Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

Özet

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Özet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

Giriş

Optogenetik normal ve hastalık-ilgili davranışsal durumları sürüş nöral devre elemanları için arama sistemleri düzeyinde nörobilim devrim yarattı. ışığa duyarlı mikrobik opsins ¹ işlevsel memeli hücrelerinde ifade edilebilir keşif yüksek uzaysal ve zamansal hassas ² ile nöral aktivitenin görülmemiş denetimini ele geçirmesine ışık kullanarak platformu sağladı. Nöral aktivitenin manipülasyon geleneksel elektrofizyolojik veya farmakolojik yaklaşımlar aksine, Optogenetik heterojen nüfus içinde ve fizyolojik ilgili zaman ölçekleri de (tanımlamak genetik ya da mekansal projeksiyona dayalı) özel hücre tiplerinin kontrolü sağlar. bir sinir-optik arayüz daha sonra giriş hayvanlar ³ davranmak ışık iletimi için pratik bir araç sağladı. Bu nedensel test etmek için uyanık davranıyor kemirgenlerde tanımlanan nöral devrelerin gerçek zamanlı modülasyonu için sağladıNörolojik ve psikiyatrik hastalık ^4-6 ile ilgili davranışsal devletlerin yönetiminde bu nöral devrelerin rolü. Optogenetik, bu nedenle, beyin aktivitesinin ve hayvan modellerinde davranışsal veya fizyolojik tedbirler arasında işlevsel ilişkiyi araştıran ilgilenen herhangi bir laboratuvar haline getirilmesi için güçlü bir araç temsil eder.

Bir Optogenetic deney başarılı tasarım ve tamamlanması çeşitli adımlar ve düşünceler (Şekil 1) içerir. Mevcut protokol amacı uyanık davranıyor kemirgenlerde Optogenetic uyarılması gerçekleştirmek için gerekli teorik ve pratik bilgi ile birlikte, araç ve bileşenleri ile bireylere sağlamaktır. Şu anda, mikrobiyal opsin kanalları etkinleştirmek için kullanılan iki baskın dalga boyu aralıkları vardır: mavi spektrumları (genellikle 473 nm) ve yeşil-sarı spektrumları (genellikle 532 veya 591 nm). Lazerler ve ışık yayan diyot (LED'ler) her iki d, ışık kaynağı olarak kullanılabilirbeyin dokusuna özgül ışık dalgaboylan eliver. in vivo olarak, kemirgen uyarılması için gerekli olan küçük bir çekirdek lifler halinde birleştiği zaman özellikle LED tarafından yayılan insicamlı olmayan ışık, ancak, hafif zor etkin iletim yapar. Uygun lazer düzeneği üzerinde karar vermek önemli bir ilk adımdır ve laboratuarda Optogenetik amaçlanan kullanımına bağlı olacaktır. Tek ön-birleştiğinde lazerler ve çift lazer sistemleri (Şekil 2): Geçerli protokol iki montaj ve kullanım kolaylığı açısından farklılık temel yapılandırmaları açıklanmaktadır. Üretici tarafından önceden birleştirilmiş Tekli lazer sistemleri esasen hazır gitmek gerekli hiçbir set-up ile küçük girişte ama az son kullanıcı özelleştirme dezavantajı var. Bir çift lazer sistemi aynı fiber aşağı iki farklı dalga boylarında teslim sağlar. Farklı dalga boyları etkinleştirmek için kullanılabilir sayede bu ayrımlar inhibe / kombinasyonal Optogenetik gelişine giderek daha önemli hale gelecektiruzaysal olarak ko-lokalize T hücre türleri. Bu, aynı zamanda photocurrents başlatılmış ve sırasıyla ^7,8, mavi ve sarı ışık ile sonlandırılır bistabil basamak fonksiyonu opsins ile kullanım için gereklidir. Kullanıcı ekleyebilir veya gerektiği gibi ışın yolu bileşenleri (örneğin, dış panjurlar, ışın filtreleri, satır içi güç metre) kaldırabilirsiniz gibi çift lazer sistemleri de özelleştirilebilir. Nedeniyle çok yönlülük, dual lazer set-up Optogenetik laboratuarda kullanılan bir araçtır devam olacak eğer tavsiye edilir. Lazerlerin Kavrama, ancak, bir meydan okuma sunmak ve böylece, hızlı, kolay, ve güvenilir birleştirme mekanizması bu protokolde sağlanmaktadır. Bu protokol optik bileşenlerin montajını ayrıntıları ve 200 mikron çekirdek ve 0.22 sayısal diyafram (NA) ile adım-indeks modlu fiberler için optimize edilmiştir yama kablolarını ve bileşenleri kullanır, unutmayın. Farklı çekirdek boyutları ve NA, ancak tüm bileşenlerin ideal çekirdek açısından uyumlu olmalıdır, satın alınabilirboyut ve NA fiber bağlantı noktalarında ışık kaybını önlemek için. Seçenek olarak ise, bir elyaf bağlantısına, hafif daha büyük bir çekirdek büyüklüğüne göre daha küçük bir geçebilir; ve / ya da bir düşük-NA ek bir kayıp olmaksızın daha yüksek NA fiber.

Bağ stratejilerin, yüksek verimli davranış testleri için birden fazla fare eşzamanlı olarak uyarılması için izin veren sağlanır. Resim protokoller davranış testi Kronik implante liflerin kullanıldığı varsayılmıştır, ancak akut stimülasyon protokolleri için modifiye edilebilir. Aynı kanül ilaçlar ve aynı yerde bir fiber optiğin ucu iletmek için kullanılabilir çünkü Akut implante lifler, farmakolojik manipülasyonu ile Optogenetic uyarımı birleştirilmesi için avantajlıdır. Bu liflerin, tekrarlanan takma ve çıkarma işlemi ile ilişkili doku hasarı azaltır ve elyaf sürekli yerleştirilmesi için açısından doğruluğunu artırır gibi kronik implante liflerin kullanımı, bununla birlikte, yüksek oranda çoklu günlük davranış testi için önerilirDoku aydınlatma ^3. Burada anlatılan bağlama yapılandırmaları ile kombine edildiğinde, davranış güvenilir birden fazla gün boyunca kaydedilebilir. Fiber implantasyon sonrası Nitekim, güvenilir ışık iletimi bildirilmiştir ay ⁹ kronik stimülasyon ve davranışsal test paradigmalar, teorik, birden fazla gün ve haftalar boyunca yapılabilir ki böyle. Donanım bileşenleri Ek notlar içi yapılabilir maliyetli alternatifler ve ürünler de dahil olmak üzere, kendi bireysel ihtiyaçlarına uygun olacak en iyi ürünün okuyucu seçimi izin protokol eklenmiştir. Kurulum ve uygulama sırasında yararlıdır Önemli ipuçları da verilmektedir.

Protokol

! DİKKAT: Bu protokol sınıf 3b lazer kullanımını gerektirir ve takip edilmesi uygun eğitim ve güvenlik kurallarına gerektirir. Lazerler çalıştırırken Güvenlik gözlükleri hizalama işlemleri özellikle yüksek risk gösteren ile, her zaman giyilmelidir. Belirli bir lazer için maksimum zayıflama sağlayacak gözlük belirlemek için lazer sağlayıcınıza başvurun. Varsa, bir kurumsal lazer güvenlik eğitim kursuna kayıt. Uygun güvenlik gözlük ve eğitim olmadan bir lazer kesinlikle çalıştırmayın.

1. Lazer Aparatı Set-up

Uygun olduğu yerde, Bölüm 1 'de adımlar sırasıyla tek veya çift lazer sistemleri arasında ayırt etmek için, (A) ya da (B) olarak belirlenmiştir.

1. Takın ve breadboard lazerler sabitleyin. Breadboards mükemmel ısı iletkenler ve uzun süreli kullanım ile iç lazer bileşenlerinin zarar görmesini önlemek için bir soğutucu olarak hareket ederler.
2. (A) ön-birleştiğinde las Güvenlier ¼ 20 "kapak vidaları ve pulları (Şekil 2A) kullanılarak 10" x 12 "breadboard (ya da gerektiği gibi) için. Breadboard delikleri lazer montaj delikleri ile aynı hizaya yoksa, breadboard için lazer sabitlemek için küçük 'masa kelepçeler kullanabilirsiniz.
3. 2 lazerler kullanılır Varsa (B), çok farklı ışın yükseklikleri (> ~ 1 cm) sahip lazerler biri için bir platform oluşturmak için küçük 4 "x 6" Breadboards kullanın. Şekil 2B'de gösterildiği gibi ana büyük 12 "x 18" bu panoları takın breadboard pullar ile ¼-20 "kapak vidasını kullanarak, daha sonra kapak vidaları veya masa kelepçeler kullanarak küçük kurullarına lazer takın. Kapak vidaları veya bir değişken yükseklik tablo kelepçe kullanarak breadboard doğrudan diğer lazer takın.
   Kritik Adım: Breadboards, vidalar ve optik bileşenleri ürün satın alırken bu kadar tutarlı olması emperyal veya metrik olarak satın alınabilir; Bu protokol için varsayılan emperyal olduğunu.
4. (A)Coupler'e kalın-ceketli düz cleave / fiziksel temas (FC / PC) yama kablosu takın (bir bağlantı kablosu olarak anılacaktır; Şekil 3) fiziksel lazer (Şekil 2A) önüne takılı olduğundan emin.
5. (B) daha sonra kullanım sırasında gevşemesine ve hiza önlemek için, coupler ve JB Kwik veya benzeri epoksi kullanarak yazının üstüne arasındaki ortak epoksi, ¾ "optik yazı üzerine birleştirici Konu. (Breadboard delikleri her zaman optik bileşenleri, post tutucu, ayaklı taban adaptörü gerekli yerleştirme ile hizaya olmaz, ve çatal sıkma yerine birleştiriciden optik sonrası sabitlemek için kullanılan gibi) breadboard için yazı takın. Kuplöre arkasına kalın ceketli yama kablosu (bağlantı kablosu) takın.
6. (B) Kinematik tutucu içine mavi lazer için ilk direksiyon ayna yerleştirin ve ¾ "optik yazı ile breadboard ekleyin. Bir baz ADAp Bu yazı takınter ve sıkıştırma çatal. Sıkıştırma çatal yerleştirin ve dikroik ayna doğru lazer yönlendirmek için 45 ° açılı ayna mavi lazer önünde doğrudan derleme sonrası. Bir kaba hizalama kılavuz olarak breadboard deliklerin ızgara deseni kullanın. Bir kez kabaca konumlandırılmış, (C Şekil 2B bakınız) breadboard için sıkıştırma çatalı sabitlemek için ¼ "-20 kap vida kullanın.
7. (B) Kinematik tutucu içine dikroik ayna yerleştirin ve 1 "Optik mesaja ekleyin ve breadboard doğrudan sabitleyin. Uzak bir sola dikroik ayna yerleştirin ve mavi lazer ayna, doğrultusunda. Mavi ışık ilk ayna yansıyan böyle bir 45 ° açıyla dikroik ayna coupler yansıdığı Açı, daha sonra (C Şekil 2B bakınız) yazılan kinematik tutucu takılarak vidayı sıkın.
8. (B) ¾ "optik yazılan sarı lazer için ilk direksiyon ayna takın. OPTI takınBir baz adaptörü ve sıkma çatal cal sonrası. Sarı ışık ikinci direksiyon ayna yönelik olacak şekilde 45 ° açıyla sıkma çatal ve sarı lazer ve açı ayna önünde doğrudan sonrası topluluk yerleştirin. "Bir ¼ ile -20 kapak vida ve pul yerine sıkma çatal sabitleyin.
9. (B) 1 "Optik yazılan sarı lazer ikinci direksiyon ayna takın. Açı ilk aynadan sarı ışık huzmesi dikroik yoluyla ve kuplörün (Şekil 2C) içine yansıyacaktır ki ayna gibi. Breadboard doğrudan yazı Güvenli ve ayna uygun açılı bir kez montaj vidasını sıkın. İnce ayna ayarlamaları bir sonraki adımda kinematik ayna bağlar kullanılarak yapılacaktır.
10. (B) ¾ "optik mesaja bir nötral yoğunluk filtresi tekerleği takın ve bir montaj tabanına bağlı bir post tutucu içine yazı yerleştirin. İlk ve se arasındaki breadboard için topluluk GüvenliTek ¼ "-20 kap vida kullanarak koşul sarı aynalar. Bu tekerlek bağlayıcı ulaşan sarı lazer ışığının gücünü ayarlamak için kullanılır.
    İpucu: Bireysel tabanına onları takmadan önce (örneğin mesajların üstüne kinematik ayna sahipleri tutan vidaların ve mesajların altına baz adaptörleri tutan parçacıkları gibi) tüm bileşenleri sıkın. Yeterli tork için optik mesaj temin geçen delikler içinden küçük bir altıgen anahtar bir şaft kullanın. Bu bileşenler yeniden düzenlenmesi gerektiren, kullanım sırasında gevşek geliyor önleyecektir.
11. Breadboard FC / PC L-dirsek adaptörü bir FC / PC takın.
12. İsteğe bağlı: İki veya daha fazla hayvanların eş zamanlı in vivo uyarılması için breadboard doğrudan 1 x 2 50/50 Mini küp elyaf ayırıcı sabitleyin. Buna ek olarak, kolları (Şekil 2A'da görüldüğü gibi) maket tertibatının hareket yardımcı olmak için ilave edilebilir.

2. Lazer Kaplin (Temassız Stil Kaplin)

Bu bölüm, çift lazer kurulumu (Şekil 2B) ile ilgilidir. Dış sarı lazer hizalama yolu önce iç mavi lazer yolunu hizalayın.

! DİKKAT: Göz güvenliğini sağlamak için düşük ışık güç kavramayı (~ 1 mW) kullanın. Lazer ve ışık yoğunluğu ölçülür ve güvenli olarak kabul edilene kadar iktidara koruyucu gözlük takın.

1. Lazerin arkasındaki anahtarları ayarlamak için "Curr" (güncel) ve transistör-transistör mantığı modu (TTL) + sabit aydınlatma için (Analog modunda aksine). Sürücünün önündeki güç düğmesi sıfır ayarlanmış olduğundan emin olun. İlk ve ardından sürücü lazer anahtarını çevirerek lazer açın.
2. Yavaş yavaş ~ 1 mW lazer ışığı yaydığı ediliyor ve böylece lazer sürücünün önünde bulunan güç düğmesini ayarlayın. 15 dakika (ya da üretici tarafından belirtilen şekilde) lazer için ısınmak için - 10 bekleyin.
3. Fre doğrudan fiber optik kablo test cihazı bağlayıne bağlantı yama kablosunun ucunu ve kablo test cihazı (Şekil 3A) açın. Kırmızı ışın düz geri dikroik aynanın merkezine doğru hareket böylece kuplöre açısını ayarlayın. kablo test yayılan kırmızı ışık ışın yolu gelen lazer ışığı lazer içine birleştirilebilir için takip gerekir kesin yoldur.
4. Bir kaba hizalama gerçekleştirin: coupler içine lazer ışığı demetini yönlendirmek için kinematik aynalarda yanal ve yatay düğmeleri kullanın. ayaklı kelepçeler biraz aynalar ve bağlayıcı yeniden konumlandırmak için gevşetti gerekebilir. kinematik bağlar daha da ince ayarlamalar için bazı seyahat olmalıdır. Hiçbir mavi ışık şu anda bağlantı bağlı yama kablosu üzerinden yayılan ediliyor ise endişe etmeyin.
5. Dikroik ve coupler arasında doğrudan dikroik aynanın önünde yarı-saydam bir kağıt tek parça yerleştirin. Orada olacak mavi ve ar hemsırasıyla lazer ve kablo test cihazı, bu kağıt üzerinde ed nokta. Yeterince kağıdın aynı tarafına aynı anda kırmızı ve mavi lekeler de görmek saydam kağıt kullanın.
6. İlk direksiyon ayna ince ayarlamalar yapın (yani, lazer, değil dikroik yakın olanı) dikkatle mavi nokta ile kırmızı nokta merkezini hizalamak için yanal ve yatay topuzlar ayarlayarak.
7. Birleştirici önünde doğrudan böylece kuplöre doğru geri kağıt taşı ve kırmızı ışın lazer ışını hizalamak için saniye (yani, dichroic) ayna düğmeleri ayarlamak.
8. (Kırmızı ve mavi ışınlar colinear kadar, yani) / mavi, sarı ve kırmızı kirişler merkezi tam her iki pozisyonda hizaya kadar 2.6 ve 2.7 adımları üzerinde yineleme.
9. Bağlantı kablosu Kablo test cihazı çıkarın. Lazer ışığı artık bağlantı yama kablosu ucundan yayılan edilmelidir.
10. DetermiBir güç ölçer kullanarak bağlantı yama kablosu fiber ucundan yayılan ışık gücü ölçerek ne bağlanma verimliliği. Güç ölçerin fotodiyot 500 mW ayarını kullanın ve kullanılan mavi (473 nm) veya lazer bağlı sarı (635 nm) spektrum ışık dalga boyu ayarını (λ) değiştirebilirsiniz.
11. Bir güç okuma elde etmek için fotodiyot dik lif ucu yerleştirin. Fiber ucundan yayılan ışık güç birleştirici giren ışık gücü karşılaştırın. >% 80 bir bağlanma verimliliği çok iyi olarak kabul edilir. İkinci direksiyon ayna Çok küçük daha ayarlamalar bazen biraz bağlantıyı artırabilir. Genel olarak, birleştirme lif ucundan ışın desen lif çekirdek içine verimliliği bağlanması (çevreleyen hiçbir halkaları ile), küçük, dar, merkezi nokta, olduğu zaman en uygunudur.
12. Tekrarlayın 2.1 adımları - Sarı lazer için iki direksiyon aynalar dışında, sarı lazer bağlantısı için 2.11 (Şekil 2C bakınız). Yapılacak hiçbirt dikroik ayna veya mavi lazer hizalama pozisyonu kaybolur ayarlayın.

3. in vivo optogenetic Uyarım

Hayvan kullanımını içeren herhangi prosedürler ilgili Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından yerel ve ulusal kurallara göre yapılan ve onaylanan emin olun.

1. Optik elyaf kurulumu (yama Farklı kablo tiplerindeki tanımlanması için Şekil 3B bakınız aşağıdaki adlandırılır). Tek bir fare teşvik doğrudan breadboard bağlı YP / YP L-dirsek adaptörü kullanarak kalın ceketli yama kablosu bağlantı yama kablosunu bağlamak için (Şekil 4A). , Bir lazer iki hayvan teşvik 1 x 2 50/50 Mini küp kullanarak iki kalın ceketli yama kablolara bağlantı yama kablosunu bağlamak için (Şekil 4B bakınız). 1 x 2 m kullanarak modlu fiber splitter bağlantı kablosunu takmak, üç veya daha fazla hayvan teşvik etmekini küp zaten breadboard bağlı (Şekil 4C bakınız).
2. Kalın cidarlı tamir kordonu / fiber ayırıcı serbest uçlarında bir komütatör / dönel eklem takın. Onlar yama kablosu üzerine tork birikimini önler kemirgen hareketi ile fiber dönmesine izin gibi Komütatörler gereklidir. Çok fazla tork, kordonlar bükmek kırılmaya yol ve test sırasında hayvanın doğal hareketi engelleyebilir.
3. Komütatöre hayvan yama kablosunu takın.
4. Hayvan yama kablosu (Şekil 5) serbest metal halka sonuna kadar bir bağlantı bölünmüş kovanı takın. Tüm yol kadar halkalı kovanını zorlamayın; Bu hayvana yapıştırılmış implante fiber optik (Şekil 6) bağlanır ne gibi ~ kovanın 0.5 cm maruz bırakın.
   Kritik Adım: Her zaman bağlantı sırasında implante elyaf ferrüle üzerinde kovanın genişlemesine izin veren bir bölünme ihtiva kollu satın almak vekaldırma. Implanttan kol kesmek için çalışırken implant kafatası püskürmesi eğer uyum çok sıkı hayvana ciddi travmaya neden olabilir. Eğer bu gerçekleşirse, hayvan çalışmasında kaldırılır ve acil veteriner bakım almak gerekir. Benzer şekilde, ilk defa yeni bir manşon kullanmadan önce, takıp ve kuvvet istenen miktarda keser kadar halkalı fişini çekerek 'it kırmak'.
   İpucu: sıkıca yüksük bağlı bir kol çıkarırken bir lif kırmak kolaydır. Bunu önlemek için, kovanın (standart pamuklu çubukla kolu sağ boyutu) açık ucuna küçük bir ahşap çubuk sokarak halkalı dışarı itin.
5. BNC kablosu kullanarak bir darbe üreteci için mavi lazer sürücüsünü bağlayın ve nabız jeneratörü açın.
6. Uygun koruyucu gözlük takın. Lazer "Curr" ve "TTL +" modu arkasındaki anahtarları ayarlayın. Emin tha olunsürücünün önündeki güç düğmesi sıfır set andturn lazer (ilk sürücüyü ve sonra lazer anahtar teslimi) t.
7. Bir ışık gücü ölçer kullanılarak ölçülen 10 mW hayvan yama kablosu fiber ucundan yayılan ediliyor - 5 böylece lazer önündeki güç düğmesini ayarlayın. 5-10 mW genel bir kılavuzdur - doku belirli bir hacmi Aravanis'in ve ark, deney başlamadan önce hesaplanmalıdır etkileyecek gerekli tam güç yoğunluğu ^3..
8. In vivo uyarılması için mavi lazer için "Analog" mod Anahtarı. Not: Sarı DPSS lazerler sürekli aydınlatma TTL + modunda çalıştırılır. Lazer ısınmak için 10-15 dakika bekleyin.
9. Yavaşça fare dizginlemek ve kronik implante fiber hayvan yama kablosu bölünmüş-kol bağlamak (Şekil 6). Her iki lif uçları birbiri ile fiziksel temas etmesi emin olun. Bir şekilde bağlayarak kol bölünmüş kullanınPencere ikisi arasında doğrudan temas görselleştirmek için Kritik Adım:. Bazen enkaz hayvanın implante fiber metal yüksük toplamak ve düzgün bağlantı engelleyebilir. Bu durumda, yavaşça eklenmeden önce hayvanın kafasına yüksüğü temizlemek için silme bir etanol kullanır. Bu hayvana ciddi travmaya neden olabilir yüksük üzerinde bir bağlantı kovanı asla zorlamayın. Lif uçları arasında fiziksel bir bağlantı temizlendikten sonra yapılamaz Eğer çalışmada hayvan kaldırmak.
   İpucu: Hafif sızıntı implante lif ve hayvan yama kablosu arasındaki bağlantı noktasında meydana gelebilir. Kemirgenler tarafından bu ışığın Görselleştirme deneysel bulandırabilir ¹⁰ sunabilir. Isı küçültme boru yama kordonlar bağlı ve yabancı ışık aza indirmek için bağlantı noktasının üzerinde kaydırdı olabilir.
10. Fare davranış testleri başlamadan önce bir kaç dakika için geri izin verin.
    İpucu: Dtaşıma strese neden olabilir ve davranışsal test yanıltabilecek hayvan bağlamak için gerekli, 3 gün önce - davranışsal test epending 2 bağlantı ve bağlama işlemi fareler alıştırarak en iyisidir, tatbik edilecek.
11. Konektör kablosu kırılmaların serbest olmasını sağlamak davranışsal test cihazında fare yerleştirin. Stimülasyon sırasında gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Hatta komütatörlerinin kullanımı ile, yama kordonlar uzun süre boyunca büküm eğilimi var ve davranış testi ile müdahale edebilir.
12. Seçim opsin aktive edecek bir önceden belirlenmiş frekansta mavi lazer pulse bir darbe jeneratörü kullanın. Sarı lazer kullanımı için: dış kepenkleri ile ya da sadece bir opak, yansıtıcı olmayan, yanmaz bir nesne ile ışın yolunu bloke ederek sarı lazer darbe.

4. Mesaj in vivo Stimülasyon Hususlar

Bu bölüm, tam bir proto olması amaçlanmamıştırcol ama vivo Optogenetic uyarılmasını takiben düşünülmelidir ek işlemler için rehber olarak sunulmaktadır.

1. Bir deneyin tamamlanmasından sonra, davranışsal sonuçların doğru yorumlanması için viral ve lif yerleştirme histolojik onaylayın. Kurumsal kurallarına göre hayvan Euthanize ve buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ve% 4 PBS (ağırlık / hacim) paraformaldehid ile hayvan serpmek.
2. Sıkıca pense veya hemostatlarla ile açıkta kalan metal halkalı tutarak implante fiber optik çıkarın. Bir pürüzsüz, ama hızlı, hareket yukarı çekin. Her deneyin sonunda, ışık çıkışının ölçülmesi yoluyla implante lifin bütünlüğü test edilmesi önemlidir.
3. Ilgi bölgesi boyunca kesit önce 48 saat - en az 24 paraformaldehid beyinleri Post-düzeltmek. (Donma mikrotomu kullanılarak ise, kesit birkaç gün önce bir% 30 sukroz çözeltisi içinde beyinleri inkübe). Standa kullanarak immunohistokimyasal gerçekleştirinUygun opsin-etiketli florofor tespiti için rd protokolleri, yani yeşil floresan protein (GFP), gelişmiş sarı floresan proteini (EYFP) veya MCherry.
4. Bir mikroskop altında opsin ifade ve lif implantın sitesini kontrol ve görsel seçilen koordinatlara dayalı virüs enjeksiyonu ve implanta uygun yerleşimi onaylayın.

Sonuçlar

In vivo Optogenetic uyarılması ile elde edilen sonuçlar Davranış, kullanılan hayvan modeli ve modülasyon parametreleri hedef alınıyor nöral devre tamamen bağlıdır. Tirosin hidroksilaz mevcut gösterim amaçlı, dopamin, ventral tegmental alan nöronlar ya da VTA için :: Cre fareler sabit bir basamak fonksiyon opsin (SSFO) ⁸ ya da kontrol virüs (EYFP) ile transduse edilmiş, ve bir lif implantı kronik idi implante. TH :: Cre transgenik farelerin kullanılması sentezleme VTA TH + hücreler (dopamin) ile sınırlandırılmıştır opsin. 7 birden fazla fare eşzamanlı olarak uyarılması için geçerli açıklandığı lazer düzeneğini kullanarak elde edilen temsili davranış sonuçları tasvir etmektedir sağlar. Burada, fareler gergin ve (Şekil 4C'de olarak 3 fare / lazer) ayrı lazer kullanarak aynı anda uyarılan ve lokomotor davranışını 1 saat boyunca kaydedildi. VTA dopamin nöronlarının tekrarlı uyarım ile sonuçlanmıştırstimülasyon süresi boyunca devam hiperaktif fenotip. Lokomotor davranış değişiklik yok EYFP farelerde görüldü (video 1). Davranış testlerinden sonra, immünohistokimya görsel olarak teyit edildi VTA dopamin sinir hücrelerinin ve elyaf yerleştirme (bakınız Şekil 7) doğru, viral hedefleme doğrulamak için gerçekleştirilmiştir.

In vivo Optogenetic uyarılması için Şekil 1. Deneysel adımlar. Tasarımı ve in vivo Optogenetic uyarılması yaparken katılan dört genel adımlar vardır. Bu protokol, özellikle davranıyor kemirgen derin beyin yapıları bir lazer ışık kaynağından ışık teslim yer alan adımları ayrıntıları ve 1) lazer sistemi montaj ve hafif bağlantıyı içerir; C 2) bağlama stratejilerininveri yorumlama için gerekli olan bir adım - yönergelere yüksek verimli davranış testleri için bir ışık kaynağına birden hayvanları ağlanıyor ve 3) sağlayan ışık teslimat için hedefleme stratejisini onaylamak için. Not: Bu protokol bağlama amaçlı kronik implante lifleri özel olmasa da, tavsiye ve davranış testi ile Optogenetic stimülasyon birleştirerek zaman üstlendi. Ung & Arenkiel, 2012 ¹⁸ ve hem de Sparta ark. Bkz, içi üretim ve kronik optik fiberlerin implantasyonu 2012 ^9. Katı çizgiler = Bu protokol kapsamındaki adımlar.

In vivo Optogenetic, stimülasyon için kullanılan Şekil 2. lazer sistemleri. (A) 'in vivo uyarım ile ilgili tek bir lazer sistemi. Bu lazer ph olduğunu ysically üretici tarafından önceden birleştirilmiş ve küçük son kullanıcı set-up gerektirir. (B) Çift lazer sistemi. İki lazerler temassız tarzı coupler içine her ışın yolunu yönlendirmek için harekete aynalar aracılığıyla tek bir fiber içine birleştirilir. Bu (B) 'de gösterildiği çift lazer sisteminin en çok yönlü set-up gibi optik bileşenleri kaldırıldı veya gerekli ama daha verimli lazer bağlantı açısından bir meydan okuma sunuyor olarak eklenebilir. (C) şematik lazerlerin ve aynalar belirten yerleştirme ilgili lazer ışık demeti yolu (oklar) ile tasvir. Burada, dikroik ayna "D" bağlantı "C" ve ekli bağlantı yama kablosu içine aracılığıyla sarı dalga boylarını iletirken mavi dalga boyundaki ışığın saptırmak için kullanılır. B = mavi lazer; C = temassız tarzı elemanı; D = dikroik ayna; FW = filtre tekerleği; M = Ayna; Y sarı lazer =.= "_ blank" olsun> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil fiziksel olmayan birleştirme protokolü kullanılan 3. (A) Kablo tester Alt:. Kablo test cihazı, doğrudan bir yama kablosu bağlı. Ekle kablo test cihazı bağlantı noktasını göstermektedir (B) Patch kabloları protokol boyunca anılan dış itibaren iç için:.. Düz-cleave bağlı beyaz zirkon bölünmüş kovanı ile siyah ceketli hayvan yama kablosu (FC) son, modlu fiber splitter, (aynı zamanda bir "bağlantı kablosu" olarak anılacaktır), kalın cidarlı yama çekin. Kalın ceketli yama kordonlar ekstra koruma için polivinil klorür (PVC) boru ile kaplanmıştır. Bu kablolar için, endüstri standardı renk kodları farklı elyaf türleri, portakal = modlu fiber ayırt etmek için kullanılır. Hayvan yama kordonlar vardır ince davranış testi sırasında hayvan hareketi için esneklik sağlamak için ceketli. Kabloların kullanımda değilken / PC biter kapaklar FC yerleştirildiğinden emin toz unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

(A), tek bir hayvana, (B), iki hayvan in vivo Optogenetic uyarılması için Şekil 4. Bağ stratejileri; . (C) üç ya da dört hayvan Olası yapılandırmalar yukarıda gösterilen bunlarla sınırlı değildir - Birden fazla yapılandırmaları ticari veya özel sipariş ile mevcut adaptörler, lif bölücülerin ve dallanma yama kordonlar eşsiz kombinasyonu ile mümkündür. Not: patch kablo ve fiber bölücülerin her iki ucunda FC / PC konnektörlerini içerirler (yalnızca bir uç tasvir edilir).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 5. Bölünmüş-manşon kullanılarak bir implant fiber optik bir yama kablosunun doğru ve yanlış (kırmızı x) bağlantısı. (Sol panel) bölünmüş kılıf zirkon A implante fiber optik (Burada gösterilen bir hayvan yapıştırılmış olan) yüksük bir yama kablosunu bağlamak için kullanılır. Ok yama kablosu ve implante fiber optik arasındaki bağlantı noktasına işaret ediyor. Bağlantı kovanının bölünmüş yoluyla görüntülendi gibi bir boşluk, yama kablosu ve implante fiber optik arasında var (Sağ panel) ile karşılaştırın. Bir yanlış bağlantı (sağ alt) ile oluşabilir ışık sızıntısını unutmayın. U üzerinde alt eklemepper sol panel kullanılmıştır bileşenleri tek tek gösteriyor. Dor implante fiber optik kanül, beyaz zirkon bölünmüş kovan, siyah ceketli hayvan yama kablosu düz-cleeve (YP) son (Şekil 3B tasvir tam yama kablosu): Yukarıdan ucun altına. Tüm panellerde, bağlantı kovan yama kablosu FC ucu ile aynı hizada olmadığını unutmayın. Bırakın ~ 0.5 cm bir-üzerinde asılı hayvan yapıştırılmış implante fiber optik bağlantı için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6. Yan (solda) ve frontal bir yama kablosu bağlı bir implante fiber optik bir fare (sağ) görünüm. Yama kablosu t uygun bağlantı görselleştirmek yardımcı bağlayan kol bölünmüş kullanınimplante fiber optik yüksük o. Bağlantı noktası kırmızı kesik kutu ile vurgulanır ve aynı zamanda üst ekleme tasvir edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

7. Temsilcisi sonuçları Şekil. (Sol) in vivo Optogenetic stimülasyon Davranış okuma. Tarif edilen lazer kurulum ve bağlama protokolü kullanılarak elde edilebilir davranış örneği. Ya bir basamak fonksiyon opsin (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ile transduse - lokomotor aktivitesi, ventral tegmental alan tirozin hidroksilaz (VTA) (TH) :: Cre fareleri (8 / grup, n = 7), Optogenetic uyarılması sırasında kaydedildi ) veya kontrol virüsü VTA'da içinde (AAV5-DIO-EYFP). Üç farelerin grupları aynı anda tek bir gergin edildiŞekil 4C'de gösterilen ve 447 ya da 473 nm ışık maddenin 5 saniyelik bir darbe ile uyarılmış lazer her 15 dakikada bir teslim edilir. İki yönlü tekrarlı ölçümler ANOVA Optogenetic stimülasyon lokomotor aktivite artışı sayede önemli bir grup x zaman etkileşim (F _3,39 = 15.27, p <0.0001) ve önemli bir zaman temel etkisi (F _3,39 = 4.67, p = 0.007) saptandı Sadece (göreceli Bonferroni post-hoc p <0.0001, = 0 t - 15 kez bin) SSFO farelerde EYFP farelerin (grubun ana etkisi ile karşılaştırıldığında lokomotor aktivitede genel artmasına neden: F _1,39 = 10.69, p = 0,0061; t = 15 de Bonferroni post-hoc p <0.01 - t 30 ve p <0.001 = 30-45 ve t = 45-60). Elyaf özellikleri: 200 mikron çekirdek, 0.22 NA. Önce gerilmesinden fiber ucunda yayılan 5 mW ışık gücü ile viral enjeksiyon sitesinden 0,6 mm - Işık radyasyonu = 6 - 0.1 lif ucu mesafeye tekabül 66 mW / ^mm2,. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. EYFPSSFO vs: ** p <0.01; *** P <0.001; Zaman etkisi: #### p <0.0001, viral ve fiber optik yerleştirme (Sağ) histolojik onay.. Leica TCS SP5 tarama laser mikroskop ile elde edilen Konfokal floresan görüntü elyaf yerleştirme (noktalı çizgi) ve in vivo olarak Optogenetic uyarım, fare, ventral tegmental alan viral aracılı ekspresyonunu (yeşil) görselleştirmek için kullanılmıştır. Dopamin nöronları (TH +) mavi görülür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

In vivo Optogenetic stimülasyon Video In: 1.. Hiperaktivite TH :: Cre farelerde SSFO kullanarak VTA uyarılması sırasında bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1. Işık Irradiances yaygın olarak kullanılan opsins etkinleştirmek için gerekli.
Opsin Varyant	λ	Güç Yoğunluğu (/ aa 2)		Özellikler
			/ Kapalı Kinetiğine
Optik uyarım: Hızlı etkili channelrhodopsins
ChR2 2	470	1 - 5mW	1.21 / 12 msn	40 Hz kadar Yangınlar
Cheta 19	490	5 mW	0.86 / 8.5 msn	200 Hz kadar Yangınlar
ŞEFİ 20	450	1.65 mW	1.62 / 12 ms	ChR2 olmayan desensitizan formu
C1V 18	540-630	8 mW (540 nm'lik)	54 at 5/34 msn0nm	Kırmızı-kaymıştır
		3.2 mW (630 nm)	67 msn (on) 630 nm 'de
Optik uyarım: Yavaş hareket eden kanal rhodopsins
Kararlı adım fonksiyonu opsin (SFO) 8	470/590	8 uW (470 nm'de)	20 milisaniye / 29 dak	Yeni SFO varyantı; uzun süre açık devlet. 590 nm tarafından kapatıldı, 470 nm ile Açıldı
Optik İnhibisyon
eNpHR3.0 21	560-630	3-5 mW	2.5 msn / <10 msn	Sabit ışık ile 30 dakika 22 Sürekli önleme *
ArchT3.0 11, 23	520-560	1-5 mW	2 / <10 msn	ENpHR3.0
Bu tablo sadece bir kılavuz olarak verilmiştir; nöral modülasyonu için gerekli özel ışık Irradiances bağımsız teyit edilmelidir.
Deneysel doğrulama opsin, hedefleme stratejisi ve hafif stimülasyon parametreleri istenilen şekilde 5 nöral ateşleme modüle doğrulamak için önemlidir.
Güç yoğunluğu (mW / mm2), beyin dokusu belirli bir alan üzerinde ışıklı ışığın gücünü ifade eder ve fiber ucundan yayılan ışık gücü ile ilgili değildir.
* Her zaman, özellikle uzun süreli ışık uyarımı ile, mümkün olan en düşük ışık yoğunluğunu kullanın.

Tablo 1. Işık Irradiances yaygın olarak kullanılan opsins etkinleştirmek için gerekli.
Kısaltmalar
AAV adeno-ilişkili virüs =
DPSS = diyot pompalı katı hal
EYFP = gelişmiş sarı floresan proteini
FC / PC = düz cleave / fiziksel temas
GFP = yeşil floresan proteini
PBS = fosfat tamponlu salin
PVC polivinil klorür =
Mw = miliwat
NA = sayısal açıklık
SSFO istikrarlı adım fonksiyonu opsin =
TH = tirosin hidroksilaz
TTL = transistör-transistör mantığı
V = gerilim
VTA = ventral tegmental alan

Tartışmalar

Mevcut açıklanan lazer set-up ve bağlama stratejileri kemirgen davranış testleri geniş bir yelpazede ile uyumludur. Nitekim, davranış testleri çeşitli izleyen kullanılan, ya da eşlik eden edilmiş, duygusal, davranışsal görevleri, davranış klima, öğrenme ve hafıza paradigmaları, uyku, uyarılma ve iştahlı görevleri şunlardır in vivo Optogenetic stimülasyon birkaç isim (Nieh ark bakın. ⁶ kapsamlı bir inceleme için). Optogenetik geleneksel davranış testleri birden fazla gün çalışmaları yapılmaktadır yolu artık davranış karşılaştırıldığı bir tek oturumda yoğunlaşmış olabilir değişti, karşı 'kapalı' 'üzerinde' ışık farklı çağlarda sırasında,-konular içinde ^5. Notun, kapıları ihtiva davranış cihazları, kapalı bölmeler veya diğer engel gergin liflerin geçişini sağlamak için modifiye edilmesi gerekebilir.

açıklanan bağlama stratejileri izin siTek bir lazerden gelen birden fazla farelerin multaneous uyarılması. Yüksek verim Optogenetic davranışsal test nedenle birden lazerler ve test ekipmanları kullanımı yoluyla elde edilebilir. aynı anda uyarılabilen hayvan sayısı, ancak, her lif uç elde edilebilir maksimum ışık enerjisi ile sınırlı olacaktır. Fiber ucundaki maksimum güç çıkışı lazer 1) başlangıç ​​gücü bağlıdır; 2) bağlanma verimliliği ve kiriş böler 3) sayısı. 200 mikron çekirdek, 0.22 NA fiber patch kablo kullanırken ~% 80 bağlanma verimliliğiyle ve (Şekil 4C gösterildiği gibi) 4 ışın böler, lif ucunda ortalama güce kadar 100 mW mavi lazer için 5-10 mW arasında değişebilir (nb Mm2) aktivasyonu için gerekli olan ^11. Örneğin, kararlı adım fonksiyonu opsin (SSFO) bir foton akümülatör gibi davranır ve bu nedenle aktivasyon için çok az ışık güç yoğunluğu (<8 uW / mm ²⁾ gerektirir ^8. Aksiyon potansiyelleri ortaya çıkarmak için ışık 1 mW / mm ² en az gerektirir geleneksel kanal rodopsin (ChR2) bu Karşılaştırması ^2. Tablo 1 şu anda en yaygın opsins etkinleştirmek için gerekli minimum ışık bilinen ışık şiddetlerinin için hızlı bir referans olarak verilmiştir kullanın. Son olarak, bir o ışık scatter düşünün ve daha hafif güç derin beyin yapıları ³ için gerekli olan bu tür beyin dokusu üzerinden geçecek gibi emer gerekir. Yararlı bir online kaynak mevcuttur http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php içine alarak beyin dokusu boyunca çeşitli derinliklerde ışık yoğunluğunu hesaplamak olacakFiber çekirdek boyutu, sayısal diyafram, kullanılan ışığın dalga boyunu ve lif ucunda başlayan ışık gücü oluşturmaktadır. Bu hesaplamalar altında yatan teorik ilkeleri mükemmel bir bakış için, Foutz ark bakın. (2012) ^12. Deneysel tasarım bu ilkeleri ve hesaplamaları nasıl uygulanacağını örnekleri (2007) ^3. Aravanis'in ark gösterdi ve Tye ve ark. (2012) ¹³ edilmektedir. Bir deney başlamadan önce bu hesaplamaları Sahne opsin aktivasyonu için yeterli ışık ışınlama sağlamak için önemlidir. Bu hususlar göz önüne alındığında, yeterli güç çıkışı sağlamak için yüksek enerjili lazerler satın avantajlıdır. 100-200 mW arasında bir güç çıkışına sahip Lazerler küçük çekirdek lifleri, çoklu lif bölme, birleştirme verimsizlik telafi etmek için genellikle yeterli ve iletim ⁷ kaybeder. Yüksek güç lazerler kullanarak Ancak, bakım nöral hasar veya ısı ve ışık ilişkilendirmek önlemek için alınması gerekenUzun süreli ve / veya yüksek enerjili ışık aydınlatma ⁷ ile oluşabilir d eserler. In vivo deneyler için güvenli aralık 75 mW / ^mm2 kadar olduğunu. ¹⁴

Satın alma lazer türüne karar göz önünde birçok faktör vardır gibi karmaşık bir mesele olabilir. Örneğin, doğrudan diyot lazerler diyot pompalı katı-hal (DPSS) lazerler yapmak ve bir laboratuar ortamında zamanla daha güvenilir daha istikrarlı ve tekrarlanabilir darbeli çıkış sağlar. Bazı durumlarda ise, doğrudan diyot lazerler kumanda gerilimi nedeniyle lazerin kontrol elektroniği ile diyot gönderilen akım sabit bir önyargı 0 V bile, daha düşük bir ışık gücü, ~ 0.1 mW yayabilirler. Bu 'kendiliğinden' emisyon aynı lazer lazer emisyonunu yaptığından daha geniş bir spektrumu vardır, bu nedenle özellikle lazer ve birleştiricisi arasındaki dar bant-geçiş (ya da 'temizleme') filtre (parça listesine bakınız) yükleyerek azaltılabilir. Bu filtre aynı zamanda olacaklasing zaman% 50 ~ güç çıkışını azaltır, bu yüzden buna göre daha yüksek enerjili lazer satın. Bu sarı DPSS lazerler son derece hassas ve kararsız davranabilir ve hızlı bir darbe üreteci tarafından modüle eğer ömrünü azalttı dikkat edilmelidir. Sarı lazer gücünün ayarlanması TTL + modunda lazer çalışırken ışın yolu (Bölüm 1.7) yerleştirilir dış yoğunluk filtresi tekerlekleri sayesinde yapılmalıdır. Alternatif olarak, yeşil 532 nm DPSS lazer satın halorhodopsins ve archaerhodopsins hem etkinleştirebilirsiniz bir maliyet-etkin bir alternatif.

Bir fiber sayısal açıklık (NA) tasarımı ve lazer düzeneği set-up için lif bileşenleri satın alırken göz önünde bulundurulması önemlidir. Bir optik fiber NA kabul edilen ve bir elyafın ucuna yayılabilen ışık ışınlarının açılarını belirler. Yüksek-NA fiber alt-NA fiber evlendirilen ise, önemli bir kayıp bu arayüzde meydana gelecektir, bu yüzden tutarlı wi olmak önemlidir Tek bir kurulum içinde inci lif NA (veya NA ışık yolu boyunca artar sağlamak için). Işıklı beyin dokusunun hacmi lif NA etkisi beyin dokusu olduğundan son derece saçılma ve bir lazer kaynağından birleştiğinde ışık için 'Az dolu' yüksek NA liflerini eğiliminde olacaktır, çünkü daha az önemlidir; 0.22 ve 0.37 arasında bir NA ile ancak optik lifler yaygın olarak kullanılmaktadır. Benzer şekilde, bir küçük-çekirdekli fiber daha büyük bir-çekirdek bağlanması da önemli kayıplara neden, bu nedenle her zaman hayvan implant lazer kaynağından ilerleyen zaman artan eşit veya çekirdek çapları kullandığınızdan emin olacaktır. Genel bir not, lif uçları her zaman kullanımda toz ve partikül birikmesini önlemek için zaman kapatılmalıdır. Bu iyi bir fikir düzenli temiz lif uçları ve konektörler (% 70 izopropil alkol iyi çalışıyor) maksimal ışık güç çıkışını sağlamak için, ve her gün deneylerini başlamadan önce bir 'kukla implant' ile hafif güç çıkışını test etmek.

"> Davranış testi sırasında, adım virüs enfeksiyonu, dışsal protein ifadesi, görünür ışık ve hayvan davranışı üzerindeki muhtemel doku ısıtma etkileri ve eser etkileri kontrol etmek için alınması zorunludur. Bu nedenle, uygun bir kontrol grubu hayvanları arasında olmalıdır bir kontrol virüsü ile transduced (örneğin, GFP, EYFP, mCherry) aynı ışık stimülasyon parametreleri alırsınız. Deneysel doğrulama analizi için kullanılan davranışsal veri olarak önemli bir son adım ilgi bölgeye uygun opsin ve fiber optik yerleştirme tamamen bağımlı olduğu sinyal ya da lif yerleştirilmesi ilgilenilen bölgesinde uygulama değildir. Özellikle, herhangi bir immünohistokimyasal sinyali tespit edildiğinde hayvanlarda veya hayvan için davranışsal veri deneyden çıkarılmalıdır. Buna ek olarak, ışık çıkışı test etmek için esastır hem cerrahi implantasyon ve tekrar otopsi öncesi lif ucu opsin aktivasyonu için yeterli ışık gücü sağlamak için. anima olarakŞiddetli ışık kaybı denemeden sonra fiber üzerinden oluştu mi (>% 30) ^9, bu hayvan için veri kaldırılması için dikkate alınmalıdır. Kaldırılması için Kriterleri priori kurulmalıdır. Son olarak, bir hedef alındığını beyin yapısı ve nöronal alt tiplerine bağlı olacaktır sinir ateş modüle için gerekli darbe frekansını, düşünmek gerekir. Yayınlandı Optogenetic ışık stimülasyon parametreleri ancak, nöral ateş modüle yeteneği bağımsız in vivo veya beyin dilim elektrofizyolojik kayıtlar ile teyit edilmelidir birden nöronal alt-türleri için mevcuttur.

Bir lazer kullanılması ve lazer set up modifikasyonu ile usta hale geldikçe, farklı dalga boylarında kombinasyonları, tek bir hayvana birden fazla elyaf gergin ya da kombinasyon Optogenetik ⁸ aynı fibere teslim edilebilir. Çok dalga boyu uyarım kırmızı-shift hızlı bir gelişme verilen giderek daha önemli hale gelecektired ⁸ channelrhodopsins, mavi-kaymıştır hiperpolarizan opsins ¹⁵ mühendislik, iki durumlu adım fonksiyon opsins ^8,16,17 kullanımı ve farklı aktivasyon spektrumları ¹¹ opsins genel genişleyen listesi. Optogenetic araç kutusu Bu genişleme, karmaşık davranış devletleri yöneten rollerini belirlemek için içinde ve beyin bölgeleri arasında hem birden fazla nöral alt-türleri görülmemiş kontrolünü izin verecektir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Laser Set-up
100 mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability (quantity: 1)	Omicron	Luxx/Phoxx 473/488-100	Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display
100 mW 594nm DPSS laser (quantity: 1)	Colbolt	0594-04-01-0100-300	04-01 series yellow laser; sensitive to back reflection from fibers
200 mW 532 nm DPSS laser; 5% power stability (quantity: 1)	Shanghai Lasers	GL532T3-200	Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins
Non-contact style laser to multimode fiber coupler (quantity: 1)	OZ Optics	HPUC-23-400/700-M-20AC-11	For use with dual laser set-up; Specs: 33 mm OD for 400 - 700 nm; FC receptacle, f = 20 mm lens with post mount laser head adapter #11
Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 1)	Thorlabs	MB1213	For dual laser system
Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded (quantity: 1)	Thorlabs	MB1012	For single laser system
Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 2)	Thorlabs	MB4	For blue laser; dual laser system
Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped (quantity: 4)	Thorlabs	CL3
3/4" stainless post (quantity: 1)	Thorlabs	TR075
1" stainless post (quantity: 4)	Thorlabs	TR1
Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew (quantity: 2)	Thorlabs	PH1
Pedestal Base Adapter (quantity: 3)	Thorlabs	BE1
Small Clamping Fork (quantity: 3)	Thorlabs	CF1253
Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror (quantity: 3)	Thorlabs	KM100-E02
Neutral filter density wheel (quantity: 1)	Thorlabs	NDC-50C-2M
1" Longpass dichroic mirror 50% (quantity: 1)	Thorlabs	DMLP505
Kinematic mount for 1" optics (quantity: 1)	Thorlabs	KM100	For dichroic mirror
20-piece hex wrench kit with stand (quantity: 1)	Thorlabs	TC2
1/4"-20 cap screw and hardware kit (quantity: 1)	Thorlabs	HW-KIT2
Mounting base 1" x 2.3" x 3/8" (quantity: 1)	Thorlabs	BA1S
FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve (quantity: 2)	Thorlabs	ADAFCB1	Dual FC/PC L-bracket also available
Breadboard lifting handles (quantity: 3)	Thorlabs	BBH1
Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm (quantity: 1)	Thorlabs	FB450-10	For use with diode lasers that spontaneously emit
2. Laser Coupling
! Laser protective eyewear (quantity: 1 for every user at each wavelength)	Various		! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser
Fiber optic cable tester (quantity: 1)	Eclipse	902-186N
One-step fiber connector cleaner (quantity: 1)	Thorlabs	FBC1
Coupler patch cord (0.75 meter) (quantity: 1)	Thorlabs		0.75 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; for dual laser system
Coupler patch cord (0.5 meter) (quantity: 1)	Thorlabs		0.5 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors, multimode; for single laser system
Doric mini cube (quantity: 2)	DORIC	DMC_1x2_FC-2FC
Compact power and energy meter console (quantity: 1)	Thorlabs	PM100D	Digital 4" LCD
C-series slim power sensor 5 - 500 mW (quantity: 1)	Thorlabs	S130C	Multiple detectors types are available; check with vendor
3. In vivo Optogenetic Stimulation
Multimode fiber splitters (quantity: 2)	FONT Canada		Large core fiber optic 1 x 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized. Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available
Arbitrary waveform function generator (2 channel) (quantity: 1)	Rigol	DG1022	Can control up to 2 lasers at once
Fiber optic rotary joint (commutator) (quantity: 6 - 8)	DORIC*	FRJ_1X1_FC-FC	*Also available through Thorlabs and Prizmatix
Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) (quantity: 8)	DORIC	MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5	Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.
PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) (quantity: 1)	Precision fiber Products	SM-CS1140S1	Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end
Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) (quantity: 1)	Thorlabs	CAPF
Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves (quantity: 1)	Thorlabs	CAPF1
Thick-jacketed patch cords (custom order) (quantity: 4)	Thorlabs		200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering