المبادئ والعمليات الحسابية لتصميم تجريبي في Aravanis وآخرون (2007) ⁽³⁾ وTYE وآخرون (2012) ^13. أداء هذه الحسابات قبل بداية التجربة أمر بالغ الأهمية لضمان الإشعاع الضوء الكافي لتفعيل أوبسين. ونظرا لهذه الاعتبارات، فإنه من المفيد لشراء أجهزة الليزر التي تعمل بالطاقة أعلى لضمان انتاج الطاقة الكافية. ليزر مع انتاج الطاقة بين 100-200 ميغاواط تكفي عادة للتعويض عن الألياف الأساسية الصغيرة، والألياف متعددة تقسيم، واقتران عدم الكفاءة ويفقد نقل ^7. إذا باستخدام الليزر عالية الطاقة، ولكن يجب توخي الحذر لتجنب الضرر العصبي أو الحرارة وخفيفة الزميلةالتحف د التي يمكن أن تحدث مع طويلة و / أو عالية تعمل بالطاقة ضوء إضاءة ^(7). وهناك مجموعة وآمن للتجارب في الجسم الحي هو ما يصل الى 75 ميغاواط / مم ^{2. 14}

يمكن البت في نوع من الليزر لشراء تكون مسألة معقدة كما أن هناك العديد من العوامل في الاعتبار. على سبيل المثال، وأشعة الليزر الصمام الثنائي المباشرة توفر الانتاج نابض أكثر استقرارا وقابلة للتكرار من القيام الحالة الصلبة (DPSS) الليزر الصمام الثنائي ضخ، وأكثر موثوقية مع مرور الوقت في بيئة معملية. في بعض الحالات، ومع ذلك، وأشعة الليزر الصمام الثنائي المباشرة قد تنبعث قوة ضوء انخفاض، ~ 0.1 ميغاواط، حتى عندما يكون الجهد الأمر 0 V بسبب التحيز الحالي مستمر إرسالها إلى الصمام الثنائي التي كتبها الالكترونيات السيطرة الليزر. هذه الانبعاثات "عفوية" لديه طيف أوسع من يفعل انبعاث الليزر من نفس الليزر، لذلك يمكن تخفيض على وجه التحديد عن طريق تثبيت ضيق الفرقة تمرير (أو "تنظيف") فلتر بين الليزر ومقرنة (انظر قائمة أجزاء). سيكون هذا المرشح أيضاتقليل انتاج الطاقة التي كتبها ~ 50٪ عند إحلال ل، وحتى شراء ليزر أعلى بالطاقة وفقا لذلك. وتجدر الإشارة إلى أن أشعة الليزر DPSS الصفراء حساسة للغاية ويمكن أن تتصرف بطريقة متقطعة، وقد خفضت عمر إذا التضمين بسرعة عن طريق مولد النبض. وينبغي أن يتم تعديل الصفراء قوة الليزر من خلال الخارجية عجلات مرشح الكثافة وضعها في مسار الشعاع (القسم 1.7)، في حين تعمل الليزر في TTL + واسطة. بدلا من ذلك، شراء الأخضر 532 نانومتر DPSS الليزر هو بديل فعالة من حيث التكلفة التي يمكن أن بتنشيط كل halorhodopsins وarchaerhodopsins.

الفتحة العددية (NA) من الألياف مهمة في الاعتبار عند تصميم وشراء مكونات الألياف لتجميع الليزر انشاء. وNA من الألياف البصرية يحدد زوايا أشعة الضوء التي يمكن أن تكون مقبولة والمنبعثة في غيض من الألياف. إذا تزاوج الألياف أعلى-NA إلى الألياف أقل-NA، سوف تحدث خسائر كبيرة في تلك الواجهة، ولذلك فمن المهم أن تكون واي ثابت ال الألياف NA ضمن الإعداد واحد (أو لضمان أن NA يزيد على طول مسار الضوء). تأثير الألياف NA على حجم أنسجة المخ مضيئة أقل أهمية، لأن أنسجة المخ هي نثر للغاية، ومنذ ضوء جانب من مصدر الليزر سوف تميل إلى 'underfill "الفائقة NA الألياف. وتستخدم الألياف البصرية ولكن مع NA من 0.22 و0.37 شائع. وبالمثل، اقتران من النواة أكبر إلى الألياف النواة أصغر سوف يؤدي أيضا إلى خسائر كبيرة، لذلك دائما تأكد من استخدام زيادة أو تساوي أقطار الأساسية عندما تتقدم من مصدر الليزر لزرع حيوان. على مذكرة عامة، ينبغي دائما أن توج نهايات الألياف عندما لا تكون قيد الاستعمال لمنع الغبار والجسيمات تراكم. انها فكرة جيدة لبانتظام نهايات الألياف نظيفة والموصلات (70٪ ايزوبروبيل يعمل بشكل جيد) لضمان أقصى انتاج الطاقة ضوء، واختبار انتاج الطاقة الضوء من خلال "زرع وهمية" قبل البدء في تجارب كل يوم.

"> وخلال الاختبارات السلوكية، لا بد من اتخاذ خطوات للسيطرة على آثار عدوى فيروسية، خارجي التعبير البروتين، الضوء المرئي، والآثار المحتملة التدفئة النسيج والتحف على سلوك الحيوان. لذلك، يجب أن تتكون المجموعة الضابطة السليمة للحيوانات transduced مع فيروس السيطرة (على سبيل المثال، GFP، EYFP، mCherry) التي تتلقى متطابقة المعلمات التحفيز الضوء. التحقق التجريبي هو الخطوة النهائية الحاسمة كما يتضح من البيانات السلوكية المستخدمة في التحليل تعتمد كليا على أوبسين السليم ووضع الألياف البصرية في المنطقة ذات الاهتمام وعلى وجه التحديد، في الحيوانات حيث يتم الكشف عن أي إشارة المناعى، أو حيث وضع إشارة أو الألياف ليس في المنطقة من الفائدة، ويجب إزالة البيانات ثم السلوكية لتلك الحيوانات من التجربة. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الضروري لاختبار ناتج الضوء على غيض من الألياف سواء قبل الزرع الجراحي، ومرة ​​أخرى بعد الوفاة لضمان قوة الضوء الكافية لتفعيل أوبسين. وفي أنيماليرة سورية حيث حدث خسارة ضوء شديدة من خلال الألياف بعد التجريب (> 30٪) ^9، ينبغي النظر في البيانات لهذا الحيوان من أجل إزالة. وينبغي وضع معايير لإزالة بداهة. وأخيرا، لا بد من النظر في وتيرة النبض المطلوبة لتعديل اطلاق العصبية، والتي سوف تعتمد على بنية الدماغ والخلايا العصبية أنواع فرعية استهدافهم. توجد نشرت المعلمات optogenetic التحفيز الخفيفة لعدة أنواع فرعية العصبية، ومع ذلك، فإن القدرة على تعديل اطلاق العصبية ينبغي تأكيد مستقل في الجسم الحي أو من خلال شريحة الدماغ التسجيلات الكهربية.

كما يصبح واحدا بارعون في استخدام الليزر وتعديل ليزر مجموعة عمليات، مزيج من أطوال موجية مختلفة يمكن المربوطة لألياف متعددة على حيوان واحد أو تسليمها أسفل نفس الألياف لعلم البصريات الوراثي اندماجي ^8. سوف التحفيز متعدد الطول الموجي أصبحت ذات أهمية متزايدة نظرا للتطور السريع للأحمر التحولإد channelrhodopsins ^8، هندسة opsins hyperpolarizing الأزرق تحول ^15، واستخدام ثنائي وضع الاستقرار opsins خطوة وظيفة ^8،16،17، وقائمة توسيع العامة للopsins مع تفعيل متميزة الأطياف ^11. وهذا التوسع في الأدوات optogenetic تسمح لسيطرة غير مسبوقة من عدة أنواع فرعية العصبية داخل وعبر مناطق الدماغ على حد سواء لتحديد دورهم في حكم الدول السلوكية المعقدة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Laser Set-up
100 mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability (quantity: 1)	Omicron	Luxx/Phoxx 473/488-100	Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display
100 mW 594nm DPSS laser (quantity: 1)	Colbolt	0594-04-01-0100-300	04-01 series yellow laser; sensitive to back reflection from fibers
200 mW 532 nm DPSS laser; 5% power stability (quantity: 1)	Shanghai Lasers	GL532T3-200	Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins
Non-contact style laser to multimode fiber coupler (quantity: 1)	OZ Optics	HPUC-23-400/700-M-20AC-11	For use with dual laser set-up; Specs: 33 mm OD for 400 - 700 nm; FC receptacle, f = 20 mm lens with post mount laser head adapter #11
Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 1)	Thorlabs	MB1213	For dual laser system
Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded (quantity: 1)	Thorlabs	MB1012	For single laser system
Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 2)	Thorlabs	MB4	For blue laser; dual laser system
Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped (quantity: 4)	Thorlabs	CL3
3/4" stainless post (quantity: 1)	Thorlabs	TR075
1" stainless post (quantity: 4)	Thorlabs	TR1
Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew (quantity: 2)	Thorlabs	PH1
Pedestal Base Adapter (quantity: 3)	Thorlabs	BE1
Small Clamping Fork (quantity: 3)	Thorlabs	CF1253
Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror (quantity: 3)	Thorlabs	KM100-E02
Neutral filter density wheel (quantity: 1)	Thorlabs	NDC-50C-2M
1" Longpass dichroic mirror 50% (quantity: 1)	Thorlabs	DMLP505
Kinematic mount for 1" optics (quantity: 1)	Thorlabs	KM100	For dichroic mirror
20-piece hex wrench kit with stand (quantity: 1)	Thorlabs	TC2
1/4"-20 cap screw and hardware kit (quantity: 1)	Thorlabs	HW-KIT2
Mounting base 1" x 2.3" x 3/8" (quantity: 1)	Thorlabs	BA1S
FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve (quantity: 2)	Thorlabs	ADAFCB1	Dual FC/PC L-bracket also available
Breadboard lifting handles (quantity: 3)	Thorlabs	BBH1
Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm (quantity: 1)	Thorlabs	FB450-10	For use with diode lasers that spontaneously emit
2. Laser Coupling
! Laser protective eyewear (quantity: 1 for every user at each wavelength)	Various		! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser
Fiber optic cable tester (quantity: 1)	Eclipse	902-186N
One-step fiber connector cleaner (quantity: 1)	Thorlabs	FBC1
Coupler patch cord (0.75 meter) (quantity: 1)	Thorlabs		0.75 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; for dual laser system
Coupler patch cord (0.5 meter) (quantity: 1)	Thorlabs		0.5 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors, multimode; for single laser system
Doric mini cube (quantity: 2)	DORIC	DMC_1x2_FC-2FC
Compact power and energy meter console (quantity: 1)	Thorlabs	PM100D	Digital 4" LCD
C-series slim power sensor 5 - 500 mW (quantity: 1)	Thorlabs	S130C	Multiple detectors types are available; check with vendor
3. In vivo Optogenetic Stimulation
Multimode fiber splitters (quantity: 2)	FONT Canada		Large core fiber optic 1 x 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized. Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available
Arbitrary waveform function generator (2 channel) (quantity: 1)	Rigol	DG1022	Can control up to 2 lasers at once
Fiber optic rotary joint (commutator) (quantity: 6 - 8)	DORIC*	FRJ_1X1_FC-FC	*Also available through Thorlabs and Prizmatix
Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) (quantity: 8)	DORIC	MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5	Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.
PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) (quantity: 1)	Precision fiber Products	SM-CS1140S1	Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end
Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) (quantity: 1)	Thorlabs	CAPF
Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves (quantity: 1)	Thorlabs	CAPF1
Thick-jacketed patch cords (custom order) (quantity: 4)	Thorlabs		200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering