설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

요약

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

초록

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

서문

Optogenetics 정상과 질병 관련 행동 상태를 구동하는 신경 회로 소자에 대한 검색 시스템 수준의 신경 과학 혁명을했다. 빛에 민감한 미생물 opsins ^{1 기능적으로} 포유 동물 세포에서 발현 될 수있는 발견은 높은 공간 및 시간 정밀도 ² 신경 활동의 전례없는 제어 할 빛을 사용하기위한 플랫폼을 제공했다. 신경 활동의 수기 전통적인 전기 생리 학적 또는 약리학 적 접근 방법과는 달리, optogenetics 이종 집단 내의 생리적으로 중요한 시간 척도에 (유전 식별 또는 투영 공간에 기초하여) 특정 세포 유형의 제어를 허용한다. 신경 광학 인터페이스의 이후의 도입은 동물 ⁽³⁾ 행동에 빛의 전달을위한 실용적인 도구를 제공했다. 이것은 인과를 테스트하기 위해 행동하고 깨어 설치류에서 정의 된 신경 회로의 실시간 변조 허용했다신경 및 정신 질환 ^4-6 관련 행동 상태의 지배 구조에서 이러한 신경 회로의 역할. Optogenetics 따라서, 두뇌 활동 및 동물 모델에서 행동 또는 생리 학적 측정 사이의 함수 관계를 조사하고 관심있는 실험실에 도입하기위한 강력한 도구를 나타냅니다.

optogenetic 실험을 성공적으로 설계 및 완성은 여러 단계 및 고려 사항 (그림 1 참조)이 포함됩니다. 현재 프로토콜의 목표는 깨어 행동하는 설치류에 optogenetic 자극을 수행하는 데 필요한 이론 및 실무 지식과 함께, 도구 및 구성 요소와 개인을 제공하는 것입니다. 현재, 미생물 옵신 채널을 활성화하는 데 사용되는 두 개의 주된 파장 범위가 있습니다 푸른 스펙트럼에서 (일반적으로 473 ㎚)과 녹색 - 노란색 스펙트럼 (일반적으로 532 또는 591 ㎚). 레이저, 발광 다이오드 (LED)는 모두 D에 광원으로 사용될 수있다뇌 조직에 특정 파장의 빛을 eliver. 쥐 생체 내 자극에 필요한 작은 코어 섬유에 결합 될 때 LED에 의해 방출 된 비 간섭 성 광은, 그러나, 광 어려운 효과적인 전송한다. 적절한 레이저 어셈블리에 결정하는 것은 매우 중요한 초기 단계이며 실험실에서 optogenetics의 사용 목적에 따라 달라집니다. 선불 결합 레이저와 듀얼 레이저 시스템 (그림 2 참조) : 현재의 프로토콜은 두 조립 및 사용의 용이성에 차이가 기본 구성에 대해 설명합니다. 제조업체에서 미리 결합되어 단일 레이저 시스템은 본질적으로 바로 갈 필요없이 셋업이 거의 도착하지만 최소한의 최종 사용자 정의의 단점이있다. 듀얼 레이저 시스템은 동일한 섬유 아래 두 개의 다른 파장의 전달을 가능하게한다. 상이한 파장을 활성화하는 데 사용될 수있다 이것은 distinc 억제 / 조합 optogenetics의 출현으로 점점 더 중요해질 것이다공간적으로 공동화되어 T 세포 유형. 이것은 또한 광전류가 시작 각각 ^{7, 8,} 파란색과 노란색 빛에 의해 종료 쌍 안정 단계 기능 opsins와 함께 사용하기위한 필수적이다. 사용자가 추가하거나 필요에 따라 빔 경로의 구성 요소 (예를 들면, 외부 셔터, 광 필터, 인라인 파워 미터)를 제거 할 수있는 듀얼 레이저 시스템은 또한 사용자 정의된다. 그것의 다양성에, 듀얼 레이저 설정은 optogenetics은 실험실에서 사용되는 계속 도구가 될 것입니다 경우에 권장합니다. 레이저의 커플 링은, 그러나, 도전을 제공 할 수 있고 그래서 빠르고 쉽고 안정적​​인 결합기구는이 프로토콜에 제공된다. 이 프로토콜의 광학 구성 요소를 조립 및 세부 200 μm의 코어 및 0.22의 개구 수 (NA)와 스텝 인덱스 멀티 모드 섬유에 최적화 된 패치 코드 및 구성 요소를 이용하여, 참고. 다른 핵심 크기와 NA 그러나 모든 구성 요소가 이상적으로 코어의 측면에서 일치해야합니다, 구입할 수 있습니다크기와 NA는 광섬유 연결 지점에서 빛 손실을 방지 할 수 있습니다. 대안 적으로, 광섬유 연결에서, 광은 코어 큰 크기에서 작은 전달할 수있다; 및 / 또는 저급 - NA의 추가 손실없이 높은 NA 섬유에 관한 것이다.

테 더링 전략은 높은 처리량 행동 테스트를위한 여러 마우스를 동시에 자극 수 있도록 제공된다. 제공된 프로토콜 행동 테스트에 대한 만성 이식 섬유의 사용을 가정하지만 단기 자극 프로토콜에 대해 변형 될 수있다. 동일한 캐 뉼러는 약물과 같은 위치에 광파이버의 선단을 전달하기 위해 사용될 수 있기 때문에, 급성 이식 섬유, 약리학 적으로 조작 optogenetic 자극을 조합하는데 유리하다. 섬유가 반복 삽입 및 제거와 연관된 조직 손상을 감소시키고 섬유의 일관된 배치 관점에서의 정확도를 증가 만성적 주입 된 섬유의 사용은, 그러나, 높은 다중 일 행동 테스트 추천조직 조명 ^3. 여기에 설명 된 테 더링 구성과 함께 사용하면 동작은 안정적으로 여러 날에 걸쳐 녹화 할 수 있습니다. 섬유 주입 후 실제로 신뢰할 광 투과가보고 된 적이 ⁹ 개월 만성 자극 및 행동 시험 패러다임은, 이론적으로, 여러 일 주에 걸쳐 수행 될 수 있도록. 하드웨어 구성 요소에 대한 추가 참고 사내 만들 수 있습니다 비용 효율적인 대안과 제품을 포함, 자신의 개인의 필요에 맞게됩니다 최고의 제품에 독자의 선택을 할 수 있도록 프로토콜에 추가되었습니다. 설치 및 구현시 유용 중요 팁도 제공됩니다.

프로토콜

! 주의 :이 프로토콜은 클래스 3B 레이저의 사용을 포함하고 따라야 할 적절한 훈련 및 안전 가이드 라인이 필요합니다. 레이저를 작동 할 때 안전 고글은 정렬 절차가 특히 높은 위험을 제시, 항상 착용해야합니다. 주어진 레이저에 대한 최대 감쇠를 제공 할 것 안경을 결정하기 위해 레이저 제공 업체에 문의하십시오. 가능한 경우, 기관의 레이저 안전 교육 과정에 등록. 적절한 안전 안경 및 교육을받지 않은 상태에서 레이저를 작동하지 마십시오.

1. 레이저 장비 셋업

적절한 경우, 제 1 단계는 각각 단일 또는 이중 레이저 시스템을 구별하기 위해 (A) 또는 (B)로 지정된다.

1. 연결하고 브레드 보드에 레이저를 고정합니다. 회로 기반의 포팅, 우수한 열 전도체 및 장시간 사용으로 레이저 내부 부품의 손상을 방지하기 위해 히트 싱크로서 작용한다.
2. (A) 미리 결합 라스 확보¼ ER-20 "캡 나사 및 와셔 (도 2a)를 이용하여 10"X 12 "브레드 (또는 필요에 따라)에 관한 것이다. 브레드 보드 구멍이 레이저 장착 구멍과 정렬되지 않는 경우, 밀가루 반죽에 레이저를 확보하기 위해 작은 '테이블 클램프'를 사용합니다.
3. 이 레이저가 사용되는 경우 (B)는 매우 상이한 빔 높이 (> ~ 1cm)가 레이저들 중 하나를위한 플랫폼을 만드는 작은 4 "X 6"밀가루 반죽 대를 사용한다. 도 2b에 도시 된 바와 같이 메인 큰 12 "X 18"로 상기 보드를 부착 브레드는 와셔 ¼-20 "캡 나사를 사용하고 캡 스크류 또는 테이블 클램프를 사용하여 더 작은 기판에 레이저를 첨부. 캡 나사 또는 가변 높이 테이블 클램프를 사용하여 브레드 보드에 직접 다른 레이저를 연결합니다.
   중요한 단계 : 밀가루 반죽, 나사, 광학 구성 요소 항목을 구입할 때 너무 일치 영국식 또는 미터법으로 구입할 수 있습니다; 이 프로토콜의 기본은 제국이다.
4. (A)커플러 두꺼운 외피 평면 쪼개짐 / 물리적 접촉 (FC / PC) 패치 코드 연결 (커플러 코드이라고도 함;도 3 참조)를 물리적으로 레이저 (도 2a)의 전면에 부착된다.
5. (B)를 사용하는 동안 풀림 어긋남 방지, 커플러 JB KWIK 또는 유사한 에폭시를 사용하여 포스트의 상단 사이의 관절을 에폭시, ¾ "포스트에 광 커플러 스레드. (브레드 보드 구멍은 항상 광학 부품, 포스트 홀더, 받침대 어댑터의 필요한 위치에 정렬되지 않으며, 포크를 클램핑하는 것은 장소에 커플러의 광 게시물을 확보하는 데 사용되는 등) 브레드 보드에 게시물을 부착합니다. 커플러의 뒷면에 두꺼운 재킷 패치 코드 (커플러 코드)를 연결합니다.
6. (B) 운동 학적 홀더에 청색 레이저의 첫 번째 스티어링 거울을 삽입하고, ¾ "광학 포스트를 사용하여 브레드 보드에 연결합니다. 기본 ADAP이 게시물을 부착터와 클램핑 포크. 클램핑 포크를 놓고 이색 거울을 향해 레이저를 조정하는 45 ° 각도 거울 청색 레이저의 바로 앞에 어셈블리를 게시합니다. 거친 정렬 가이드와 브레드 보드에 구멍의 격자 패턴을 사용합니다. 일단 대략 위치, (C를도 2B 참조) 브레드 보드에 클램핑 포크를 고정 ¼ "-20 캡 나사를 사용합니다.
7. (B) 운동 홀더에 다이크로 익 미러를 삽입하고 1 "광학 포스트에 연결하고 브레드 보드에 직접 고정합니다. 맨 왼쪽에 다이크로 익 미러를 놓고 블루 레이저 거울, 라인에. 푸른 빛이 먼저 거울을 반사하도록 45 ° 각도에서 다이크로 익 미러가 커플러에 반사 각도, 다음 (C를도 2B 참조) 게시물에 운동 홀더를 부착 나사를 조입니다.
8. (B) ¾ "광 게시물에 노란색 레이저에 대한 최초의 스티어링 거울을 부착합니다. OPTI를 부착기본 어댑터와 클램핑 포크 칼 게시 할 수 있습니다. 노란색 빛이 제 2 조향 거울을 향해 이동됩니다 있도록 45도 각도로 클램핑 포크와 옐로우 레이저와 각도 거울 앞에서 직접 포스트 앙상블을 배치합니다. "¼ -20 캡 나사와 와셔 장소에 클램핑 포크를 고정합니다.
9. (B) 1 "광학 게시물에 노란색 레이저의 제 2 조향 미러를 연결합니다. 각 제 1 미러로부터의 황색 광 빔이 이색 통해 커플러 (도 2C)로 반사되도록 거울과 같은. 브레드 보드에 직접 게시물을 안전하고 미러가 적절하게 각이 진 후 장착 나사를 조입니다. 미세 거울 조정은 이후 단계에서 키네마 틱 미러 마운트를 사용하여 제조한다.
10. (B) ¾ "광학 게시물에 감광 필터 휠을 장착하고 장착베이스에 부착 된 게시물 홀더에 게시물을 놓습니다. 제 자체의 브레드 보드에 앙상블 보안하나의 ¼ "-20 캡 나사를 사용하여 콘드 노란색 거울. 이 휠은 커플러 도달 황색 레이저 광의 전력을 조정하는데 사용된다.
    팁 : 개별베이스를 연결하기 전에 (예 : 게시물의 상단에 운동 미러 홀더를 고정하고있는 나사 및 게시물의 하단에 기본 어댑터를 들고 스레드 등) 모든 구성 요소를 조입니다. 충분한 토크를 얻을 광 게시물의 제공을 통해 구멍에서 작은 육각 렌치의 샤프트를 사용합니다. 이 구성 요소가 재조정을 필요, 사용하는 동안 느슨해 방지 할 수 있습니다.
11. 브레드 보드에 FC / PC L 형 브라켓 어댑터 FC / PC를 연결합니다.
12. 옵션 : 두 개 이상의 동물의 동시 생체 자극에 대한 브레드 보드에 직접 1 × 2 50/50 미니 큐브 섬유 스플리터를 고정합니다. 또한, 핸들 (도 2A에서와 같이) 회로판 어셈블리의 이동을 돕기 위해 첨가 할 수있다.

2. 레이저 커플 링 (비 접촉 식 스타일의 커플 링)

이 섹션에서는 듀얼 레이저 설정 (그림 2B)에 관한 것이다. 외부 노란색 레이저 경로를 정렬하기 전에 내부 블루 ​​레이저 경로를 맞 춥니 다.

! 주의 : 눈의 안전을 보장하기 위해 낮은 조명 전원 커플 링 (1 ~ mW의)를 사용합니다. 레이저와 빛의 강도를 측정하고 안전한 것으로 간주 될 때까지 전원에 안전 고글을 착용 할 것.

1. 레이저의 뒷면에있는 스위치를 "문헌 [Curr"(현재) 및 트랜지스터 - 트랜지스터 로직 모드 (TTL) + 상수 조명 (아날로그 모드가 아닌). 드라이버의 전면의 전원 노브를 0으로 설정되어 있는지 확인합니다. 먼저 한 다음 드라이버의 레이저 키를 돌려 레이저를 켭니다.
2. 천천히 ~ 1 mW의 레이저 광이 방출 될 수 있도록 레이저 드라이버의 앞면에있는 전력을 조절 손잡이. 15 분 (또는 제조자에 의해 지정) 레이저 예열 - 10 기다립니다.
3. FRE 직접 광섬유 케이블을 연결 테스터전자 커플러 패치 코드의 끝과 케이블 테스터 (그림 3A)를 켭니다. 적색광 바로 위로 다이크로 익 미러의​​ 중심을 향해 이동되도록 커플러의 각도를 조정한다. 케이블 테스터로부터 방출 된 적색광 빔 경로는 들어오는 레이저 광이 상기 레이저에 결합되기 위해 수행 할 필요가 정확한 경로이다.
4. 거친 정렬을 수행 커플러에 레이저 빛의 빔을 조정하는기구 학적 거울에 횡 방향 및 수평 손잡이를 사용합니다. 받침대 클램프 약간 거울과 커플러의 위치를​​ 느슨하게 할 필요가 있습니다. 운동 마운트는 또 미세 조정 가능한 일부 여행을 가져야한다. 더 푸른 빛이 시간에 커플러 부착 된 패치 코드에서 방출중인 경우 걱정하지 마십시오.
5. 다이크로 익 및 커플러 사이에 직접 이색 거울 앞에 반투명 종이 한 조각을 놓습니다. 있을 것이다 파란색과 ar을 모두각각 레이저와 케이블 테스터에서이 논문에 에드 점. 충분한 용지의 같은 측면에서 동시에 빨간색과 파란색 등을 모두 볼 수 반투명 용지를 사용하십시오.
6. 첫 번째 스티어링 거울에 미세 조정 (즉, 레이저,하지 다이크로 익에 하나 더 가까이) 신중하게 파란 점과 빨간 점의 중심을 정렬하는 측면과 수평 노브를 조정하여.
7. 이 커플러 바로 앞에되도록 커플러를 향해 용지를 뒤로 이동하고 적색광과 레이저 빔을 정렬하는 제에 (즉, 이색 성)을 거울을 조정 손잡이.
8. (빨간색과 파란색 빔이 동일 선상 때까지, 즉) / 파란색, 노란색 및 빨간색 광선의 중심이 정확히 두 위치에 정렬 될 때까지 2.6 및 2.7 단계를 반복.
9. 커플러 코드에서 케이블 테스터를 제거합니다. 레이저 광은 이제 커플러 패치 코드의 단부로부터 방출한다.
10. Determi파워 미터를 이용하여 커플러 패치 코드의 섬유 선단으로부터 방출되는 광 파워를 측정함으로써 결합 효율 NE. 파워 미터의 포토 다이오드에 500 mW의 설정을 사용하여 사용중인 블루 (473 ㎚) 또는 레이저에 따라 노란색 (635 ㎚) 스펙트럼 빛 파장 설정 (λ)을 변경합니다.
11. 전원 독서를 얻기 위해 포토 다이오드에 수직 섬유 팁을 놓습니다. 섬유 단부로부터 출사 된 광 전력 결합기를 입력 광 파워를 비교한다. > 80 %의 결합 효율이 매우 좋은 것으로 간주됩니다. 제 2 조향 거울의 아주 작은 추가 조정은 때때로 약간 커플 링을 향상시킬 수 있습니다. 일반적으로, 섬유의 결합 단부에서 빔 패턴은 섬유 코어에 결합하는 효율 (그것을 둘러싼 고리 아니오) 작고 단단한 중앙 지점이있을 때 최적이다.
12. 반복 2.1 단계 - 옐로우 레이저의 두 스티어링 거울을 사용하는 것을 제외하고, 옐로우 레이저 커플 링 2.11 (그림 2C 참조). 수행 없음t는 다이크로 익 미러 또는 청색 레이저의 배향이 손실 위치 조정한다.

3. 생체 Optogenetic 자극

동물의 사용을 포함하는 모든 절차는 해당 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 지역 및 국가의 지침에 따라 수행되고 승인되어 있는지 확인합니다.

1. 광섬유 셋업 (패치 코드의 다른 타입의 식별도 3b를 참조한다)를 규정한다. 하나의 마우스를 자극 직접 브레드 보드에 부착 된 FC / FC L 형 브라켓 어댑터를 사용하여 두꺼운 재킷 패치 코드에 커플러 패치 코드를 연결하려면 (그림 4A 참조). 하나의 레이저에서 두 동물을 자극 1 × 2 50/50 미니 큐브를 사용하여 두 개의 두꺼운 재킷 패치 코드에 커플러 패치 코드를 연결하려면 (그림 4B 참조). 1 × 2m를 이용하여 다중 모드 광 스플리터 커플러 코드를 부착, 세 개 이상의 동물을 자극INI 큐브가 이미 브레드 보드에 부착 (그림 4C 참조).
2. 두꺼운 재킷 패치 코드 / 섬유 스플리터의 자유 단에 정류자 / 로터리 조인트를 연결합니다. 그들은 패치 코드에 토크의 축적을 방지 설치류의 움직임과 섬유의 회전을 허용하는 정류자가 필수적이다. 너무 많은 토크, 코드 트위스트 파손으로 이어질 및 테스트시 동물의 자연스러운 움직임을 방해 할 수 있습니다.
3. 정류자에 동물 패치 코드를 연결합니다.
4. 동물의 패치 코드 (그림 5)의 무료 금속 페룰 마지막에 연결 분할 슬리브를 연결합니다. 모든 길 페룰을 슬리브를 강요하지 마십시오 이 동물에 부착 된 이식 광섬유 (그림 6)에 연결 무엇으로 ~ 소매의 0.5 cm가 노출 될.
   중요한 단계는 : 항상 연결 중에 이식 섬유 페룰을 통해 소매의 확장을 할 수 있도록 분할을 포함 소매 구입제거. 임플란트에서 슬리브를 분리 할 때 임플란트가 두개골으로 제거 될 경우 적합 너무 꽉 동물에게 심각한 외상을 일으킬 수 있습니다. 이 발생하면, 동물 연구에서 제거하고 즉시 수의사의 치료를받을해야합니다. 마찬가지로, 처음으로 새로운 슬리브를 사용하기 전에, 밀봉하고 힘의 원하는 양 끊으면까지 페룰를 뽑아 '을 뚫고'.
   팁 : 단단히 페룰에 부착 된 슬리브를 제거하는 동안 그것은 섬유를 분해하기 쉽습니다. 이를 방지하기 위해, 슬리브 (표준 면봉의 핸들이 오른쪽 크기)의 개방 단에 작은 나무 막대를 삽입하여 페룰을 밀어 넣습니다.
5. BNC 케이블을 사용하여 펄스 발생기에 블루 레이저 드라이버를 연결하고 펄스 발생기를 켭니다.
6. 에 적절한 안전 고글을 넣습니다. 레이저에 "문헌 [Curr"와 "TTL +"모드의 뒷면에있는 스위치를 설정합니다. 반드시 그쪽을 확인운전자의 전면에 전원 노브가 0으로 설정 andturn에 레이저 (제 1의 드라이버 후 레이저 턴키) t된다.
7. 광 파워 미터를 이용하여 측정 한 경우 10mW 동물 패치 코드 섬유 팁으로부터 방출되는 - 5가되도록, 레이저의 전면에 전원을 조정 손잡이. 5-10 mW의 일반적인 가이드 라인은 인 - 조직의 주어진 부피에 Aravanis 등으로, 실험을 시작하기 전에 계산되어야 영향 필요한 정확한 전력 강도 ^3.
8. 생체 자극에 대한 청색 레이저에 "아날로그"모드로 전환합니다. 참고 : 노란색 DPSS 레이저가 일정하게 조명 TTL + 모드에서 작동된다. 레이저가 예열을 위해 10 ~ 15 분을 기다립니다.
9. 부드럽게 마우스를 억제하고 만성 이식 섬유 동물 패치 코드에 분할 슬리브를 연결합니다 (그림 6 참조). 두 섬유의 끝이 서로 신체적 접촉을해야합니다. 등의 접속 슬리브 스플릿을 사용창은 둘 사이의 직접 접촉을 시각화하는 것이 중요 단계 :. 때때로 파편이 동물의 이식 섬유의 금속 페룰에 수집 및 연결을 방해 할 수 있습니다. 이 경우, 부드럽게 부착하기 전에 동물의 머리에 페룰을 청소 닦아 에탄올을 사용합니다. 이 동물에게 심각한 외상을 일으킬 수 페룰을 통해 연결 슬리브를 강제하지 마십시오. 섬유 단부 사이의 물리적 연결이 청소 후 수없는 경우, 연구 동물을 제거한다.
   팁 : 광 누설은 주입 및 동물 섬유 패치 코드 사이의 연결 지점에서 발생할 수있다. 설치류에 의해이 빛의 시각화 실험 혼동 ^(10)를 제시 할 수있다. 열 수축 튜브는 패치 코드에 부착되어 외광을 최소화 접속점 위에 활주 할 수있다.
10. 마우스가 행동 테스트를 시작하기 전에 몇 분 동안 복구 할 수 있습니다.
    팁 : D처리가 스트레스를 유발하고 행동 테스트를 혼동 할 수있다 동물을 연결하는 데 필요한로, 3 일전 - 행동 테스트에 epending는 2 연결 및 테 더링 과정에 마우스를 습관화하는 것이 가장 좋습니다 투여한다.
11. 커넥터 코드가 차질이 없음을 보장하는 행동 시험 장치에 마우스를 놓습니다. 자극하는 동안 무인 동물을 두지 마십시오. 심지어 정류자를 이용하여, 패치 코드 장시간 동안 트위스트 않는 경향이 행동 시험을 방해 할 수있다.
12. 선택의 옵신을 활성화하는 소정의 주파수의 파란색 레이저를 펄스 펄스 발생기를 사용합니다. 노란색 레이저에 이용 : 외부 셔터하거나 불투명, 비 반사 불연성 오브젝트 빔 경로를 차단하여 황색 레이저 펄스.

4. 포스트 생체 자극 고려 사항

이 섹션은 완전한 프로토되는 것은 아니다COL하지만은 생체 optogenetic 자극 다음 고려되어야 추가 절차에 대한 지침을 제공으로 제공됩니다.

1. 실험이 완료되면, 행동 결과의 정확한 해석을위한 바이러스 및 섬유 배치 조직 학적을 확인합니다. 기관의 지침에 따라 동물을 안락사 빙냉 인산염 완충 식염수 (PBS)와 4 %의 PBS (w / v)의 파라 포름 알데하이드를 관류 동물.
2. 단단히 펜치 나 지혈제로 노출 된 금속 페룰을 잡고 이식 된 광섬유를 제거합니다. 하나 부드러운, 아직 빠른 움직임에 당깁니다. 각 실험의 끝에서 광 출력을 측정함으로써 주입 섬유의 무결성을 테스트하는 것이 중요하다.
3. 관심 영역을 통해 단면 전에 48 시간 - 최소 24 파라 포름 알데히드에 머리를 포스트 - 수정. (동결 박절기를 사용하는 경우, 단면 전에 몇 일 동안 30 % 자당 용액에서 머리를 품어). standa를 사용하여 면역 조직 화학 염색을 수행해당 옵신 태그가 형광 물질의 검출을위한 RD 프로토콜 즉, 녹색 형광 단백질 (GFP), 강화 된 노란색 형광 단백질 (EYFP) 또는 mCherry.
4. 현미경으로 옵신 발현과 섬유 임플란트의 위치를​​ 확인하고 시각적으로 선택한 좌표를 기반으로 바이러스 주입 및 임플란트의 적절한 배치를 확인합니다.

결과

생체 optogenetic 자극 행동 얻어진 결과는, 사용 동물 모델 및 변조 파라미터 타겟팅되는 신경 회로에 전적으로 의존한다. 티로신 히드 록 실라 제의 현재 예시적인 목적으로, 도파민 복측 피개 영역에서 신경 세포, 또는 VTA, 들어 :: Cre 호텔 생쥐 안정된 계단 함수 옵신 (SSFO) ⁽⁸⁾ 또는 제어 바이러스 (EYFP) 형질 도입하고 섬유 임플란트 만성적 되었습니까 이식. TH :: Cre 호텔 트랜스 제닉 마우스의 사용은 발현 VTA에서 TH + 세포 (도파민)로 제한된다 옵신. 7 여러 마우스의 동시 자극 전류 기재된 레이저 셋업을 사용하여 얻은 대표적인 행동 결과를 도시도 것을 보장한다. 여기서, 마우스 닿는 있었다 (도 4c에서와 같이 3 마우스 / 레이저) 별도의 레이저를 사용하여 동시에 자극 된 운동 동작을 1 시간 동안 기록 하였다. VTA 도파민 신경 세포의 반복 된 자극의 결과자극의 기간에 걸쳐 지속 활동적인 표현형. 전위의 거동에 변화 EYFP 생쥐에서 나타나지 않았다 (비디오 1 참조). 행동 시험 후, 면역 육안 확인 하였다 VTA 도파민 뉴런 섬유 배치 (도 7 참조) 바이러스 정확한 표적화를 검증하기 위해 수행 하였다.

생체 optogenetic 자극 그림 1. 실험 단계. 설계 및 생체 optogenetic 자극에 수행 할 때 관련된 네 가지 일반적인 단계가 있습니다. 이 프로토콜은 구체적으로 행동하는 쥐에서 뇌 심부 구조 레이저 광원으로부터 빛의 배달과 관련된 세부 단계 1) 레이저 시스템 및 광 커플 링 조립체를 포함한다; C 2) 테 더링 전략데이터 해석에 필수적인 단계 - 가이드 라인을 높은 처리량 행동 테스트를 위해 광원에 여러 동물을 onnecting 3)를 제공하는 것은 빛 전달을위한 타겟팅 전략을 확인합니다. 참고 :이 프로토콜은 테 더링을 위해 만성 이식 섬유 전용은 아니지만, 그것은 권장하고 행동 테스트를 optogenetic 자극을 결합 할 때 가정. 웅 & Arenkiel 2012 년 ¹⁸ 모두 스파르타 등. 참조, 자체 생산 및 만성 광섬유의 주입 2012 ^9. 실선 =이 프로토콜에 덮여 단계.

생체 optogenetic 자극에 사용되는 그림 2. 레이저 시스템. (A) 생체 자극에 대한 단일 레이저 시스템. 이 레이저는 산도입니다 ysically 제조자에 의해 사전 결합 거의 최종 사용자 설정을 필요로한다. (B) 이중 레이저 시스템. 두 레이저는 비접촉식 커플러 스타일로 각 빔 경로를 조정하는 역할을 거울의 사용을 통해 단일 ​​광섬유로 연결된다. 이 (B)에 도시 된 듀얼 레이저 시스템의 가장 다양한 설정의 광학 구성 요소를 제거하거나 필요하지만,보다 효율적인 레이저 커플 링의 관점에서 도전 선물로서 첨가 될 수있다. (C) 도식 레이저 및 거울의 지시 위치 인 해당 레이저 광 경로 (화살표)를 도시. 여기서, 상기 다이크로 익 미러 "D"는 커플러 "C"와 연결된 커플러 패치 코드에 황색 파장을 통해 송신하는 동안의 청색 파장 광을 편향하는 데 사용된다. B = 블루 레이저; C = 비접촉식으로 커플러; D = 이색 거울; FW = 필터 휠; M = 거울; Y는 노란색 레이저를 =.= "_ 빈"을 얻을>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 비 물리적 결합 프로토콜에 사용 3. (A) 케이블 테스터 아래 :. 케이블 테스터가 직접 패치 코드에 연결. 삽입 케이블 테스터의 연결 지점을 묘사한다 (B) 패치 코드 프로토콜에 걸쳐 언급 외부에서 내부로 :.. 평면 쪼개짐에 부착 된 화이트 지르코니아 분할 슬리브 블랙 재킷 동물 패치 코드 (FC) 끝, 다중 모드 광섬유 분배기, (또한 "커플러 코드"라고 함)의 두께 자켓 코드 패치. 두꺼운 재킷 패치 코드는 별도의 보호를위한 폴리 염화 비닐 (PVC) 튜브로 코팅되어있다. 이러한 케이블 들어, 표준 색 코드는 다른 종류의 섬유, 오렌지 = 다중 모드 광섬유를 구별하기 위해 사용된다. 동물 패치 코드는 얇은 행동 테스트하는 동안 동물 이동을위한 유연성을 허용하는 재킷. 케이블을 사용하지 않을 때 / PC가 종료 캡 FC에 배치되는 먼지를합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

(A) 하나의 동물, (B) 두 동물의 생체 내 optogenetic 자극 그림 4. 테 더링 전략; . (C) 서너 동물 가능한 구성은 위의 그림에 한정되지 않는다 - 여러 구성은 상업적으로 또는 사용자 정의 명령에 의해 사용할 수있는 어댑터, 섬유 스플리터 및 분기 패치 코드의 고유 한 조합을 통해 가능하다. 참고 : 패치 코드 및 섬유 스플리터가 양쪽 끝에 FC / PC 커넥터를 포함 (만 일단이 묘사되어있다).ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5. 분할 슬리브를 사용하여 이식 광섬유에 패치 코드의 정확하고 잘못된 (레드 x)를 연결. (왼쪽 패널) 분할 슬리브 지르코니아는 이식 광섬유 (여기에 표시된 동물에 부착되지 않음)의 페룰에 패치 코드를 연결하는 데 사용됩니다. 화살표는 패치 코드 및 이식 광섬유 간의 접속점 가리키는. 연결 슬리브의 분할을 통해 시각화 등의 차이가, 패치 코드 및 이식 광섬유 사이에 존재하는 (오른쪽 패널)과 비교. 부적절한 연결 (오른쪽 아래)에서 발생할 수있는 빛의 누설을합니다. U에 아래 삽입pper 왼쪽 패널이 사용 된 개별 구성 요소를 보여줍니다. 도리스 이식 광섬유 정맥, 흰색 지르코니아 분할 슬리브, 검은 재킷 동물 패치 코드의 평면 cleeve (FC) 끝 (그림 3b에 도시 전체 패치 코드) : 위쪽에서 삽입물의 맨 아래에. 모든 패널에서 연결 슬리브 패치 코드의 FC 끝이 플러시하지 있습니다. 남겨주세요 ~ 0.5 cm-에 매달 동물에 부착 된 이식 광섬유에 연결. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6. 사이드 (왼쪽)와 정면 패치 코드에 연결된 이식 된 광섬유와 마우스 (오른쪽)보기. 패치 코드 t의 적절한 연결을 시각화하는 데 도움이 연결 소매에 분할 사용이식 된 광섬유의 페룰 오. 연결 지점이 빨간색 점선 상자로 강조하고 또한 상부 삽입에 도시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

7. 대표 결과를 그림. (왼쪽) 생체 optogenetic 자극의 행동 판독. 기재된 레이저 셋업 및 테 더링 프로토콜을 사용하여 얻을 수있다 행동의 예. 어느 스텝 함수 옵신 (AAV5-DIO-SSFO-EYFP 형질 - 운동 활성은 복측 피개 영역 티로신 수산화 효소에 (VTA) (TH) :: Cre 호텔 마우스 (8 / 군 N = 7)의 optogenetic 자극시 기록 된 ) 또는 제어 바이러스 VTA에서 (AAV5-DIO-EYFP). 세 쥐 그룹은 동시에 하나에 닿는했다도 4c에 도시 된 447 또는 473 nm의 빛의 5 초 펄스 레이저로 자극으로는 15 분마다 한 번씩 전달. 양방향 반복 측정은 ANOVA는 optogenetic 자극 운동 활성을 증가함으로써 상당한 그룹 X 시간 상호 작용 (F _3,39 = 15.27, P <0.0001)과 시간의 중요한 주요 효과 (F _3,39 = 4.67, P = 0.007) 공개 만 (상대 페로 니 사후의 P <0.0001 = 0에서 t - 15 시간 함)를 SSFO 마우스에서 EYFP 마우스 (그룹의 주요 효과에 비해 운동 활성의 전반적인 증가의 결과 : F _1,39 = 10.69, P = 0.0061, t = 15에서 페로 니 사후의 P <0.01 - t에서 30, P <0.001 = 30-45 t는 = 45-60). 섬유 사양 : 200 μm의 핵심, 0.22 NA. 이전에 테 더링에 섬유 팁에서 방출되는 5 mW의 광 전력 바이러스 주사 부위에서 0.6 mm - 라이트 조도 = 6 - 0.1의 섬유 팁 거리에 해당하는 66 mW의 / mm ^2. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. EYFPSSFO 대 : ** P <0.01; *** p <0.001; 시간 효과 : ####의 P <0.0001 바이러스 및 광섬유 배치 (오른쪽) 조직 학적 확인.. 라이카 TCS SP5 주사 레이저 현미경에 취득한 공 초점 형광 이미지는 섬유 배치 (점선)과 생체 optogenetic 자극 다음 마우스 복측 피개 영역에서 바이러스 - 매개 발현 (녹색)를 시각화하는데 사용되었다. 도파민 뉴런 (TH +)는 파란색으로 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

생체 optogenetic 자극에서 비디오 1.. 과잉 행동은 TH :: Cre 호텔 생쥐에서 SSFO를 사용하여 VTA 자극하는 동안 이 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

표 1. 빛 irradiances는 일반적으로 사용되는 opsins를 활성화해야합니다.
옵신 변형	λ	전력 밀도 (/ mm 2)		등록
			/ 오프 동력학
광 여기 : 빨리 연기 channelrhodopsins
ChR2 2	(470)	(1) - 최대 5mW	1.21 / 12 밀리 초	40 Hz에서 최대 화재
ChETA (19)	(490)	5 mW의	0.86 / 8.5 밀리 초	200 Hz에서 최대 화재
최고 20	(450)	1.65 mW의	1.62 / 12 밀리 초	ChR2의 비 탈감작 형태
C1V (18)	540-630	8 mW의 (~ 540㎚)	(54)에서 34분의 5 밀리 초0 ㎚	레드 시프트
		3.2 mW의 (~ 630㎚)	67 밀리 초 (에)는 ~ 630㎚에서
광 여기 : 느린 작용 채널 rhodopsins
안정 단계 함수 옵신 (SFO) 8	590분의 470	8 μW (470nm에서)	20 밀리 초 / 29 분	새로운 SFO 변형; 더 이상 열린 상태. 590 nm의에 의해 폐쇄, 470 nm의에 의해 개설
광학 억제
eNpHR3.0 (21)	560-630	3-5 mW의	2.5 밀리 초는 / <10 밀리 초	일정한 빛을 30 분 22 지속적인 억제 *
ArchT3.0 (11), (23)	520-560	1-5 mW의	2 / <10 밀리 초	eNpHR3.0 <보다 큰 광전류에 더 민감/ TD>
이 테이블은 지침으로 만 제공된다; 신경 변조에 필​​요한 특정 빛 irradiances 독립적으로 확인해야합니다.
실험 검증은 옵신 대상으로 전략, 가벼운 자극 매개 변수가 의도 한 방식으로 5 신경 발사를 조절하는지 확인하는 것이 중요합니다.
전력 밀도 (MW / mm 2) 뇌 조직의 주어진 영역에 조명 빛의 힘을 의미하고, 섬유의 끝에서 방출되는 광 전력을 참조하지 않습니다.
* 항상 특히 장시간 빛 자극에, 가능한 최저 광도를 사용합니다.

표 1. 빛 irradiances는 일반적으로 사용되는 opsins를 활성화해야합니다.
약어
AAV는 아데노 - 관련 바이러스 =
DPSS = 다이오드 펌핑 고체 상태
EYFP = 강화 된 노란색 형광 단백질
FC / PC = 평면 쪼개짐 / 물리적 접촉
GFP = 녹색 형광 단백질
PBS = 인산염 완충 생리 식염수
PVC는 폴리 염화 비닐 =
mW의 = 밀리 와트
NA = 개구
SSFO 안정 단계 기능 옵신을 =
TH = 티로신 수산화
TTL = 트랜지스터 - 트랜지스터 논리
V = 전압
VTA = 복부 피개 영역

토론

현재의 기술 레이저 셋업 및 테 더링 전략은 설치류 행동 검사의 넓은 범위와 호환됩니다. 실제로, 행동 검사의 다양한 다음 사용 또는 첨부 된, 감정, 행동 작업, 행동 조절, 학습 및 메모리 패러다임, 수면, 각성, 그리고 욕구 적 작업을 포함하는 생체 optogenetic 자극이 몇 가지 이름 (Nieh 등의 알을 참조하십시오. ⁽⁶⁾ 종합적인 검토를 위해). Optogenetics 전통적인 행동 검사가 여러 일 연구에서 수행되는 방식은 지금 행동을 비교하는 하나의 세션으로 응축 될 수 변경, 대 '오프'에 '빛의 별개의 신 (新) 시대 동안,-주제 내 ^5. 참고로, 출입구 장치를 포함하는 행동이 폐쇄 구획 또는 다른 장애물이 닿는 섬유의 통로를 수용하기 위해 수정 될 필요가있다.

설명 테 더링 전략 허가시하나의 레이저에서 여러 마우스의 multaneous 자극. 고효율 optogenetic 행동 테스트 따라서 여러 레이저와 테스트 장비의 사용을 통해 달성 될 수있다. 동시 자극 될 수있는 동물의 수는, 그러나, 각각의 섬유 팁에서 달성 될 수있는 최대 광 전력에 의해 제한 될 것이다. 섬유 팁에서 최대 전력 출력은 레이저의 1)을 출발 전력에 의존한다; 2) 결합 효율과 빔 분할 3) 수. 200 μm의 코어, 0.22 NA 광섬유 패치 코드를 사용하는 경우 ~ 80 %의 커플 링 효율 및 (도 4c에 도시 된 바와 같이) 4 빔 스플릿, 섬유 팁에서 평균 전력을 100 mW의 청색 레이저 5-10 mW의 사이의 범위 일 수있다 (NB <15 %가 될 로터리 조인트에서의 전송 손실을 기대). opsins 따라서 광과 광 파워 밀도에 대한 그들의 감수성에서 상이 같이 섬유 팁에서 광 출력을 측정하면 mW의 (옵신 활성화에 적합한 광 파워를 결정하기위한 필수적인/ mm ²⁾ 활성화 ^11이 필요합니다. 예를 들어, 안정 단계 기능 옵신 (SSFO)는 광자 누적 역할을하기 때문에 활성화를위한 아주 작은 빛 전력 밀도 (<8 μW / mm ^2)가 필요합니다 ^(8). 활동 전위를 유도하는 빛의 1 mW의 / mm ^2의 최소 필요 전통적인 채널 로돕신 (ChR2)이 비교 ^2. 표 1은 현재 가장 일반적인 opsins를 활성화하는 데 필요한 알려진 최소한의 빛 irradiances에 대한 빠른 참조로 제공됩니다 사용합니다. 마지막으로, 하나는 빛의 산란을 고려하고 가벼운 힘이 깊은 뇌 구조 ^3에 필요한되도록 뇌 조직을 통해 이동으로 흡수해야합니다. 유용한 온라인 리소스에서 확인할 수있다 http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php 고려하여 뇌 조직을 통해 다양한 깊이에서 빛의 세기를 계산하는 것섬유 코어 크기, 개구 수, 사용 된 광의 파장, 및 섬유 팁에서 시작 광의 파워를 차지한다. 이러한 계산의 기초가되는 이론적 원칙의 훌륭한 개요, Foutz 등의 알을 참조하십시오. (2012) ^12. 실험 설계에 이러한 원칙과 계산을 적용하는 방법의 예 (2007) ^3. Aravanis 등 알에서 설명하고 TYE 외. (2012) ^13있다. 실험을 시작하기 전에 이러한 계산을 수행하면 옵신 활성화를위한 적절한 광 방사를 보장하기 위해 중요하다. 이러한 고려 사항을 고려할 때 적절한 전력 출력을 보장하기 위해 고전력 레이저를 구입하는 것이 유리하다. 100-200 mW의 사이에 출력되는 동력 레이저는 작은 코어 섬유, 다중 섬유 분할, 결합의 비 효율성을 보상하기에 충분하며, 일반적으로 변속기는 ⁷ 잃는다. 고출력 레이저를 사용하는 경우, 그러나, 치료는 신경 손상 또는 열과 빛 - 연관 않도록주의해야장기 및 / 또는 고출력 조명 조명 ^(7)에서 발생할 수있는 D 유물. 생체 실험에 대한 안전 범위는 75 mW의 / mm ^2에 달려있다. ⁽¹⁴⁾

구매에 레이저의 종류에 결정하는 것은 고려해야 할 여러 요인이 있기 때문에 복잡한 문제가 될 수 있습니다. 예를 들어, 직접 다이오드 레이저 다이오드 펌프 고체 (DPSS) 레이저를 수행하고, 실험실 환경에서 시간 경과에보다 신뢰성보다 더 안정하고 반복 펄스 출력을 제공한다. 그러나 어떤 경우에는, 직접 다이오드 레이저는 전압 지령 인해 레이저의 제어 전자 장치에 의해 다이오드로 전송되는 정전류 바이어스 0 V 인 경우에도, 낮은 광 전력 ~ 0.1 mW이었다 방출 할 수있다. 이 '자발'발광은 동일한 레이저로부터 레이저 발광을하는 것보다 더 넓은 스펙트럼을 가지며, 구체적으로 레이저 및 커플러 간의 협 대역 통과 (또는 '정리') 필터 (부품 목록 참조)를 설치함으로써 감소 될 수있다. 이 필터는 또한 것이다레이 징 할 때 50 % ~ 전력 출력을 줄일 수 있으므로 적절하게 높은 전원 레이저를 구입할 수 있습니다. 이것은 황색 DPSS 레이저는 매우 민감하며 오동작이있다 빠르게 펄스 발생기에 의해 변조 된 경우, 수명이 감소했음을 주목해야한다. 노란색 레이저 파워의 조정 TTL + 모드 레이저를 동작하면서 빔 경로 (섹션 1.7) 외부에 배치 밀도 필터 휠을 통해 수행되어야한다. 대안 적으로, 532 nm의 녹색 DPSS 레이저를 구매하는 것은 halorhodopsins 및 archaerhodopsins 모두 활성화 비용 효율적인 대안이다.

섬유의 개구 수 (NA)의 설계 및 레이저 어셈블리 셋업을위한 섬유 성분을 구매할 때 고려하는 것이 중요하다. 광섬유의 NA 허용 및 섬유의 선단에 출사시킬 수 광선의 각도를 결정한다. 높은 NA 섬유가 낮은 NA 섬유에 정합되는 경우, 상당한 손실이 그 계면에서 발생하므로 일관성 WI 것이 중요 단일 설치 내 일 섬유 NA는 (또는 NA 빛의 경로를 따라 증가 시킨다는 것을 보장하기 위해). 조명 된 뇌 조직의 체적에 대한 섬유 NA의 효과는 뇌 조직이기 때문에 고도의 산란과, 레이저 광원으로부터 결합 광에 '언더필'고 NA 섬유 경향이 있으므로, 덜 중요하다; 0.22과 0.37의 NA와 그러나 광학 섬유는 일반적으로 사용된다. 마찬가지로, 작은 코어 섬유에 더 큰 코어에서 커플 링도 상당한 손실이 발생할 때문에 항상 동물 임플란트 레이저 소스에서 진행 때 증가 또는 동일한 코어 직경을 사용해야합니다. 일반 메모에서 섬유 단부는 항상 사용하지 먼지 입자 축적을 방지하기 위해 캡핑시되어야한다. 그것은 좋은 생각이 정기적으로 청소 섬유 종료 및 커넥터 (70 % 이소 프로필 알코올이 잘 작동) 최대 광 출력을 보장하기 위해, 매일의 실험을 시작하기 전에 '더미 임플란트'를 통해 빛 출력을 테스트합니다.

"> 행동 테스트하는 동안이 단계는 바이러스 감염, 외래 단백질의 발현, 가시 광선, 및 동물의 행동에 가능한 티슈 가열 효과와 아티팩트의 효과를 제어하기 위해 수행되는 것이 중요하다. 따라서, 적절한 대조군 동물들로 구성되어야 제어 바이러스에 형질 도입 (예를 들면, GFP, EYFP, mCherry) 동일한 빛 자극 매개 변수를받을 수 있습니다. 실험 검증 분석을 위해 사용되는 행동 데이터와 같은 중요한 마지막 단계는 관심의 영역에서 적절한 옵신 및 광섬유 배치에 전적으로 의존하다 신호 또는 섬유의 배치가 관심 영역에 있지이다. 구체적으로는, 어떠한 면역 신호가 검출되지 않은 동물에서, 또는, 그 동물에 대한 다음 행동 데이터는 실험에서 제거되어야한다. 또한,이 광 출력을 테스트하는 것이 필수적이다 모두 수술 주입하고 다시 사후 전에 섬유 팁은 옵신 활성화를위한 적절한 빛 전력을 보장합니다. 애니 마에서심한 광 손실이 실험 후 광섬유를 통해 발생한 LS (> 30 %) ^(9)은, 그 동물 용 데이터 제거를 위해 고려되어야한다. 제거를위한 기준은 선험적으로 수립되어야한다. 마지막으로, 하나의 타겟이되는 뇌 신경 세포의 구조 및 서브 타입에 의존 할 것이다 신경 소성을 변조하는데 필요한 펄스 주파수를 고려한다. 발행일 optogenetic 광 자극 파라미터 그러나 신경 소성을 조절하는 능력은 독립적으로 생체 내 또는 뇌 슬라이스 전기 생리 학적 기록 내용을 확인해야 여러 신경 서브 타입에 대해 존재한다.

하나의 레이저 사용 및 레이저 셋업의 변형에 숙달됨에 따라, 서로 다른 파장의 조합은 하나의 동물에 여러 섬유에 닿는 또는 조합 optogenetics ⁸ 같은 섬유를 제공 할 수 있습니다. 다 파장 자극은 적색 - 시프트의 급속한 발전 주어진 점점 더 중요해질 것이다ED ⁸ channelrhodopsins, 블루 이동 과분극 opsins ^(15)의 엔지니어링, 쌍 안정 단계 기능 opsins ^8,16,17의 사용과 별개의 활성화 스펙트럼 ^(11)와 opsins의 일반적인 확장 목록입니다. optogenetic 도구 상자의이 확장 복잡한 행동 상태를 관리하는 자신의 역할을 결정하기 위해 내부와 뇌 영역에 걸쳐 모두 여러 신경 하위 유형의 전례없는 제어를 허용합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Laser Set-up
100 mW 473nm or 488nm Diode Laser System , <2% Stability (quantity: 1)	Omicron	Luxx/Phoxx 473/488-100	Optional accessory includes a remote control box with key switch and LED Display
100 mW 594nm DPSS laser (quantity: 1)	Colbolt	0594-04-01-0100-300	04-01 series yellow laser; sensitive to back reflection from fibers
200 mW 532 nm DPSS laser; 5% power stability (quantity: 1)	Shanghai Lasers	GL532T3-200	Cost-effective alternative to yellow DPSS laser for activation of halorhodopsins and archaerhodopsins
Non-contact style laser to multimode fiber coupler (quantity: 1)	OZ Optics	HPUC-23-400/700-M-20AC-11	For use with dual laser set-up; Specs: 33 mm OD for 400 - 700 nm; FC receptacle, f = 20 mm lens with post mount laser head adapter #11
Aluminum breadboard, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 1)	Thorlabs	MB1213	For dual laser system
Aluminum breadboard, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Threaded (quantity: 1)	Thorlabs	MB1012	For single laser system
Aluminum breadboard, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Threaded (quantity: 2)	Thorlabs	MB4	For blue laser; dual laser system
Compact variable height clamp, 1/4"-20 Tapped (quantity: 4)	Thorlabs	CL3
3/4" stainless post (quantity: 1)	Thorlabs	TR075
1" stainless post (quantity: 4)	Thorlabs	TR1
Post holder with spring-loaded hex-locking thumbscrew (quantity: 2)	Thorlabs	PH1
Pedestal Base Adapter (quantity: 3)	Thorlabs	BE1
Small Clamping Fork (quantity: 3)	Thorlabs	CF1253
Kinematic mount for 1" optics with visible laser quality mirror (quantity: 3)	Thorlabs	KM100-E02
Neutral filter density wheel (quantity: 1)	Thorlabs	NDC-50C-2M
1" Longpass dichroic mirror 50% (quantity: 1)	Thorlabs	DMLP505
Kinematic mount for 1" optics (quantity: 1)	Thorlabs	KM100	For dichroic mirror
20-piece hex wrench kit with stand (quantity: 1)	Thorlabs	TC2
1/4"-20 cap screw and hardware kit (quantity: 1)	Thorlabs	HW-KIT2
Mounting base 1" x 2.3" x 3/8" (quantity: 1)	Thorlabs	BA1S
FC/PC to FC/PC L-Bracket mating sleeve (quantity: 2)	Thorlabs	ADAFCB1	Dual FC/PC L-bracket also available
Breadboard lifting handles (quantity: 3)	Thorlabs	BBH1
Ø1" Bandpass Filter, CWL = 450 ± 2 nm, FWHM = 10 ± 2 nm (quantity: 1)	Thorlabs	FB450-10	For use with diode lasers that spontaneously emit
2. Laser Coupling
! Laser protective eyewear (quantity: 1 for every user at each wavelength)	Various		! Consult with laser provider to ensure proper selection of eyewear that will provide maximal light attenuation for the purchased laser
Fiber optic cable tester (quantity: 1)	Eclipse	902-186N
One-step fiber connector cleaner (quantity: 1)	Thorlabs	FBC1
Coupler patch cord (0.75 meter) (quantity: 1)	Thorlabs		0.75 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; for dual laser system
Coupler patch cord (0.5 meter) (quantity: 1)	Thorlabs		0.5 m 200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors, multimode; for single laser system
Doric mini cube (quantity: 2)	DORIC	DMC_1x2_FC-2FC
Compact power and energy meter console (quantity: 1)	Thorlabs	PM100D	Digital 4" LCD
C-series slim power sensor 5 - 500 mW (quantity: 1)	Thorlabs	S130C	Multiple detectors types are available; check with vendor
3. In vivo Optogenetic Stimulation
Multimode fiber splitters (quantity: 2)	FONT Canada		Large core fiber optic 1 x 2 splitter, 50/50 ratio, FC connectors, ruggedized. Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; cost-effective smaller core sizes available
Arbitrary waveform function generator (2 channel) (quantity: 1)	Rigol	DG1022	Can control up to 2 lasers at once
Fiber optic rotary joint (commutator) (quantity: 6 - 8)	DORIC*	FRJ_1X1_FC-FC	*Also available through Thorlabs and Prizmatix
Animal patch cords (Custom Mono Fiberoptic Cannula with 10mm ferrules, FC/PC connector) (quantity: 8)	DORIC	MFP_200/240/900-0.22_2m_FC-MF2.5	Length, core size and numerical aperture can be specified when ordering; alternatively, these can be made custom made in-house (see Sparta et al. 2012)9.
PFP ceramic split sleeve, 2.5mm ID, 11.40mm length (25/pkg) (quantity: 1)	Precision fiber Products	SM-CS1140S1	Used for attaching implanted fiber optic on animal to a light-delivering fiber patch cord with flat cleeve (FC) end
Clear dust caps for Ø2.5 mm ferrules (25/pkg) (quantity: 1)	Thorlabs	CAPF
Metal cap for FC/PC and FC/APC mating sleeves (quantity: 1)	Thorlabs	CAPF1
Thick-jacketed patch cords (custom order) (quantity: 4)	Thorlabs		200 μm core, 0.22 NA, FC/PC connectors multimode fibers; length, core size, and numerical aperture can be specified when ordering