In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

Résumé

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Résumé

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

Introduction

Optogenetics a révolutionné les neurosciences au niveau des systèmes dans sa recherche pour les éléments de circuit neuronal de conduite états comportementaux normaux et pathologiques pertinentes. La découverte que opsines microbiennes sensibles à la lumière ¹ pourraient être exprimés dans des cellules de mammifères fonctionnellement fourni la plate-forme pour l'utilisation de la lumière pour obtenir un contrôle sans précédent de l'activité neuronale avec une grande précision spatiale et temporelle ^2. Contrairement aux approches traditionnelles électrophysiologiques ou pharmacologiques à la manipulation de l'activité neuronale, optogénétique permet le contrôle de types de cellules spécifiques (sur la base génétique identifier ou projection spatiale) à l'intérieur des populations hétérogènes à des échelles de temps et physiologiquement pertinents. L'introduction ultérieure d'une interface neurale-optique a fourni un outil pratique pour la livraison de la lumière pour se comporter ^trois animaux. Cela a permis pour la modulation en temps réel des circuits neuronaux définis chez les rongeurs de se comporter éveillés afin de tester le lien de causalitérôle de ces circuits neuronaux dans la gouvernance des états comportementaux concernant les maladies neurologiques et psychiatriques ^4-6. Optogenetics, représente donc un outil puissant pour l'introduction dans ne importe quel laboratoire intéressé à étudier la relation fonctionnelle entre l'activité cérébrale et les mesures comportementales ou physiologiques dans des modèles animaux.

La conception et la réalisation de une expérience optogenetic implique différentes étapes et considérations (voir Figure 1). Le but du protocole actuel est de fournir aux individus les outils et composants, avec la connaissance théorique et pratique, nécessaire pour effectuer une stimulation optogenetic chez les rongeurs de se comporter éveillés. Actuellement, il ya deux plages de longueur d'onde prédominante utilisées pour activer les canaux opsin microbiennes: dans le spectre bleu (473 nm couramment) et spectres vert-jaune (couramment 532 ou 591 nm). Les deux lasers et de diodes électroluminescentes (DEL) peuvent être utilisés comme sources de lumière à dEliver longueurs d'onde spécifiques de la lumière aux tissus du cerveau. La lumière non cohérente émise par des LED, cependant, rend la transmission efficace de la lumière difficile lors de l'accouplement dans les petites fibres de base nécessaires à la stimulation in vivo de rongeurs. Décider sur l'ensemble de laser approprié est une première étape cruciale et dépendra de l'utilisation prévue de l'optogénétique dans le laboratoire. Le protocole actuel décrit deux configurations de base qui diffèrent dans leur facilité de montage et de l'utilisation des lasers: pré-couplé simples et les systèmes à double laser (voir figure 2). Systèmes laser simples qui sont pré-couplés par le fabricant sont essentiellement prêt-à-go à l'arrivée avec peu ou pas de set-up nécessaire mais présentent l'inconvénient de personnalisation minimale de l'utilisateur final. Système de laser à double permet la livraison de deux longueurs d'onde différentes sur la même fibre. Cela va devenir de plus en plus importante avec l'avènement de l'optogénétique combinatoire lequel différentes longueurs d'onde peuvent être utilisés pour activer / inhiber la distinctiont types cellulaires qui sont co-localisé spatialement. Ce est également essentiel pour une utilisation avec bi-stables opsines de fonction de l'étape où sont photocourants début et la fin par la lumière bleue et jaune, respectivement ^7,8. Systèmes laser double sont également personnalisables que l'utilisateur peut ajouter ou supprimer des composants (par exemple, volets extérieurs, des filtres de faisceau, compteurs de puissance en ligne) de la trajectoire du faisceau selon les besoins. Grâce à sa polyvalence, le laser double set-up est recommandé si optogénétique va être un outil continué utilisé dans le laboratoire. Le couplage des lasers, cependant, peut présenter un défi et donc un mécanisme de couplage rapide, simple et fiable est prévue dans ce protocole. Remarque, ce protocole détaille l'assemblage de composants optiques et utilise les cordons de brassage et de composants qui sont optimisés pour les fibres multimodes à saut d'indice avec un noyau de 200 um et une ouverture numérique (NA) de 0,22. Tailles de base différentes et NA sont disponibles à l'achat, mais tous les composants devraient idéalement correspondre en termes de coeurtaille et NA pour éviter la perte de lumière aux points de connexion de la fibre. En variante, à une connexion de fibre, la lumière peut passer à partir d'une plus petite à une taille de noyau plus grand; et / ou d'un faible NA-NA à une fibre plus élevé sans perte supplémentaire.

stratégies d'attache sont prévus qui permettent une stimulation simultanée de plusieurs tests comportementaux pour les souris à haut débit. Les protocoles fournis supposent l'utilisation de fibres implantables chroniques pour les tests de comportement mais peuvent être modifiés pour les protocoles de stimulation aiguë. Fibres aiguë implantés sont avantageux pour combiner la stimulation optogenetic avec la manipulation pharmacologique, puisque le même canule peut être utilisé pour délivrer des médicaments et la pointe d'une fibre optique au même endroit. L'utilisation de fibres implantées chronique est cependant fortement recommandé pour les tests comportementaux plusieurs jours, car elle réduit les lésions tissulaires associées à l'insertion et le retrait répétés de fibres et augmente la précision en termes de placement cohérent de fibres pourillumination de tissu ^3. Lorsqu'il est combiné avec les configurations d'attache décrits ici, le comportement peut être enregistrée de manière fiable sur plusieurs jours. Mois En effet, la transmission de lumière fiable n'a été signalée après l'implantation de la fibre ⁹ telles que la stimulation chronique et des modèles de tests comportementaux peuvent, en théorie, être effectuées sur plusieurs jours et semaines. Notes supplémentaires sur les composants matériels ont été ajoutés au protocole pour permettre le choix de lecteur dans le meilleur produit qui répondra à leurs besoins individuels, y compris des solutions de rechange rentables et les produits qui peuvent être faites en interne. Conseils importants qui sont utiles lors de l'installation et de mise en œuvre sont également fournis.

Protocole

! ATTENTION: Ce protocole implique l'utilisation de lasers de Classe 3B et nécessitera des directives de formation et de sécurité appropriées à prendre. lunettes de sécurité doivent être portés en tout temps lors de l'utilisation des lasers, des procédures d'alignement présentant un risque particulièrement élevé. Contactez le fournisseur de laser pour déterminer les lunettes qui fournir une atténuation maximale pour un laser donné. Si possible, se inscrire à un cours de formation à la sécurité laser institutionnel. Ne jamais faire fonctionner un laser sans lunettes de sécurité et une formation appropriées.

1. Laser Appareil Set-up

Le cas échéant, les étapes du paragraphe 1 sont désignés par (A) ou (B) pour différencier les systèmes laser simple ou double, respectivement.

1. Attacher et sécuriser des lasers pour la planche à pain. Breadboards sont d'excellents conducteurs de chaleur et agissent comme un dissipateur de chaleur pour éviter d'endommager des composants laser internes avec une utilisation prolongée.
2. (A) Fixer le las pré-coupléer à un "x 12" planche à pain 10 (ou au besoin) à l'aide de ¼-20 "vis et rondelles capitalisation (figure 2A). Si les trous de plaque d'essais ne se alignent pas avec laser trous de montage, utiliser de petites pinces «de table» pour garantir laser pour la carte de développement.
3. (B) Si les deux lasers à utiliser sont très différentes hauteurs de faisceaux (> ~ 1 cm), utilisez des petits 4 "x 6" maquettes pour créer une plate-forme pour l'un des lasers. Fixez ces planches aux principales grandes 12 "x 18" planche à pain en utilisant ¼-20 "les vis avec les rondelles, puis fixez le laser pour les petites cartes utilisant les vis ou crochets de la table comme le montre la figure 2B. Attachez l'autre laser directement à la carte de test utilisant les vis ou une variable table à hauteur pince.
   Etape critique: Breadboards, vis, et les composants optiques peuvent être achetés comme impériales ou métriques ainsi soit cohérent lorsque l'achat d'articles; la valeur par défaut pour ce protocole est impérial.
4. (A)Joindre une épaisse enveloppe-cleave plat / contact physique (FC / PC) du cordon de raccordement au coupleur (dénommé un cordon de coupleur; voir la figure 3) qui est physiquement attaché à l'avant du laser (figure 2A).
5. (B) Enfiler le coupleur sur un ¾ "post optique, puis époxy l'articulation entre le coupleur et le haut de la poste, en utilisant JB Kwik, ou époxy similaire, pour empêcher le desserrage et le désalignement pendant l'utilisation. Fixez le poteau à la planche à pain (comme les trous de plaque d'essais ne seront pas toujours se aligner avec la mise en place nécessaire de composants optiques, un titulaire du poste, un adaptateur de base piédestal, et de serrage de fourche sont utilisés pour sécuriser poste optique du coupleur en place). Fixer un cordon de raccordement à double paroi épaisse (coupleur épinière) à l'arrière du coupleur.
6. (B) Insérez le premier miroir de pilotage du laser bleu dans le support cinématique, et l'attacher à la planche à pain en utilisant un ¾ "post optique. Fixez ce message à un adap de baseter et fourche de serrage. Placez la fourche de serrage et poster assemblée directement en face du laser bleu avec miroir incliné à 45 ° pour diriger le laser vers le miroir dichroïque. Utilisez le motif de grille de trous sur la carte de test d'un guide d'alignement approximatif. Une fois positionné à peu près, utiliser une vis ¼ "-20 plafond pour fixer la fourche de serrage à la carte de test (voir les figures 2B, C).
7. (B) Insérez le miroir dichroïque dans un support cinématique et l'attacher à un "post optique 1 et le fixer directement à la planche à pain. Placez le miroir dichroïque à l'extrême gauche de, et en conformité avec, le miroir de laser bleu. Angle le miroir dichroïque à un angle de 45 ° de telle sorte que la lumière bleue réfléchie par le premier miroir se reflète dans le coupleur, puis serrer la vis de fixation du support cinématique au poste (voir les figures 2B, C).
8. (B) Fixez le premier miroir de direction pour le laser jaune à un ¾ "post optique. Fixez le optiaprès cal à un adaptateur de base et une fourchette de serrage. Placez la fourche de serrage et post-ensemble directement en face du laser jaune et l'angle du miroir à un angle de 45 ° de telle sorte que la lumière jaune sera dirigé vers le deuxième miroir de pilotage. Fixez la fourche de serrage en place avec un ¼ "-20 vis d'assemblage et la rondelle.
9. (B) Fixez le deuxième miroir de pilotage pour le laser jaune à un "post optique 1. Angle du miroir de telle sorte que le faisceau de lumière jaune à partir du premier miroir est réfléchi par le miroir dichroïque et dans le coupleur (figure 2C). Sécuriser le poste directement à la planche à pain et serrer la vis de fixation une fois que le miroir est inclinée de façon appropriée. Beaux ajustements miroirs seront effectués en utilisant les supports de miroir cinématiques dans une étape ultérieure.
10. (B) Fixez une roue de filtre de densité neutre à un ¾ "post optique et placer le poteau dans un support de poste attaché à une base de montage. Fixez l'ensemble à la carte de test entre la première et soimiroirs jaunes cond utilisant un seul ¼ "-20 bouchon à vis. Cette molette est utilisée pour régler la puissance de la lumière laser jaune atteindre le coupleur.
    Astuce: serrer individuellement tous les composants (tels que les vis de fixation porte-miroir cinématiques en haut de poteaux et les fils retenant adaptateurs de base au fond de messages) avant de les attacher à la base. Utilisez un arbre d'une petite clé hexagonale dans les trous prévus à travers des postes-optiques pour obtenir un couple suffisant. Cela permettra d'éviter les composants se desserre pendant l'utilisation, ce qui nécessite un réalignement.
11. Fixez un FC / PC au FC / PC adaptateur L-support à la planche à pain.
12. Facultatif: Sécuriser un 1 x 2 50/50 mini-séparateur de fibre de cube directement à la carte de test pour la stimulation simultanée in vivo de deux ou plusieurs animaux. En outre, les poignées peuvent être ajoutés pour aider à mouvement de l'assemblage de plaque d'essais (comme on le voit sur ​​la figure 2A).

2. Couplage laser (sans contact style Couplage)

Cette section concerne le double laser set-up (figure 2B). Alignez le chemin de laser bleu intérieure avant d'aligner le chemin laser jaune externe.

! ATTENTION: Utilisez un couplage de puissance faible luminosité (~ 1 mW) pour assurer la sécurité des yeux. Porter des lunettes de sécurité à la puissance du laser et jusqu'à ce que l'intensité lumineuse est mesurée et considérées comme sûres.

1. Régler les commutateurs à l'arrière du laser à "Curr" (courant) et le mode logique transistor-transistor (TTL) + pour l'éclairage constant (par opposition au mode analogique). Assurez-vous que le bouton d'alimentation à l'avant du conducteur est fixé à zéro. Allumer le laser en tournant sur le premier conducteur et ensuite la clé de laser.
2. Ajuster lentement le bouton d'alimentation situé à l'avant du pilote laser afin que la lumière laser ~ 1 mW est émis. Attendre 10 à 15 min (ou comme spécifié par le fabricant) pour le laser pour se réchauffer.
3. Connectez le testeur de câble de fibre optique directement à la free extrémité du coupleur cordon de raccordement et allumez le testeur de câble (figure 3A). Ajustez l'angle du coupleur de sorte que le faisceau rouge se déplace vers l'arrière vers le centre du miroir dichroïque. La trajectoire du faisceau de la lumière rouge émise par le testeur de câble est le chemin exact que la lumière laser entrante devra suivre pour être couplé dans le laser.
4. Effectuer un alignement grossier: Utilisez les boutons latéraux et horizontaux sur les miroirs cinématiques pour diriger le faisceau de lumière laser dans le coupleur. Peut être nécessaire de repositionner légèrement desserré les miroirs et le coupleur Les pinces de piédestal. Les supports cinématiques devraient encore avoir certains Voyage disponible pour d'autres réglages fins. Ne vous inquiétez pas si aucune lumière bleue est émise sur le patch cordon coupleur-joint à ce moment.
5. Placez une seule feuille de papier semi-translucide directement en face du miroir dichroïque, entre le coupleur dichroïque et. Il y aura à la fois un bleu et ared point sur ce papier à partir du laser et le testeur de câble, respectivement. Utilisez du papier qui est translucide suffit de voir à la fois les taches rouges et bleues simultanément à partir du même côté du papier.
6. Effectuer des réglages fins du premier miroir de direction (ce est à dire, le plus proche du laser, pas dichroïque) en ajustant avec soin les boutons latéraux et horizontaux pour aligner le centre du point rouge avec le point bleu.
7. Déplacer le papier vers le coupleur de sorte qu'il est directement en face du coupleur et ajuster les commandes de la seconde (ce est-dichroïque) miroir pour aligner le faisceau laser avec le faisceau rouge.
8. Itérer sur les étapes 2,6 et 2,7 jusqu'à ce que le centre des faisceaux bleu / jaune et rouge sont exactement aligné dans les deux positions (ie, jusqu'à ce que les poutres rouges et bleus sont colinéaires).
9. Enlevez le testeur de câble du cordon du coupleur. La lumière laser doit maintenant être émise à partir de l'extrémité du cordon de raccordement de coupleur.
10. Détermine efficacité de couplage en mesurant la puissance lumineuse émise par la pointe de la fibre du cordon de raccordement de coupleur à l'aide d'un wattmètre. Utilisez le réglage de 500 mW sur la photodiode de l'indicateur de puissance et de modifier le réglage de longueur d'onde (λ) au bleu (473 nm) ou jaune (635 nm) du spectre selon le laser utilisé.
11. Placer l'extrémité de la fibre perpendiculaire à la photodiode pour obtenir une lecture de puissance. Comparer la puissance lumineuse entrant dans le coupleur de puissance de la lumière émise à partir de l'extrémité de fibre. Une efficacité de couplage de> 80% est considérée comme très bonne. Très petits ajustements supplémentaires du second miroir de direction peuvent parfois légèrement améliorer le couplage. En général, lorsque le diagramme de rayonnement de l'extrémité de la fibre de couplage est un petit serré, tache centrale (sans anneaux entourent), de rendement de couplage dans le coeur de la fibre est optimale.
12. Répétez les étapes 2.1 à 2.11 pour le couplage laser jaune, sauf utiliser les deux miroirs de direction pour le laser jaune (voir figure 2C). Ne past régler la position du miroir dichroïque ou l'alignement du laser bleu sera perdu.

3. In vivo optogénétiques Stimulation

Veiller à ce que toutes les procédures impliquant l'utilisation d'animaux sont menées conformément aux directives locales et nationales et approuvées par l'Institutional Animal Care correspondante et utilisation Comité.

1. Fibre optique mis en place (voir la figure 3B pour l'identification des différents types de cordons de raccordement mentionnée ci-dessous). Pour stimuler une seule souris, branchez le cordon de raccordement de coupleur à un cordon de raccordement épaisse enveloppe en utilisant le FC / FC support en L adaptateur directement attachée à la carte de test (voir la figure 4A). Pour stimuler deux animaux d'un laser, connectez le coupleur cordon de raccordement à deux cordons de brassage épaisse enveloppe en utilisant le 1 x 2 50/50 mini-cube (voir la figure 4B). Pour stimuler trois ou plusieurs animaux, branchez le cordon d'attelage à un répartiteur de fibre multimode utilisant le 1 x 2 mcube ini déjà attaché à la carte de test (voir figure 4C).
2. Joindre une / joint rotatif du collecteur aux extrémités libres de l'épaisse enveloppe séparateur cordon de raccordement / fibre. Commutateurs sont essentiels car ils permettent la rotation de la fibre avec le mouvement du rongeur, qui empêche l'accumulation de couple sur le cordon de raccordement. Trop de couple peut tordre les cordons, conduire à la rupture, et interférer avec le mouvement naturel de l'animal pendant les essais.
3. Fixez le cordon de raccordement des animaux au collecteur.
4. Joindre un manchon fendu la connexion à la fin du cordon de raccordement des animaux (Figure 5) de la virole de métal libre. Ne forcez pas le manchon tout le chemin jusqu'à la virole; quittent ~ 0,5 cm de manchon exposés comme ce est ce qui relie à la fibre optique implanté fixé à l'animal (figure 6).
   Etape critique: Achetez toujours des manches qui contiennent une scission pour permettre l'expansion du manchon sur implanté férule de fibres lors de la connexion etretrait. Trop serré d'un ajustement peut provoquer de graves traumatismes à l'animal si l'implant déloge du crâne en tentant de déconnecter le manchon de l'implant. Si cela se produit, l'animal doit être retiré de l'étude et de recevoir des soins de vétérinaire immédiate. De même, avant d'utiliser une nouvelle douille pour la première fois, «briser dans» par brancher et débrancher une virole jusqu'à ce qu'il se déconnecte de la quantité désirée de la force.
   Astuce: Il est facile de casser une fibre tout en retirant un manchon qui est étroitement attaché à une virole. Pour éviter cela, pousser la virole en insérant une petite tige en bois dans l'extrémité ouverte du manchon (le manche d'un coton-tige standard est la bonne taille).
5. Connectez le pilote de laser bleu à un générateur d'impulsions en utilisant un câble BNC et tourner le générateur d'impulsions sur.
6. Mettez des lunettes de sécurité appropriées sur. Réglez les commutateurs à l'arrière du laser en mode "Curr» et «TTL +". Assurez-vous que that le bouton d'alimentation à l'avant du conducteur est fixé à zéro andturn le laser (tourner sur le premier conducteur et ensuite la clé de laser).
7. Ajuster le bouton d'alimentation sur la face avant du laser de sorte que 5 à 10 mW est émise à partir de l'extrémité de la fibre de cordon de raccordement pour animaux, telle que mesurée en utilisant un compteur de puissance lumineuse. 5-10 mW est un guide général - l'intensité de puissance exacte nécessaire d'affecter un volume donné de tissu doit être calculée avant le début de l'expérience, comme dans Aravanis et al ^3.
8. Mettez le laser bleu en mode "analogique" pour la stimulation in vivo. Remarque: lasers DPSS jaunes sont exploités en mode TTL + pour un éclairage constant. Attendre 10 à 15 min pour le laser se réchauffer.
9. Retenir doucement la souris et branchez le split-manchon sur le patch animale cordon à la fibre implantable chronique (voir figure 6). Assurez-vous que les extrémités des deux fibres en contact physique avec une autre. Utilisez la scission sur le manchon de raccordement en tant quefenêtre pour visualiser un contact direct entre les deux Etape critique:. Parfois débris peuvent se accumuler sur la virole métallique de la fibre implantable de l'animal et d'interférer avec une connexion correcte. Dans ce cas, utilisez un mélange éthanol essuyer pour nettoyer délicatement l'embout sur la tête de l'animal avant la fixation. Ne forcez jamais un manchon de raccordement sur la virole car cela peut causer un traumatisme grave à l'animal. Si une connexion physique entre les extrémités des fibres ne peut être faite après le nettoyage, enlever l'animal de l'étude.
   Astuce: fuite de lumière peut se produire au point de connexion entre la fibre et animale cordon de raccordement implanté. Visualisation de cette lumière par les rongeurs peut présenter un confondre expérimentale ^10. Chaleur gaine thermorétractable peut être attaché à des cordons de brassage et a glissé sur le point de connexion pour minimiser la lumière parasite.
10. Laisser la souris pour récupérer pendant quelques minutes avant le début des tests comportementaux.
    Astuce: Delon le test comportemental à administrer, il est préférable d'habituer souris au processus de connexion et de modem 2-3 jours avant, que la manipulation nécessaire pour connecter l'animal peut induire un stress et confondre les tests comportementaux.
11. Passer la souris dans l'appareil d'essai de comportement se assurer que le cordon de raccordement est libre de chicots. Ne jamais laisser un animal sans surveillance pendant la stimulation. Même avec l'utilisation des collecteurs, des cordons de brassage ne ont tendance à se tordre pendant de longues périodes de temps et peuvent interférer avec le test comportemental.
12. Utiliser un générateur d'impulsion à impulsion du laser bleu à une fréquence prédéterminée qui activera l'opsine de choix. Pour une utilisation laser jaune: jaune impulsions laser avec des volets externes ou tout simplement en bloquant le trajet du faisceau avec un, non réfléchissant, ininflammable objet opaque.

4. Déposer in vivo Considérations de stimulation

Cette section ne est pas destinée à être un proto completcol, mais est offert à titre indicatif pour des interventions supplémentaires qui devraient être considérés suivante vivo la stimulation dans optogenetic.

1. À la fin d'une expérience, confirmer histologiquement de placement virale et de fibres pour l'interprétation précise des résultats comportementaux. Euthanasier animaux selon les directives institutionnelles et perfuser l'animal avec une solution saline tamponnée au phosphate glacée (PBS) et 4% (p / v) de paraformaldehyde dans du PBS.
2. Retirer implanté à fibre optique en saisissant fermement l'embout métallique exposée avec des pinces ou pinces hémostatiques. Tirez dans une douceur, mais rapidement, le mouvement. Il est important de tester l'intégrité de la fibre implantée en mesurant la sortie de lumière à la fin de chaque expérience.
3. Post-fixer les cerveaux de paraformaldéhyde pendant au moins 24 à 48 h avant la coupe à travers la région d'intérêt. (Si vous utilisez un microtome à congélation, incuber cerveaux dans une solution de saccharose à 30% pendant plusieurs jours avant la coupe). Effectuer immunohistochimie en utilisant Standard protocoles de détection des fluorophores opsin marqués appropriés, ce est à dire, la protéine verte fluorescente (GFP), le renforcement de la protéine fluorescente jaune (EYFP) ou mCherry.
4. Consultez le site d'expression opsine et l'implant de la fibre sous un microscope et confirmer visuellement placement approprié de l'injection de virus et l'implant sur la base de coordonnées choisies.

Résultats

Les résultats comportementaux obtenus avec la stimulation in vivo de optogenetic dépendent entièrement sur ​​le circuit neuronal étant ciblée, le modèle animal utilisé, et les paramètres de modulation. Pour fins de démonstration actuelles, les neurones dopaminergiques dans l'aire tegmentale ventrale, ou VTA, de la tyrosine hydroxylase :: souris Cre ont été transduites avec une étape-fonction stable opsine (SSFO) ^8, ou le virus de commande (EYFP), et un implant de fibres était chroniquement implanté. L'utilisation de souris transgéniques TH :: Cre assure que opsine expression est restreinte aux cellules TH + (dopamine) dans l'aire tegmentale ventrale. La figure 7 représente les résultats obtenus en utilisant représentatifs du comportement du laser mise en place décrit en cours pour la stimulation simultanée de plusieurs souris. Ici, les souris ont été stimulées relié et en même temps en utilisant des lasers séparés (3 souris / Laser selon la figure 4C) et le comportement locomotrice a été enregistrée pendant 1 heure. Stimulation répétée des neurones dopaminergiques dans le VTA a entraîné unehyperactif phénotype qui a persisté pendant toute la durée de la stimulation. Aucun changement dans le comportement locomoteur a été observée chez les souris EYFP (voir vidéo 1). Après les tests de comportement, immunohistochimie a été effectué pour vérifier ciblage virale exact de neurones dopaminergiques VTA et placement de fibres a été confirmée visuellement (voir Figure 7).

Figure 1. étapes expérimentales pour la stimulation optogenetic in vivo. Il ya quatre étapes générales impliquées dans la conception et la réalisation in vivo la stimulation optogenetic. Ce protocole détaille notamment les étapes impliquées dans la livraison de la lumière provenant d'une source de lumière laser à des structures profondes du cerveau chez le rongeur de se comporter et comprend 1) l'assemblage du système de couplage de la lumière laser et; 2) stratégies d'attache pour connexion plusieurs animaux à une source de lumière pour les tests de comportement à haut débit et 3) fournit des lignes directrices pour confirmer la stratégie de ciblage pour la livraison la lumière - une étape qui est essentielle pour l'interprétation des données. Note: bien que ce protocole ne est pas exclusive aux fibres implantables chroniques à des fins d'attache, il est recommandé et pris en charge lors de la combinaison avec la stimulation optogenetic tests comportementaux. Voir tant Ung & Arenkiel, 2012 ¹⁸ et Sparte et al., 2012 ⁹ pour la production et l'implantation de fibres optiques chroniques en interne. Les lignes continues = étapes couvertes par ce protocole.

Figure 2. Systèmes laser utilisés pour la stimulation optogenetic in vivo. (A) de système laser unique pour la stimulation in vivo. Ce laser est ph ysically pré-couplés par fabricant et nécessite peu d'utilisateur final set-up. (B) système laser double. Deux lasers sont couplées dans une fibre unique par l'utilisation de miroirs qui agissent pour diriger chaque trajet de faisceau en un coupleur de type sans contact. Ce est le plus polyvalent set-up en tant que composants optiques peuvent être retirées ou ajoutées, au besoin, mais présente un plus grand défi en termes de couplage laser efficace. (C) Schéma du système à double laser montré en (B) de placement indiquant des lasers et miroirs avec le trajet du faisceau de lumière laser correspondant (flèches) représenté. Ici, le miroir dichroïque "D" est utilisé pour dévier les longueurs d'onde bleues de la lumière tout en transmettant les longueurs d'onde jaunes à travers le coupleur de "C" et dans le cordon de raccordement de coupleur joint. B = laser bleu; C = coupleur de style non-contact; D = miroir dichroïque; FW = roue de filtre; M = Miroir; Y = laser jaune.obtenir = "_ blank"> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Bottom Figure 3. testeur (A) de câble utilisé dans le protocole de couplage non physique:. Testeur de câble directement relié à un cordon de raccordement. Insérer dépeint point de testeur au câble de connexion cordons (B) de Patch référence tout au long de protocole De extérieur vers l'intérieur:.. Multimode séparateur de fibres, noir-chemise animale cordon de raccordement avec le blanc manchon zircone split attaché au-cleave plat (FC) fin, Cordon de raccordement à double paroi épaisse (également dénommé une «corde de coupleur"). Cordons épais enveloppe sont recouvertes avec du chlorure de polyvinyle (PVC) tube pour une protection supplémentaire. Pour ces câbles, les codes de couleurs standard de l'industrie sont utilisés pour distinguer entre les différents types de fibres, où Orange = fibre multimode. cordons de brassage sont des animaux mince à double enveloppe pour permettre la flexibilité pour les mouvements d'animaux au cours des essais de comportement. Notez que la poussière bouchons sont placés sur FC / PC se termine lorsque les câbles ne sont pas en cours d'utilisation. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Stratégies d'attache pour la stimulation optogenetic in vivo de (A) un seul animal, (B) deux animaux; . (C) trois ou quatre animaux configurations possibles ne sont pas limités à ceux ci-dessus - de multiples configurations sont possibles grâce à la combinaison unique d'adaptateurs, séparateurs de fibres, et de branchement des cordons de brassage qui sont disponibles dans le commerce ou en commande spéciale. Remarque: les cordons de raccordement et répartiteurs de fibres contiennent FC / PC connecteurs sur les deux extrémités (une seule extrémité est représenté).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. (Rouge x) raccordement correct et incorrect d'un cordon de raccordement à une fibre optique implantable en utilisant une fraction de manches. (Panneau de gauche) A zircone split-manchon est utilisé pour connecter un cordon de raccordement à la virole d'une fibre optique implantable (ici pas apposé à un animal). Flèche pointe vers le point de connexion entre le cordon de raccordement et implantable fibre optique. Comparer à (panneau de droite) où il existe un écart entre le cordon de raccordement et implantable fibre optique, tels que révélés par la fente du manchon de raccordement. Notez la fuite de lumière qui peut se produire avec une mauvaise connexion (en bas à droite). Culot sur upper panneau de gauche représente composants individuels utilisés. De haut en bas de l'insert: Doric implantable fibre optique canule, zircone blanc split-manche, cleeve-plat (FC) fin d'un patch animale cordon noir à double enveloppe (cordon de raccordement complète représentée sur la figure 3B). Dans tous les panneaux, noter que le manchon de raccordement ne est pas de niveau avec la fin de la FC cordon de raccordement. Laissez ~ 0,5 cm d'une plus-accrocher pour la connexion à la fibre optique implantable apposée sur l'animal. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. Side (à gauche) et frontale (à droite) vue d'une souris avec une fibre optique implanté relié à un cordon de raccordement. Utilisez la scission sur le manchon de raccordement pour aider à visualiser une connexion correcte du cordon de raccordement to la virole de la fibre optique implanté. Le point de connexion est mise en évidence par une boîte en pointillé rouge et également représenté dans l'insert supérieure. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7. Les résultats représentatifs. (Gauche) lecture comportementale de la stimulation optogenetic in vivo. Exemple de comportement qui peut être obtenu en utilisant le laser décrit set-up et le protocole d'attache. L'activité locomotrice a été enregistrée pendant la stimulation optogenetic de l'aire tegmentale ventrale (VTA) dans la tyrosine hydroxylase (TH) :: souris Cre (n = 7-8 / groupe) transduites avec soit une étape-fonction opsine (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) ou le virus de commande (AAV5-DIO-EYFP) dans le VTA. Des groupes de trois souris ont été simultanément attachés à un seullaser comme représenté sur la figure 4C et stimulé par une impulsion de 5 sec de 447 ou 473 nm lumière livré une fois toutes les 15 min. Mesures répétées Two-Way ANOVA ont révélé une interaction significative groupe x temps (F _3,39 = 15,27, p <0,0001) et un effet principal significatif de temps (F _3,39 = 4,67, p = 0,007) selon laquelle la stimulation optogenetic augmentation de l'activité locomotrice seulement chez les souris SSFO (Bonferroni post-hoc p <0,0001, par rapport à t = 0-15 bin de temps), résultant en une augmentation globale de l'activité locomotrice par rapport aux souris EYFP (effet principal de groupe: F _1,39 = 10,69, p = 0,0061; Bonferroni post-hoc p <0,01 à t = 15-30 et p <0,001 à t = 30 à 45 et t = 45 à 60). Fiche d'Fibre: 200 um base, 0,22 NA. Lumière irradiance = 6-66 mW / mm ^2, correspondant à la fibre pointe distance de 0,1 à 0,6 mm de virale site d'injection avec la puissance de la lumière de 5 mW émise au bout de la fibre avant tethering. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. EYFPvs SSFO: ** p <0,01; *** P <0,001; effet du temps: #### p <0,0001 (droite) La confirmation histologique du placement virale et fibre optique.. Image de fluorescence confocale acquise sur un Leica TCS microscope à balayage laser SP5 a été utilisé pour visualiser placement de fibres (en pointillés) et d'expression à médiation virale (vert) dans l'aire tegmentale ventrale de souris après la stimulation in vivo dans optogenetic. Les neurones dopaminergiques (TH +) sont considérés en bleu. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Vidéo 1. In vivo la stimulation optogenetic:. Hyperactivité pendant la stimulation VTA utilisant SSFO chez les souris TH :: Cre Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.

Tableau 1. irradiances lumière nécessaire pour activer opsines couramment utilisés.
Opsin Variant	λ	La densité de puissance (/ mm 2)		Propriétés
			ON / OFF Kinetics
Excitation optique: channelrhodopsins action rapide
ChR2 2	470	1 - 5mW	1,21 / 12 msec	Feux jusqu'à 40 Hz
CHETA 19	490	5 mW	0,86 / 8,5 msec	Incendies jusqu'à 200 Hz
ChEF 20	450	1,65 mW	1,62 / 12 msec	Forme non-désensibilisation des ChR2
C1V 18	540-630	8 mW (540 nm)	5/34 msec à 540nm	Décalée vers le rouge
		3,2 mW (630nm)	67 ms (sur) à 630nm
Excitation optique: action lente rhodopsines de canal
Stable fonction échelon opsine (SFO) 8	470/590	8 mW (470nm)	20 msec / 29 min	La nouvelle version OFS; état plus ouvert. Ouverte par 470 nm, fermé par 590 nm
Inhibition optique
eNpHR3.0 21	560-630	3-5 mW	2,5 ms / <10 msec	Inhibition soutenue pendant 30 min 22 avec la lumière constante *
ArchT3.0 11, 23	520-560	1-5 mW	2 / <10 msec	Plus sensible avec de plus grandes photocourants que eNpHR3.0
Ce tableau est fourni qu'à titre indicatif; irradiances de lumière spécifiques requises pour la modulation de neurones doivent être confirmées de façon indépendante.
Validation expérimentale est important de vérifier que l'opsine, la stratégie de ciblage, et des paramètres de stimulation neurale lumière modulent cuisson de la manière prévue 5.
La densité de puissance (mW / mm 2) se réfère à la puissance de la lumière lumineux sur une zone donnée des tissus du cerveau et ne se réfère pas à la puissance lumineuse émise par la pointe de la fibre.
* Toujours utiliser l'intensité de la lumière le plus bas possible, surtout avec la stimulation lumineuse prolongée.

Tableau 1. irradiances lumière nécessaire pour activer opsines couramment utilisés.
Abréviations
AAV = virus adéno-associé
DPSS = état solide pompé par diode
EYFP = amélioré la protéine fluorescente jaune
FC / PC = cleave plat / contact physique
GFP = protéine fluorescente verte
PBS = solution saline tamponnée au phosphate
PVC = polychlorure de vinyle
mW = milliwatt
NA = ouverture numérique
SSFO = stable étape fonction opsin
TH = tyrosine hydroxylase
Logique TTL = transistor-transistor
V = tension
VTA = aire tegmentale ventrale

Discussion

Les laser décrit set-ups et les stratégies actuelles d'attache sont compatibles avec un large éventail de tests comportementaux de rongeurs. En effet, une variété de tests comportementaux ont été utilisés suivant, ou d'accompagnement, la stimulation optogenetic in vivo qui comprennent tâches émotives comportement, conditionnement comportemental, l'apprentissage et les paradigmes de mémoire, sommeil, l'éveil et les tâches appétitives pour ne en nommer que quelques-uns (voir Nieh et al. ⁶ pour un examen complet). Optogenetics a changé la façon dont des tests comportementaux traditionnels sont menées en ce que les études de plusieurs jours peut maintenant être condensé en une seule session à laquelle le comportement est comparé, intra-sujets, au cours des époques distinctes de la lumière »sur» contre «off» ^5. Compartiments de la note, appareils de comportement qui contiennent des portes, fermées ou d'autres obstacles peuvent être modifiées pour permettre le passage de fibres captifs.

Le stratégies d'attache permis si décritstimulation multanée de souris multiples à partir d'un seul laser. Haut débit tests comportementaux optogenetic peut donc être obtenue par l'utilisation de multiples lasers et l'équipement d'essai. Le nombre d'animaux qui peuvent être stimulés simultanément, cependant, sera limitée par la puissance lumineuse maximale qui peut être atteint à chaque extrémité de la fibre. Puissance de sortie maximale à la pointe de la fibre dépend de la 1) une puissance de démarrage du laser; 2) l'efficacité de couplage et 3) nombre de divisions de faisceau. Pour un laser bleu de 100 mW avec ~ 80% d'efficacité de couplage et jusqu'à quatre divisions de faisceau (comme illustré sur la figure 4C), puissance moyenne à la pointe de la fibre peut varier entre 5 à 10 mW lors de l'utilisation de 200 um base, 0,22 NA cordons de raccordement de fibre (nb se attendre à une perte de transmission de joints rotatifs pour être <15%). Sortie de mesure de la lumière à l'extrémité de la fibre est essentiel pour déterminer la puissance de la lumière suffisante pour l'activation de opsin que opsines diffèrent dans leur sensibilité à la lumière et donc la densité de puissance lumineuse (mW/ Mm ^{2) 11} nécessaire pour l'activation. Par exemple, l'étape consistant à fonction stable opsine (SSFO) agit comme un accumulateur de photons et nécessite donc très peu de densité de puissance lumineuse pour l'activation (<8 mW / mm ^{2) 8.} Comparez cela à la rhodopsine canal traditionnel (ChR2) qui nécessite un minimum de 1 mW / mm ² de la lumière pour obtenir des potentiels d'action ^2. Tableau 1 est fourni en référence rapide pour irradiances lumineuses minimales connues requises pour activer opsines les plus courantes actuellement en utiliser. Enfin, il faut considérer que les disperse la lumière et absorbe à mesure qu'il traverse les tissus du cerveau de telle sorte que plus de puissance lumineuse est nécessaire pour les structures cérébrales profondes ^3. Une ressource en ligne utile est disponible à http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php qui va calculer l'intensité de la lumière à différentes profondeurs à travers les tissus du cerveau en tenanttenir compte de la taille de coeur de la fibre, ouverture numérique, longueur d'onde de la lumière utilisée, et la puissance de la lumière à partir de la pointe de la fibre. Pour un excellent aperçu des principes théoriques qui sous-tendent ces calculs, voir Foutz et al. (2012) ^12. Des exemples de la façon d'appliquer ces principes et les calculs à la conception expérimentale sont démontrés dans Aravanis et al. (2007) ³ et Tye et al. (2012) ^13. L'exécution de ces calculs avant le début d'une expérience est cruciale pour assurer le rayonnement de la lumière suffisante pour l'activation de l'opsine. Compte tenu de ces considérations, il est avantageux d'acheter des lasers de forte puissance pour assurer la puissance de sortie adéquate. Lasers avec une puissance de 100 à 200 mW sont généralement suffisantes pour compenser les petites fibres de l'âme, multiples fractionnement de fibres, couplage inefficacité et la transmission perd ^7. Si l'aide de lasers de forte puissance, cependant, des précautions doivent être prises pour éviter les dommages neuronaux ou de la chaleur et de la lumière-associéartefacts d qui peuvent survenir avec prolongée et / ou de haute puissance éclairage en lumière ^sept. Une gamme sans danger pour les expériences in vivo est jusqu'à 75 mW / mm ^{2. 14}

Décider du type de laser à l'achat peut être une affaire compliquée car il ya beaucoup de facteurs à considérer. Par exemple, des lasers à diodes directes fournissent sortie pulsée plus stable et reproductible de faire l'état solide (DPSS) lasers pompés par diode, et sont plus fiables dans le temps dans un environnement de laboratoire. Dans certains cas, cependant, des lasers à diodes directes peut émettre une puissance lumineuse inférieure, ~ 0,1 mW, même lorsque la tension de commande V 0 est dû à un biais constant de courant étant envoyé à la diode par l'électronique de commande du laser. Cette émission «spontanée» a un spectre plus large que ne le fait émission laser de la même laser, donc peut être spécifiquement réduite par l'installation d'un passe-bande étroite (ou «nettoyage») filtre entre le laser et le coupleur (voir liste des pièces). Ce filtre sera égalementréduire la puissance de sortie de ~ 50% lorsque l'effet laser, donc acheter un laser de forte puissance en conséquence. Il convient de noter que les lasers DPSS jaunes sont extrêmement sensibles et peuvent se comporter de façon erratique et ont réduit la durée de vie si rapidement modulé par un générateur d'impulsions. Réglage de la puissance du laser jaune doit être fait par roues à filtres de densité externes placés sur le trajet du faisceau (section 1.7) pendant le fonctionnement du laser dans le mode TTL +. Alternativement, l'achat d'un vert 532 nm DPSS laser est une alternative rentable qui peut activer les deux halorhodopsins et archaerhodopsins.

L'ouverture numérique (NA) d'une fibre est important de tenir compte lors de la conception et l'achat de composants en fibre pour l'assemblage laser set-up. Le NA d'une fibre optique détermine les angles de rayons lumineux qui peuvent être acceptées et émis à la pointe d'une fibre. Si une fibre plus-NA est accouplé à une fibre inférieur NA, perte importante se produira à cette interface, il est donc important d'être compatible wi e NA fibres dans une seule configuration (ou de se assurer que NA augmente le long de la trajectoire de la lumière). L'effet des fibres NA sur le volume des tissus du cerveau illuminé est moins important, puisque le tissu du cerveau est très dispersait, et puisque la lumière couplée d'une source laser aura tendance à fibres high-na '' sous-remplissage; cependant fibres optiques avec une ouverture numérique de 0,22 et 0,37 sont couramment utilisés. De même, le couplage d'un plus grand-core à une fibre plus petit noyau sera également entraîner des pertes importantes, il faut donc toujours être sûr d'utiliser de plus en plus ou égales diamètres de base lors de la progression de la source laser à l'implant animale. D'une manière générale, les extrémités des fibres doivent toujours être plafonnés lorsqu'il ne est pas utilisé pour éviter la poussière et l'accumulation de particules. Ce est une bonne idée de régulièrement extrémités et connecteurs (70% d'alcool isopropylique fonctionne bien) pour assurer maximale puissance lumineuse de sortie, et de tester la puissance de sortie la lumière à travers un «implant factice» avant de commencer les expériences de chaque jour fibres propres.

"> Lors des tests de comportement, il est impératif que des mesures soient prises pour contrôler les effets de l'infection virale, l'expression de la protéine exogène, la lumière visible, et les effets et les artefacts de chauffage des tissus possibles sur le comportement animal. Par conséquent, le groupe de contrôle approprié devrait être composé d'animaux transduites avec un virus témoin (par exemple, GFP, EYFP, mCherry) qui reçoivent des paramètres de stimulation lumineuse identiques. La vérification expérimentale est une étape finale déterminant que les données de comportement utilisés pour l'analyse dépend entièrement de l'opsine appropriée et le placement de la fibre optique dans la région d'intérêt . En particulier, chez les animaux où aucun signal ne est détecté immunohistochimique, ou lorsque le signal de positionnement ou de la fibre ne est pas dans la région d'intérêt, les données alors que le comportement de l'animal doivent être retirés de l'expérience. En outre, il est essentiel de tester la production de lumière à la pointe de la fibre à la fois avant l'implantation chirurgicale et encore post-mortem pour assurer une alimentation adéquate de la lumière pour l'activation de l'opsine. Dans animals où de graves perte de lumière est produite par la fibre après l'expérimentation (> 30%) ^9, les données de cet animal doit être considéré pour l'enlèvement. Les critères de retrait devraient être établies a priori. Enfin, il faut considérer la fréquence des impulsions nécessaires pour moduler cuisson neural, qui dépendra de la structure du cerveau et des sous-types de neurones étant ciblé. Publié paramètres de stimulation lumineuse optogénétiques existent pour plusieurs sous-types de neurones, cependant, la capacité de moduler excitation nerveuse devrait être confirmée indépendamment par in vivo ou tranche de cerveau enregistrements électrophysiologiques.

Comme on devient habile avec l'utilisation du laser et la modification de laser set-ups, des combinaisons de différentes longueurs d'onde peuvent être attachés à des fibres multiples sur un seul animal ou livrés sur la même fibre pour optogénétique combinatoire ^8. Stimulation multi-longueur d'onde va devenir de plus en plus important, étant donné le développement rapide de décalage vers le rougeed channelrhodopsins ^8, l'ingénierie de opsines hyperpolarisants décalée vers le bleu ^15, l'utilisation de bistables opsines étape fonctions ^8,16,17, et la liste expansion générale de opsines avec les spectres d'activation distincte ^11. Cette expansion de la boîte à outils optogenetic permettra le contrôle sans précédent de plusieurs sous-types de neurones à la fois dans et entre les régions du cerveau pour déterminer leur rôle dans le gouvernement états comportementaux complexes.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Laser Set-up
100 mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability (quantity: 1)	Omicron	Luxx/Phoxx 473/488-100	Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display
100 mW 594nm DPSS laser (quantity: 1)	Colbolt	0594-04-01-0100-300	04-01 series yellow laser; sensitive to back reflection from fibers
200 mW 532 nm DPSS laser; 5% power stability (quantity: 1)	Shanghai Lasers	GL532T3-200	Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins
Non-contact style laser to multimode fiber coupler (quantity: 1)	OZ Optics	HPUC-23-400/700-M-20AC-11	For use with dual laser set-up; Specs: 33 mm OD for 400 - 700 nm; FC receptacle, f = 20 mm lens with post mount laser head adapter #11
Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 1)	Thorlabs	MB1213	For dual laser system
Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded (quantity: 1)	Thorlabs	MB1012	For single laser system
Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 2)	Thorlabs	MB4	For blue laser; dual laser system
Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped (quantity: 4)	Thorlabs	CL3
3/4" stainless post (quantity: 1)	Thorlabs	TR075
1" stainless post (quantity: 4)	Thorlabs	TR1
Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew (quantity: 2)	Thorlabs	PH1
Pedestal Base Adapter (quantity: 3)	Thorlabs	BE1
Small Clamping Fork (quantity: 3)	Thorlabs	CF1253
Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror (quantity: 3)	Thorlabs	KM100-E02
Neutral filter density wheel (quantity: 1)	Thorlabs	NDC-50C-2M
1" Longpass dichroic mirror 50% (quantity: 1)	Thorlabs	DMLP505
Kinematic mount for 1" optics (quantity: 1)	Thorlabs	KM100	For dichroic mirror
20-piece hex wrench kit with stand (quantity: 1)	Thorlabs	TC2
1/4"-20 cap screw and hardware kit (quantity: 1)	Thorlabs	HW-KIT2
Mounting base 1" x 2.3" x 3/8" (quantity: 1)	Thorlabs	BA1S
FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve (quantity: 2)	Thorlabs	ADAFCB1	Dual FC/PC L-bracket also available
Breadboard lifting handles (quantity: 3)	Thorlabs	BBH1
Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm (quantity: 1)	Thorlabs	FB450-10	For use with diode lasers that spontaneously emit
2. Laser Coupling
! Laser protective eyewear (quantity: 1 for every user at each wavelength)	Various		! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser
Fiber optic cable tester (quantity: 1)	Eclipse	902-186N
One-step fiber connector cleaner (quantity: 1)	Thorlabs	FBC1
Coupler patch cord (0.75 meter) (quantity: 1)	Thorlabs		0.75 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; for dual laser system
Coupler patch cord (0.5 meter) (quantity: 1)	Thorlabs		0.5 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors, multimode; for single laser system
Doric mini cube (quantity: 2)	DORIC	DMC_1x2_FC-2FC
Compact power and energy meter console (quantity: 1)	Thorlabs	PM100D	Digital 4" LCD
C-series slim power sensor 5 - 500 mW (quantity: 1)	Thorlabs	S130C	Multiple detectors types are available; check with vendor
3. In vivo Optogenetic Stimulation
Multimode fiber splitters (quantity: 2)	FONT Canada		Large core fiber optic 1 x 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized. Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available
Arbitrary waveform function generator (2 channel) (quantity: 1)	Rigol	DG1022	Can control up to 2 lasers at once
Fiber optic rotary joint (commutator) (quantity: 6 - 8)	DORIC*	FRJ_1X1_FC-FC	*Also available through Thorlabs and Prizmatix
Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) (quantity: 8)	DORIC	MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5	Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.
PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) (quantity: 1)	Precision fiber Products	SM-CS1140S1	Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end
Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) (quantity: 1)	Thorlabs	CAPF
Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves (quantity: 1)	Thorlabs	CAPF1
Thick-jacketed patch cords (custom order) (quantity: 4)	Thorlabs		200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering