JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

القائم على مضان الكالسيوم مقايسة تعبئة هنا وصف هو عكس الصيدلة نظام الفرز المتوسطة الإنتاجية للتعرف على تفعيل وظيفيا يجند (ق) من الأيتام G-البروتين يقترن مستقبلات (GPCRs).

Abstract

لأكثر من 20 عاما، وقد تم الصيدلة عكس استراتيجية بارزة لاكتشاف بروابط تفعيل اليتيم G-البروتين يقترن مستقبلات (GPCRs). بداية من فحص الصيدلة العكس هو استنساخ وترنسفكأيشن اللاحقة من النوع من الاختزال من الفائدة في نظام التعبير الخلوية. ثم يتم الطعن في مغاير أعرب مستقبلات مع مكتبة مجمع بروابط مرشح لتحديد يجند تفعيل مستقبلات (ق). يمكن تقييم تفعيل مستقبلات عن طريق قياس التغيرات في تركيز جزيئات ثاني مراسل رسول، مثل الكالسيوم أو المخيم. الكالسيوم مقايسة تعبئة القائم على مضان الموصوفة هنا هو استخداما المتوسطة الإنتاجية عكس الصيدلة الفحص. وأعرب النوع من الاختزال يتيم عابر في الإنسان الجنينية 293T الكلى (HEK293T) خلايا ومنحل Gα 16 بناء يشارك transfected. التالية يجند ملزمة، وتفعيل الوحيدات Gα 16 الحث على الافراج عن و الكالسيومROM الشبكة الإندوبلازمية. قبل الفحص يجند، يتم تحميل خلايا، معربا عن مستقبلات مع مؤشر الكالسيوم الفلورسنت، فلوو-4 acetoxymethyl. إشارة الفلورسنت من فلوو-4 لا يكاد يذكر في الخلايا تحت ظروف الراحة، ولكن يمكن تضخيمها أكثر من 100 أضعاف على التفاعل مع أيونات الكالسيوم التي تم إصدارها بعد تنشيط مستقبلات. لا تتطلب هذه التقنية وصف إنشاء تستغرق وقتا طويلا من خطوط الخلايا ستابلي والتي تتكامل في المادة الوراثية transfected في جينوم الخلية المضيفة. بدلا من ذلك، ترنسفكأيشن عابرة، مؤقتة توليد التعبير عن الجينات المستهدفة، غير كافية لتنفيذ الفحص الفحص. الإعداد يسمح المتوسطة الإنتاجية فحص مئات من المركبات. شارك في ترنسفكأيشن من منحل Gα 16، والتي لمعظم الأزواج GPCRs، بما يسمح للإشارات بين الخلايا مسار إعادة توجيهك نحو إطلاق سراح الكالسيوم، بغض النظر عن مسار الإشارات المحلية في ضبط الذاتيةبالجلسات. الخلايا HEK293T من السهل التعامل معها وأثبتت فعاليتها على مر السنين في مستقبلات المقايسات deorphanization. ومع ذلك، والتحسين للمقايسة لمستقبلات معينة قد تبقى ضرورية.

Introduction

G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) تشكل واحدة من أكبر والأكثر تنوعا بين جميع الأسر بروتينات سطح الخلية. وجودهم في الفقاريات واللافقاريات والنباتات، والخميرة، وسال لعابه العفن، وكذلك في البروتوزوا وأقرب مزدوج الطبقات المنتشة Metazoa يشير إلى أن GPCRs هي من بين أقدم الجزيئات مرتبطة مع نقل الإشارة 1. تشمل بروابط بهم تفعيل الطبيعية مجموعة متنوعة واسعة من المحفزات الخارجية بما في ذلك الببتيدات والأمينات الاحيائية، عطر، بروتينات سكرية، والفوتونات 2. على هذا النحو، وتشارك هذه الأنظمة إشارات مستقبلات يجند في مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات الفيزيولوجية. وظيفية واسعة الطيف يجعلها مناسبة بشكل مثالي لتطوير العقاقير العلاجية التي تغطي مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان. وتمثل نحو 50-60٪ من المخدرات الأهداف الحالية GPCRs 3،4. إلى جانب أهميتها الكبرى في صناعة الأدوية، GPCRs أيضا في دائرة الضوء لتطويرجيل جديد من المبيدات الحشرية أنواع محددة 5،6 والمبيدات بشكل عام. لأن بروابط الطبيعية لكثير من GPCRs لا تزال مجهولة، وتصنف على أنها GPCRs اليتيم. سوف deorphanization هذه المستقبلات تحسين فهم الأدوار الفسيولوجية في الكائنات الحية، ويمكن الكشف عن الأهداف المفترضة للتطبيقات دواء جديد 7.

منذ عهد الجيني، يتم تطبيق على نطاق واسع الاستراتيجية الصيدلة العكسي لdeorphanization من GPCRs 8. يعني النهج أن مستقبلات اليتيم يستخدم ك "هوك" إلى "سمكة خارج" يجند تفعيل لها من استخراج البيولوجية أو من مكتبة من المركبات الاصطناعية. ولذلك استنساخ النوع من الاختزال المصالح وtransfected في وقت لاحق في نظام التعبير الخلوية. في الأساليب الأكثر شيوعا، يتم تحديد تنشيط مستقبلات عن طريق قياس التغيرات في تركيز جزيئات ثاني رسول 9 . الرئيسية المقايسات فحص مستقبلات تعتمد على البروتينات الحساسة للإضاءة الحيوية الكالسيوم (على سبيل المثال، aequorin) 10 أو مؤشرات الكالسيوم الفلورسنت (على سبيل المثال، فلوو-4) 11. المقايسات القائم على مضان، والتي يتم تحميل خلايا، معربا عن مستقبلات مع مؤشر الكالسيوم الفلورسنت قبل الفحص يجند، لديها ميزة أنها تسمح الفرز الفائق الإنتاجية بسبب سهولة استخدامها، والوقت قصير القراءة، ومرونة الفرز مستقبلات اليتيم متعددة على لوحة واحدة 12.

هنا، يوصف بدقة فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان ويتضح من عملية deorphanization من ذبابة الفاكهة السوداء البطن قصيرة نيوروبيبتيدي F (SNPF) مستقبلات. وقد تميزت هذه neuropeptidergic نظام الإشارات في الأصل من قبل ميرتنز وآخرون. في عام 2002 13 مع تلألؤ بيولوجي مقايسة الكالسيوم أجريت في الهامستر الصينية المبيض (شو) الخلايا14 وفنغ وآخرون في عام 2003 مع مقايسة الكهربية باستخدام البويضات القيطم 15. يبدو وجود أنظمة الإنذار SNPF ان تقتصر على الأسرة في اللغات من المفصليات، حيث تورط في مجموعة واسعة من العمليات بما في ذلك تنظيم التغذية، والنمو، ردود فعل الإجهاد، وتحرك، وايقاعات كل يوم 16.

البحث على أنظمة إشارات neuropeptidergic في الحشرات قد لا يؤدي إلا إلى أهداف جديدة لتطوير المبيدات الحشرية، ولكن معرفة أدائها ويمكن أيضا استقراء نحو الكائنات الحية الأخرى تم العديد من أنظمة الإشارات عموما حفظا جيدا في جميع أنحاء تطور 17. في العقد الأخير، أحرز تقدم كبير في عملية deorphanization من GPCRs نيوروبيبتيدي الحشرات. على الرغم من هذه الجهود، تم يقابل عددا صغيرا فقط من المستقبلات ليجند بها وما شابه ذلك، والكثير من المعلومات عن تسلسلأصبح GPCRs اليتيم الجديدة المتاحة نتيجة لازدهار الجينوميات 18. توافر متوسطة / عالية الإنتاجية النهج الفرز، مثل الكالسيوم مقايسة تعبئة القائم على مضان أن ثبت أن تقنية تطبيقها على نطاق واسع 9،18، وبالتالي لا تقدر بثمن.

يتم تنفيذ فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان كما هو موضح هنا في الإنسان الجنينية و293T الكلى (HEK293T) خط الخلية ويستخدم المسبار الفلورسنت لتحديد التغييرات في تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا على تنشيط مستقبلات. لضمان التعبير عالية ومستويات ترجمة للمستقبلات، يتم إضافة تسلسل إجماع كوزاك 19 إلى 5 'نهاية تسلسل الترميز مستقبلات، والتي يتم استنساخ لاحقا في ناقلات التعبير (على سبيل المثال، pcDNA سلسلة ناقلات لخطوط خلايا الثدييات). كما أنه من الصعب التنبؤ الذاتية G البروتين من اقتران النوع من الاختزال اليتيم على أساس تسلسل المعلوماتوحدها، وجزيئات رسول الثانية (على سبيل المثال، الكالسيوم أو المخيم) التي يتم التضمين بعد تنشيط مستقبلات في كثير من الأحيان لا تزال مجهولة قبل تحديد يجند. للتحايل على هذه المشكلة، والبروتينات G منحل من عائلة G ف (على سبيل المثال، الفئران Gα 15 أو الإنسان Gα 16 [المستخدمة هنا]) أو البروتينات G خيالية (على سبيل المثال، Gα qi5) التي تتفاعل مع معظم GPCRs وتحفز اطلاق سراح الكالسيوم يمكن يشترك-أعرب 20،21،22. على الملزم ليجند لمستقبله، وتخضع لعملية تغيير النوع من الاختزال بتكوين الذي يؤدي إلى تفعيل مسارات محددة داخل الخلايا. وغوانوزين ثنائي فسفات (GDP) جزيء، ملزمة في ظل ظروف يستريح إلى الوحيدات Gα 16، وسوف تحل محلها ثلاثي الفوسفات غوانوزين (GTP) جزيء. هذا يثير التفكك من البروتين G heterotrimeric في Gα 16 و Gβγ الوحيدات. الوحيدات Gα 16 ينشط فسفوليباز C &# 946؛ (PLCβ)، والذي بدوره hydrolyzes في غشاء محدد فوسفتيدلينوستول bisphosphate (PIP 2) مما أدى إلى مادة ال diacylglycerol (DAG) وtrisphosphate اينوزيتول (IP 3). سوف IP 3 منتشرة في جميع أنحاء السيتوبلازم وينشط IP قنوات الكالسيوم التي تعتمد على 3 الموجودة في غشاء الشبكة الإندوبلازمية، الذي يحث على الإفراج عن الكالسيوم في السيتوبلازم.

الافراج الكالسيوم على تنشيط مستقبلات يحدث في غضون ثوان، ويمكن أن يتم الكشف عن طريق تحميل الخلايا قبل الفحص الفحص مع صبغة الكالسيوم الحساسة، مثل فلوو-4 acetoxymethyl (ص) 11. وAM استر المجموعة تمكن fluorophore لعبور غشاء الخلية والمشقوق قبالة عن طريق الاسترات حشوية مرة واحدة داخل الخلية. وبالتالي، يتم الكشف عنهم التهم السلبية للصبغة الفلورسنت، ومنعه من نشرها خارج الخلية والسماح لها أن تتفاعل مع أيونات الكالسيوم. إشارة فلوري سو فلوو-4 لا يكاد يذكر في الخلايا تحت ظروف الراحة التي تحتوي على تركيزات الكالسيوم فقط في نطاق nanomolar. ومع ذلك، عندما يتم تحريرها على تنشيط مستقبلات الكالسيوم، ويمكن الإشارة زيادة تركيز تابع لأكثر من 100 أضعاف، وضمان بموجبه نسبة كبيرة إشارة إلى الضوضاء. FLUO-4 المعروضات أيضا مجموعة ديناميكية كبيرة للإبلاغ [الكالسيوم] حول K د (الكالسيوم) من 345 نانومتر، مما يجعلها مناسبة لقياس التغيرات الفسيولوجية ذات الصلة الكالسيوم في مجموعة واسعة من الخلايا. إثارة فلوو-4 يحدث في 488 نانومتر، ويتم قياس الانبعاثات مضان في 525 نانومتر 11. Fluorimeters مثل قارئ لوحة التصوير مضان (FLIPR) 23، وNOVOstar، أو FlexStation (جهاز المحطة) هي 12 / نظم عالية الإنتاجية المتوسطة التي تسمح في وقت واحد بالإضافة إلى ذلك المجمع وكشف عن إشارة فلوو-4 على تنشيط مستقبلات لكل جيدا في لوحة الفحص. مقايسة تعبئة الكالسيوم وصفها هنا تعتمد على المحطة96 جهاز جيدا نظام صفيحة ميكروسكوبية.

يتم استخدام SoftMax برو البرمجيات (البرمجيات) لتشغيل جهاز المحطة وكذلك لتحليل البيانات. البرنامج يعرض على الفور النتائج على النحو الرسوم البيانية في شكل 96 جيدا. يمكن اختيار آبار متعددة في وقت واحد لمقارنة نتائج هذه الآبار على نفس الرسم البياني. يتم قياس وحدة الفلورسنت النسبي (RFU) القيم الآبار في كل عمود في وقت واحد لمدة دقيقتين، تبدأ قبل إضافة مركبات للآبار واستمرار بعد قياس إشارة الفلورسنت التالية تنشيط مستقبلات. عادة، اتجاه منحنى ناهض ينسجم مع خط الأساس حتى يتم إضافة مركب تفعيل إلى الخلايا، مما أدى إلى زيادة سريعة للإشارة الفلورسنت. ويرتبط ارتفاع الذروة مع تركيز ناهض النهائي في البئر. بعد الذروة، إشارة الفلورسنت يسقط ببطء نحو مستوى خط الأساس. القياسات RFU كاليفورنيان تحويلها إلى منحنيات التركيز والاستجابة لتحديد القيمة EC 50 (التركيز الفعال نصف القصوى) ليجند. بشكل عام، لا يقل عن ثلاث شاشات مستقلة، كل منها ثلاث نسخ طبق الأصل من سلسلة التركيز، ويجب أن يتم تنفيذ لإنشاء منحنى التركيز على الاستجابة موثوق بها.

فمن المستحسن لتشمل العديد من الضوابط الإيجابية والسلبية في التصميم التجريبي. أولا، عنصر تحكم ترنسفكأيشن، أي تنفيذ مستقبلات مع يجند المعروف، وينبغي اختبار. وهذا يسمح التحقق ما إذا كان وكيل ترنسفكأيشن التشغيلية. ينصح إدماج تجربة التحكم مع ناهض لمستقبلات الذاتية من خط الخلية والسيطرة السلبية (على سبيل المثال، غسل العازلة) أيضا لمراقبة صحة وسلامة الخلايا واستبعاد احتمال أن غسل العازلة كانت ملوثة أحد العوامل التي يمكن أن تثير لصناعة السيارات في fluoreاستجابة رائحة. منبهات استخداما هي الببتيد المستمدة من تنشيط مستقبلات الأنزيم البروتيني-1 (PAR 1)، الذي يعمل بمثابة PAR 1 ناهض انتقائية، أو كرباكول، والذي ينشط مستقبلات أستيل. وينبغي أيضا أن يتم اختبار الخلايا transfected مع متجه التعبير فارغة إلى استبعاد أن المركبات النشطة تتفاعل مع مستقبلات الخلية الذاتية. تعظيم الاستفادة من العديد من المعلمات موضح في البروتوكول أدناه قد تكون هناك حاجة لأنظمة إشارات مختلفة. ويصور شخصية التخطيطي القائم على مضان كاملة الكالسيوم مقايسة تعبئة في الشكل 1.

figure-introduction-9595
يتم إجراء قياسات الشكل 1. مخطط الشامل لفحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان. الآلي التعامل مع السائل ومضان في وقت واحد مع محطةقارئ صفيحة ميكروسكوبية الجهاز، مدفوعا البرمجيات. يحتوي الجهاز محطة ثلاثة أدراج: واحد للخلية لوحة، لوحة المركبة وطرف الرف. التحويلات pipettor في بناء المركبات من عمود واحد من لوحة مركب إلى العمود المقابلة من لوحة الخلية (الخطوة 1). كل بئر من لوحة الخلية تحتوي على أحادي الطبقة من الخلايا HEK293T التي تم التعاون مع transfected-النوع من الاختزال من الفائدة ومنحل Gα 16 الوحيدات. عندما ينشط مستقبلات مركب، يتم استبدال الناتج المحلي الإجمالي Gα 16 ملزمة من قبل GTP. الوحيدات Gα 16 تنأى في وقت لاحق من مجمع Gβγ وينشط فسفوليباز Cβ (PLCβ)، والذي بدوره hydrolyzes فوسفتيدلينوستول bisphosphate (PIP 2) مما أدى إلى مادة ال diacylglycerol (DAG) وtrisphosphate اينوزيتول (IP 3). IP 3 ينشط IP التي تعتمد على قنوات 3 الكالسيوم الموجودة في غشاء الشبكة الإندوبلازمية، الأمر الذي أدى إلى الإفراج عن كثافة الكالسيومس السيتوبلازم. تفاعل الكالسيوم مع فلوو-4 (التي يتم تحميلها على الخلايا قبل تفاقم إضافة) النتائج في إشارة الفلورسنت (الخطوة 2). البرنامج يعرض النتائج على النحو حدة الفلورسنت النسبي (RFU) القيم في وظيفة من الزمن، ومرتفعات الذروة ترتبط مع تركيز يجند بطريقة تعتمد على التركيز. ويمكن بعد ذلك تحويل هذه البيانات إلى منحنى التركيز والاستجابة لتحديد القيمة EC 50 من زوج يجند مستقبلات (الخطوة 3).

Protocol

ملاحظة: يجب أن تتم جميع الإجراءات التي تشارك فيها الخلايا في بيئة معقمة من خلال العمل في تدفق الصفحي.

1. صيانة الخط HEK293T الخليوي

  1. تنمو الخلايا HEK293T في T-75 قارورة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب.
  2. مرور الخلايا عندما يتم التوصل إلى التقاء 80٪. ملاحظة: هذه عادة ما تستغرق 3-4 أيام. الخلايا في الثقافة مستمرة تسمح 20-25 المقاطع التي يمكن استخدامها لفرزها.
    1. وضع الفوسفات مخزنة المالحة في Dulbecco و(PBS) بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم، PBS-التربسين ethylenediaminetetraacetic حامض (EDTA) (500 مل PBS تستكمل مع 10 مل التربسين-EDTA الحل و 4.5 مل 4٪ EDTA) والنمو المتوسطة (500 مل متوسطة النسر Dulbecco لتعديل و- ارتفاع نسبة الجلوكوز [DMEM] تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني [FBS] و 1 ملي البنسلين الستربتوميسين [PS]) في درجة حرارة الغرفة لمدة نصف ساعة في وقت مبكر.
    2. نزعمتوسطة النمو القديمة من الخلايا. شطف الخلايا الميتة مع 3 مل PBS وإزالة PBS مرة أخرى.
    3. إضافة 3 مل PBS-التربسين EDTA-، واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة الحل ملاحظة: سوف مورفولوجيا الخلايا من تغيير لشكل المجال، على شكل نجمة.
    4. تخفيف الخلايا من الجزء السفلي من القارورة التي كتبها طيف التنصت وجمع الخلايا وذلك بدهن أسفل عدة مرات مع 10 مل من المتوسط ​​نمو جديدة.
    5. نقل 1 مل من خلية ثقافة جديدة إلى T-75 قارورة تحتوي على 14 مل متوسطة النمو الطازجة، واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب.

2. ترنسفكأيشن عابر من خلايا HEK293T

  1. تنمو الخلايا HEK293T في T-75 قارورة قبل 3 أيام مقايسة تعبئة الكالسيوم الفعلي تأخذ مكان. تأكد من استخدام ثلاثة T-75 قوارير، واحدة للترنسفكأيشن مع بناء مستقبل، واحدة للترنسفكأيشن مع ناقلات فارغة التعبير، ومراقبة سلبية، وسشمال شرق لمراقبة ترنسفكأيشن. ملاحظة: يتم تنفيذ الركض الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.2. عندما يكون لديك عدة لوحات 96 جيدا ليتم عرضه، T-150 القوارير يمكن استخدامها للحصول على عائدات أعلى من الخلايا (للقيام بذلك، انقر نقرا جميع الكميات المذكورة في خطوات 1.2.5، 2.3، 3.1.3 و3.1.4) .
  2. احتضان القوارير في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب لل20-24 ساعة حتى مزارع الخلايا الاقتراب 50-70٪ التقاء.
  3. شارك بالنقل السكان واحدة من الخلايا مع ناقلات التعبير ترميز النوع من الاختزال من الفائدة وبناء Gα 16، القارورة الثانية مع ناقلات الفارغة وبناء Gα 16، والثالثة مع السيطرة ترنسفكأيشن وبناء Gα 16. ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم استنساخ مستقبلات ذبابة الفاكهة SNPF في pcDNA3.1 الثدييات التعبير ناقلات 13. وقد استخدم JetPRIME لأداء ترنسفكأيشن، ولكن الكواشف ترنسفكأيشن أخرى يمكن استخدامها كذلك.
    1. إضافة إلىOTAL من 7.8 ميكروغرام الحمض النووي (3.9 ميكروغرام مستقبلات بناء أو ناقلات الفارغة، و 3.9 ميكروغرام Gα 16 بناء التعبير) إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وإضافة 500 ميكرولتر من العازلة JetPRIME. مزيج جيد من قبل vortexing الأنبوب، وتدور باستمرار قريبا.
    2. إضافة 37.5 ميكرولتر من كاشف JetPRIME، دوامة وتدور باستمرار لمدة 1 دقيقة في 14،000 ز س. احتضان دقيقة ترنسفكأيشن مزيج 10 في درجة حرارة الغرفة.
    3. إضافة قطرة قطرة مزيج ترنسفكأيشن إلى مستنبت الخلايا والتأكد من ماصة مباشرة في المتوسطة وتجنب الاتصال مع جدران القارورة الثقافة. احتضان القوارير في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب لل20-24 ساعة.

3. تعبئة الكالسيوم الفحص

  1. جمع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل والبذور لهم في، لوحات 96 جيدا الأسود الجدران واضحة من الأسفل.
    1. وضع برنامج تلفزيوني، PBS-التربسين EDTA-ونقل المتوسطة DMEM (500 مل DMEM تستكمل مع FBS 10٪ مدالو1٪ PS) في درجة حرارة الغرفة نصف ساعة مقدما.
    2. معطف ال 96 جيدا السوداء الجدران، لوحات القاع واضحة مع 60 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع فبرونيكتين (0.0025٪) لكل بئر (5.85 مل PBS و 150 ميكرولتر فبرونيكتين [0.1٪] في لوحة). احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع غطاء على. إزالة الحل من الآبار واحتضان لوحات مرة أخرى لمدة 1 ساعة بدون غطاء على درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك، فإنه من الممكن استخدام لوحات ما قبل المغلفة لتعزيز مرفق الخلية.
    3. خلع المتوسطة النمو القديم من الخلايا وشطف الخلايا الميتة قبالة مع 3 مل PBS وإزالة برنامج تلفزيوني.
    4. إضافة 3 مل PBS-التربسين EDTA-، واحتضان لمدة 1 دقيقة، ثم إزالة الحل. ملاحظة: مورفولوجيا الخلايا من التغييرات على شكل نجمة على شكل المجال ل.
    5. تخفيف الخلايا من الجزء السفلي من القارورة التي كتبها طيف التنصت وجمع لهم من قبل الشطف عدة مرات مع 10 مل من DMEM نقل متوسطة. نقل الخلايا في أنبوب فالكون 50 مل.
    6. عدعدد الخلايا لكل مل (يؤديها مع NucleoCounter هنا، ولكن الغرفة لBurker هو مقبول). إضافة 100 ميكرولتر من ثقافة الخلية في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 100 ميكرولتر العازلة تحلل والمزيج من خلال الاستفادة من أنبوب. إضافة 100 ميكرولتر العازلة واستقرار مزيج من قبل التنصت.
    7. ملء NucleoCassette مع تعليق خلية وعدد الخلايا مع العداد. مضاعفة عدد الخلايا على ثلاثة، حيث كانت مخففة الخلايا بمعامل ثلاثة عند إضافة تحلل واستقرار عازلة في الخطوة 3.1.6.
    8. تمييع الخلايا إلى تركيز النهائي من 600،000 خلية / مل والبذور 150 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر في لوحات المغلفة للحصول على كثافة خلية من خلايا حوالي 90،000 في / جيد. تجنب فقاعات الهواء والاستفادة من لوحة لنشر الخلايا بالتساوي من أجل الحصول على طبقة الخلايا متجاورة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة مرطب لل16-24 ساعة.
  2. تحميل الخلايا مع صبغة الفلورسنت وإعداد المشتركلوحة mpound.
    1. إعداد محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) / HEPES / كا 2 + / ألبومين المصل البقري (BSA) المخزن المؤقت: إضافة 165 ميكرولتر و CaCl 2 محلول المخزون (1 M و CaCl 2 في الماء المقطر [DH 2 O] - تخزينها في درجة حرارة الغرفة)، محلول المخزون 500 HEPES ميكرولتر (1 M HEPES في DH 2 O، ودرجة الحموضة 7.4 - تخزينها في درجة حرارة الغرفة)، و 0.05 غرام BSA إلى 50 مل HBSS. ملاحظة يتم استخدام الأحماض الدهنية الحرة BSA لفحوصات الكالسيوم، كما يمكن أن الأحماض الدهنية تنشيط مستقبلات محددة، عرقلة إشارة الكالسيوم من مستقبلات المصالح.
    2. إعداد الحل البروبينسيد (100X، 250 ملم): حل ز 0.71 البروبينسيد في 5 مل هيدروكسيد الصوديوم (1 M) وإضافة 50 ميكرولتر HEPES محلول المخزون و 5 مل من HBSS / HEPES / كا 2 + / BSA العازلة - دائما إعداد حل الطازجة. ملاحظة: يمنع نقل أنيون بالبروبنيسيد غير العضوية التي يمكن طرد فلوو-4 من السيتوبلازم، مما يقلل من إشارة الفلورسنت. فمن المستحسن لإجراء التحميل الصبغة فيوجود وعدم وجود البروبينسيد لتحديد ما إذا كان نقل أنيون غير العضوية يمثل مشكلة محتملة في خطوط خلية معينة قيد التحقيق، كما البروبينسيد بل قد تقلل من إشارة بوساطة ناهض.
    3. إعداد غسل العازلة: إضافة 500 ميكرولتر حل البروبينسيد إلى 50 مل HBSS / HEPES / كا 2 + / BSA العازلة، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 والترشيح حل العازلة. إعداد دائما العازلة الطازجة، و 50 مل العازلة لكل مطلوب لوحة.
    4. إعداد 10٪ من محلول حمض بلورونيك: مزيج 50 ميكرولتر حمض بلورونيك (20٪ ث / ت في ثنائي ميثيل-سلفوكسيد [دمس]]) مع 50 ميكرولتر DMSO - في حالة حدوث التبلور، والحرارة إلى 37 درجة مئوية، وتعد دائما حل الطازجة.
    5. إعداد فلوو-04:00 الحل (1MM): إضافة 44 ميكرولتر حل 10٪ حمض بلورونيك إلى قارورة تحتوي على 50 ميكروغرام فلوو-4 صباحا ودوامة حتى يذوب تماما. تجنب التعرض للضوء لمنع تبييض من fluorophore.
    6. إعداد العازلة التحميل: إضافة 8.8 مل DMEM supplementeد مع 10 ملي HEPES و 2.5 ملي البروبينسيد (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى فلوو-04:00 حل (44 ميكرولتر) ودوامة. دائما استخدام عازلة جديدة.
    7. تجاهل المتوسطة من الخلايا، وغسل الخلايا مع 200 ميكرولتر PBS لكل بئر، وإزالة برنامج تلفزيوني.
    8. إضافة 55 ميكرولتر العازلة التحميل لكل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. التفاف لوحة في رقائق الألومنيوم لمنع التعرض للضوء لوحة.
    9. تأكد لتجف قبل المركبات الشاشة إذا تم حلها في المذيبات التي تضر (على سبيل المثال، أسيتونتريل) لنظام التعبير الخلوية.
    10. ذوبان الببتيدات في غسل العازلة في siliconized أنابيب microcentrifuge 1.5 مل. إعداد سلسلة التخفيف لإجراء تحليل تركيز الاستجابة وتحديد قيمة EC 50 ليجند. إضافة 70 ميكرولتر من يجند في المقابلة بئر من لوحة مجمع (لوحات 96 جيدا على شكل حرف V) وتشمل إيجابية (ناهض الذاتية) والسلبية الضوابط (غسل العازلة) على كل لوحة. ليس ه: إذا مركب لا يذوب في غسل العازلة، يمكن للمرء أن محاولة المذيبات الأخرى التي ليست مؤذية للخلايا قيد التحقيق، مثل الماء أو الحلول التي يستحلب وذوبان الزيوت والمواد غير القابلة للذوبان في الماء الأخرى (على سبيل المثال، Kolliphor EL) .
    11. قياس جميع العينات في ثلاث نسخ. نضع في اعتبارنا أن 50 ميكرولتر من يجند من لوحة المجمع سيتم نقلها إلى بئر مع 100 ميكرولتر من غسل العازلة لوحة الخلية أثناء الفحص، لذلك تحضير مركبات في 3x أخرى تركيز النهائي المنشود.
    12. تجاهل العازلة تحميل من لوحة الخلايا وإضافة 100 ميكرولتر غسل العازلة إلى كل بئر. احتضان لوحة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ومنع التعرض للضوء.
    13. تجاهل غسل العازلة من لوحة الخلايا وإضافة 100 ميكرولتر غسل العازلة جديدة إلى كل بئر.
    14. احتضان الخلايا لوحة، لوحة المركبة، ورف غيض (96 جيدا، نصائح ماصة جهاز المحطة) لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
عنوان "> 4. الفحص على محطة الأجهزة

  1. إنشاء وتحميل الملف المطلوب بروتوكول مع البرنامج وتفعيل وحدة التحكم في درجة الحرارة لغرفة القراءة. هنا، وقياس ردود الكالسيوم عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة صف واحد في وقت واحد مع 1.52 ثانية الفاصل الزمني بين القراءات المتتالية (قياس كاملة لوحة 96 جيدا يستغرق حوالي 25 دقيقة) في 525 نانومتر. تعيين الإثارة من فلوو-4-488 نانومتر، ونقل وحدة تخزين ما مجموعه 50 ميكرولتر من مركب إلى لوحة خلية، 18 ثانية بعد بدء القراءة، مع سرعة الاستغناء الغروب في 26 ميكرولتر / ثانية وعلى ارتفاع 135 ميكرولتر ماصة لل.
  2. وضع لوحة المركبة والخلية، ورف طرف في الأدراج المناسبة للجهاز المحطة.
  3. إجراء قراءة واحدة من لوحة الخلية في نفس الإثارة وانبعاث الطول الموجي في وضع نقطة النهاية قبل البدء في الشاشة الفعلية في وضع FLEX. ملاحظة: هذا القياس يعطي حدة مضان النسبي (RFU) القيم ويتيح الكشف عن التباين بين نحنLLS من لوحة. تعتبر القيم بين 20،000 و 40،000 أمرا مقبولا.
  4. بدء فحص وتحليل البيانات مع البرنامج.

النتائج

تم اختبار سلسلة تركيز تتراوح ما بين 50 ميكرومتر إلى 0.001 نانومتر لكل أربعة الببتيدات ذبابة الفاكهة SNPF (دروم-SNPF-1: AQRSPSLRLRFamide، دروم-SNPF-2: SPSLRLRFamide، دروم-SNPF-3: PQRLRWamide، دروم-SNPF-4: PMRLRWamide) على الخلايا التي تعبر عن HEK293T عابر مستقبلات ذبابة الفاكهة SNPF ومنحل Gα 16 الوحيدات. تم تفعيل GPCR جميع الببتيدات أربعة في تركيزات النهائي حتى 0.1 نانومتر، وكان تنشيط مستقبلات تعتمد على التركيز. يصور الشكل 2 الرسوم البيانية المقابلة إلى واحدة من ثلاث نسخ طبق الأصل من سلسلة تركيز دروم-SNPF-1. فإن السيطرة السلبية (غسل العازلة) لا تحفز على إشارة الفلورسنت، في حين أن السيطرة الايجابية (PAR 1 - 1 ميكرومتر) أثارت التنشيط القوي للمستقبلات الذاتية-1، مما أدى إلى إشارة الفلورسنت عالية (± 30،000 RFU) تنشيط الأنزيم البروتيني. تجدر الإشارة إلى أن انحراف منقد يشير منحنى نموذجي شذوذ. على سبيل المثال، الارتفاع المستمر للمنحنى دون العودة إلى خط الأساس قد تكون ذات صلة إلى إشارات بوساطة غير مستقبلات، مثل وجود ionophores الكالسيوم، أو طبقة ثنائية الدهن تعطلت مما تسبب تسرب الكالسيوم.

البرنامج يسمح بإدخال الصيغ لتحديد النسبة المئوية للتفعيل أو أخطاء القياسي من تركيزات مختلفة من بين آخرين. وتستخدم البيانات الناتجة لإنشاء منحنيات التركيز على الاستجابة الأولية لتقدير قيم EC 50، كما هو موضح لأربعة الببتيدات دروم-SNPF في الشكل 3. تتضمن منحنيات الشكل (3) أيضا بيانات لمراقبة سلبية حيث سلسلة تركيز تم اختبار الببتيدات دروم-SNPF على الخلايا HEK293T transfected مع لpcDNA3.1 ناقلات الفارغة. وتشير النتائج إلى أن إضافة الببتيدات لهذه الخلايا ليس لها أي تأثير على مستقبلات الذاتية، ولكن في الواقع أكتيفأكلت مستقبلات المصالح. ثم كرر فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان ثلاث مرات بشكل مستقل. على أساس منحنيات التركيز على الاستجابة الأولية من الشاشة الأولي، تم تكييفها على تركيزات اختبار لتغطية مجموعة ديناميكية من منحنى (الشكل 4). القيم EC50 من دروم-SNPF-1 (2.04 ± 1.48 نانومتر [فاصل الثقة 95٪])، دروم-SNPF-2 (5.89 ± 3.74 نانومتر)، دروم-SNPF-3 (5.55 ± 3.95 نانومتر) ودروم-SNPF- 4 (0.50 ± 1.01 نانومتر) متشابهة، مما يشير إلى أنها قوية على قدم المساواة لتنشيط مستقبلات.

figure-results-2402
الشكل 2. الرسومية الناتج من البرنامج استجابة مضان بوساطة مستقبلات من سلسلة التركيز. اثنا عشر تركيزات النهائي (تتراوح من 50 ميكرومتر إلى 0.001 نانومتر) سو تم اختبار الببتيد دروم-SNPF-1 على مستقبلات دروم-SNPF. وأعرب عن التنشيط في وحدة الفلورسنت النسبي (RFU) القيم. الرسم البياني العلوي يعطي نتائج أعلى التركيزات ستة والرسم البياني السفلي من أدنى ستة تجمعات. السيطرة الموجب (+) هو PAR 1 (1 ميكرومتر) والتحكم السالب (-) هو غسل العازلة.

figure-results-3097
الرقم 3. منحنيات التركيز على الاستجابة الأولية من الببتيدات ذبابة الفاكهة SNPF يحدده القائم على مضان واحد الكالسيوم فحص التعبئة. وتظهر منحنيات التركيز على الاستجابة لمستقبلات ذبابة الفاكهة SNPF أعرب عابر في الخلايا HEK293T لأربعة الببتيدات ذبابة الفاكهة SNPF باللون الأزرق. لضوابط السلبية (كما هو موضح باللون الأحمر)، تم اختبار الببتيدات على HEK293Tخلايا transfected مع لpcDNA3.1 ناقلات الفارغة. وتظهر الاستجابات الفلورسنت كما النسبي (٪) إلى أعلى قيمة (تفعيل 100٪). المنحنيات هي نتيجة تجربة واحدة التي تم قياس تركيز كل سلسلة من ثلاث نسخ. الأشرطة العمودية تمثل الأخطاء المعياري للمتوسط ​​(SEM)، والتي هي في بعض الأحيان أصغر من الرموز المستخدمة (في هذه الحالة، وصفت إلا رموز).

figure-results-4033
الشكل 4. منحنيات التركيز والاستجابة وEC 50 قيم الببتيدات ذبابة الفاكهة SNPF تحددها ثلاثة فحوصات تعبئة الكالسيوم القائم على مضان مستقلة المقابلة. منحنيات استجابة تركيز مستقبلات Drosopihla SNPF أعرب عابر في الخلايا HEK293T لأربعة الببتيدات ذبابة الفاكهة SNPF هي نتيجة ثلاثة لي المستقلةasurements تنفيذ كل في ثلاث نسخ (ن ≥ 9). وتظهر الاستجابات الفلورسنت كما النسبي (٪) إلى أعلى قيمة (تفعيل 100٪). العلامات النجمية تشير تركيزات التي ن ≤ 9. أشرطة الخطأ تشير وزارة شؤون المرأة، والتي هي في بعض الأحيان أصغر من الرموز المستخدمة (في هذه الحالة، وصفت إلا رموز). يتم عرض القيم EC 50 مع فواصل ثقة 95٪.

Discussion

تم تطبيق فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان بنجاح لتأكيد توصيف وظيفي للنظام ببتيدي المفعول إشارات ذبابة الفاكهة SNPF، التي كان يؤديها بالفعل ميرتنز وآخرون. مع فحص تلألؤ بيولوجي وفنغ وآخرون. مع مقايسة 13،15 الكهربية. قيم EC 50 تم الحصول عليها مع مقايسة مضان في الخلايا HEK293T حوالي 10 أضعاف أقل من تلك التي حصلنا عليها مع مقايسة تلألؤ بيولوجي يؤديها في الخلايا CHO (دروم-SNPF-1: FLUO = 2.04 نانومتر، ومي = 51 نانومتر؛ دروم-SNPF- 2: FLUO = 5.89 نانومتر، ومي = 42 نانومتر؛ دروم-SNPF-3: FLUO = 5.55 نانومتر، ومي = 31 نانومتر؛ دروم-SNPF-4: FLUO = 0.50 نانومتر، ومي = 75 نانومتر). هذه الاختلافات يمكن تفسيرها من خلال عدة عوامل، بما في ذلك حقيقة أن واحدا من أنظمة التعبير المستخدم قد يكون أكثر ملاءمة للتعبير الوظيفية للمستقبلات معينة، أو قابلة للطي من بعض المستقبلات يمكن أن تكون أقل كفاءة في جأنواع الخلايا ertain. قيم EC 50 من كل أربعة الببتيدات دروم-SNPF هي في حدود nanomolar عند اختباره على مستقبلات مع كل من مضان وفحص تلألؤ بيولوجي، ودعم عموما أهمية الفسيولوجية التي تفاعل مستقبلات الببتيد في الجسم الحي.

لاحظ عدم وجود رقابة ترنسفكأيشن مع مستقبلات لوالذي يعرف يجند تفعيل أدرج في الشاشة المعروضة هنا، وذلك لأن نظام الإشارات ذبابة الفاكهة SNPF عادة السيطرة ترنسفكأيشن في الاجهزة التجريبية. أدرجت سيطرة إيجابية مع يجند الذاتية للخلايا HEK293T (PAR 1) والسيطرة السلبية (غسل العازلة) في الشاشة. أظهرت نتائج PAR 1 أن الخلايا كانت في حالة جيدة. فإن السيطرة السلبية (غسل العازلة) لا تثير إشارة الفلورسنت، مما يدل على أن الوسط الذي تذوب الببتيدات كانت خالية من أي من الملوثات التي يمكن أن الوقود النووي المشعluence النتائج.

تم استخدام نظام الإشارات ذبابة الفاكهة SNPF تتميز سابقا هنا لشرح فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان. لهذا الغرض، تم اختبار سلسلة تركيز بروابط تفعيل على الفور. ومع ذلك، عندما يتم إحضارها على مستقبلات اليتيم إلى من overexpression في فحص فحص لاختبار مكتبة تحتوي على مئات من المركبات، فمن المستحسن أن الشاشة الأولى مع تركيزات عالية نسبيا النهائي للبروابط (على سبيل المثال، 10 أو 1 ميكرومتر). بعد الكشف عن مركب تفعيل، سلسلة التخفيف من هذا المركب يمكن فرزهم من أجل أن يؤلف منحنى التركيز والاستجابة وتحديد قيمة EC 50.

مرة واحدة يتم تحديد يجند تفعيل لمستقبلات، يمكن التحقيق إشارات مسار الخلايا مزيدا من التكيف مع البروتوكول. لا يمكن أن يؤديها الفحص كما هو موضح أعلاه، ولكن من دون التعاون transfecting مجموعة ^5 و 16 الوحيدات. عندما يتم قياس استجابة الكالسيوم، فهذا يعني أن الأزواج مع مستقبلات الذاتية Gα ف الوحيدات من نظام التعبير الخلوية. عندما لوحظ عدم وجود إشارة الفلورسنت، ويمكن تطبيق بروتوكولات لقياس التغيرات في تركيزات رسل ثانوية أخرى (على سبيل المثال، المخيم).

ويمكن أيضا أن تتم العلاقة بين الهيكل والنشاط (SAR) دراسات لتحديد تسلسل الأساسية الببتيد هو مطلوب لتنشيط مستقبلات. أولا، يتم تقييمها لتحديد تسلسل اقتطاع الحد الأدنى من تسلسل الأحماض الأمينية من الببتيد التي لا تزال قادرة على تنشيط مستقبلات. المقبل، ويمكن اختبار الببتيدات التي منهجي تم استبداله كل الأحماض الأمينية للحصول على بقايا ألانين. اختبار الاصطناعية سلسلة ألانين بدائل على مستقبلات يسمح لتحديد أهمية كل من الأحماض الأمينية لتنشيط مستقبلات 24،25.

على الرغم من استخدامه المتكرر وايفي ثبتcacy، فإنه لابد من التأكيد على أن مقايسة الموصوفة هنا قد تحتاج الى بعض التعديلات للحصول على نتائج أفضل لمستقبلات محددة من الفائدة. الوحيدات Gα 16 لديه ميزة أنه يربط معظم GPCRs، ولكن قد يكون لها أيضا تأثير سلبي على المهيمنة على المستقبلات التي التطور الطبيعي الزوجين عبر Gα ف 22. في هذه الحالة، قد يكون من المفيد لاختبار مجموعات مختلفة من البروتينات G خلال تعظيم الاستفادة من مقايسة الكالسيوم الرواية ومقارنة النتائج للGα مستقبلات مقترنة ف في غياب أو وجود Gα 16. ويمكن أيضا فحوصات البديلة التي تكون مستقلة من البروتين G التفاعل للكشف عن تنشيط مستقبلات أن يؤديها، مثل إزفاء من GFP المسمى arrestin، أو الكشف عن التغيرات في غشاء المحتملة (على سبيل المثال، من قبل FLIPR غشاء الفحص كيت المحتملة). إلى جانب فلوو-04:00 المستخدمة هنا، مجموعة واسعة من fluorophores الكالسيوم الحساسة الأخرى، مع كل الأطياف الخاصة وكيميائيخصائص القاعدة ومتاح. يمكن تحديد fluorophore الأنسب على أساس النوع من الاختزال، نوع من الخلايا وقارئ لوحة المتاحة، ولكن التحقق التجريبي هو ضروري. كميات من الحمض النووي transfected والحمض النووي / ترنسفكأيشن حاجة كاشف نسبة يتم تحديدها لكل مستقبلات ترنسفكأيشن تركيبة خط خلية كاشف. أخيرا، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن الخلايا في الثقافة مستمرة تسمح فقط 20-25 المقاطع التي يمكن استخدامها لإجراء فحوصات الفرز.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

والكتاب يعترف فلاندرز بحوث مؤسسة (FWO-VLAANDEREN، بلجيكا، G.0601.11) وجامعة لوفين الكاثوليكية البحوث في مؤسسة GOA/11/002. IB، TJ وLT الاستفادة من زمالة من FWO-VLAANDEREN.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HEK293T cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Trypsin-EDTA solution (0.25%)Sigma-AldrichT4049
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)MP Biomedicals195173
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose  (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
Penicillin-Streptomycin (P-S)Sigma-AldrichP4333
jetPRIMEPolyplus transfection114-01FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies)
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF0392
Fibronectin from human plasmaSigma-AldrichF0895
Reagent A100, Lysis bufferChemometec910-0003
Reagent B, Stabilizing bufferChemometec910-0002
CaCl2Sigma-AldrichC3881
HEPESSigma-AldrichH4034
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA4503
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt SolutionSigma-AldrichH8264
ProbenecidSigma-AldrichP8761
NaOH (1 M)Vel2781
Pluronic acidInvitrogenP-3000MP
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Fluo-4 AMInvitrogenF14201Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1, ... (Invitrogen)
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)Sigma-AldrichZ707503 and Z707554
FlexStation deviceMolecular DevicesNOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottomGreiner Bio-One655090Corning 96-well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates
NucleoCassetteChemometec941-0001
NucleoCounter NC-100Chemometec
Microcentrifuge tubes, siliconizedBioCisionBCS-2470
Polystyrene V-shaped 96-well platesGreiner Bio-One651101
96-Well, FlexStation pipette tipsMolecular Devices9000-0912
Soft Max Pro softwareMolecular Devices

References

  1. Bockaert, J., Pin, J. P. Molecular tinkering of G protein-coupled receptors an evolutionary success. EMBO J. 18 (7), 1723-1729 (1999).
  2. Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21 (1), 90-113 (2000).
  3. Drews, J. Drug discovery a historical perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).
  4. Marinissen, M. J., Gutkind, J. S. G-protein-coupled receptors and signaling networks emerging paradigms. Trends Pharmacol Sci. 22 (7), 368-376 (2001).
  5. Bendena, W. G. Neuropeptide physiology in insects. Adv Exp Med Biol. 692, 166-191 (2010).
  6. Van Hiel, M. . B., et al. Neuropeptide receptors as possible targets for development of insect pest control agents. Adv Exp Med Biol. 692, 211-226 (2010).
  7. Tang, X. . L., Wang, Y., Li, D. . L., Luo, J., Liu, M. . Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacol Sin. 33 (3), 363-371 (2012).
  8. Civelli, O., Reinscheid, R. K., Zhang, Y., Wang, Z., Fredriksson, R., Schiöth, H. B. G protein-coupled receptor deorphanizations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 127-146 (2013).
  9. Mertens, I., Vandingenen, A., Meeusen, T., De Loof, A., Schoofs, L. Postgenomic characterization of G-protein-coupled receptors. Pharmacogenomics. 5 (6), 657-672 (2004).
  10. Brough, S. J., Shah, P. Use of aequorin for G protein-coupled receptor hit identification and compound profiling. Methods Mol Biol. 552, 181-198 (2009).
  11. Gee, K. R., Brown, K. A., Chen, W. N. U., Bishop-Stewart, J., Gray, D., Johnson, I. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  12. Beets, I., Lindemans, M., Janssen, T., Verleyen, P. Deorphanizing G protein-coupled receptors by a calcium mobilization assay. Methods Mol Biol. 789, 377-391 (2011).
  13. Mertens, I., Meeusen, T., Huybrechts, R., De Loof, A., Schoofs, L. Characterization of the short neuropeptide F receptor from Drosophila melanogaster. Biochem Biophys Res Commun. 297 (5), 1140-1148 (2002).
  14. Lu, H. -. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors. J. Vis. Exp. (50), e2732 (2011).
  15. Feng, G., et al. Functional characterization of a neuropeptide F-like receptor from Drosophila melanogaster. Eur. J. Neurosci. 18 (2), 227-238 (2003).
  16. Nässel, D. R., Wegener, C. A comparative review of short and long neuropeptide F signaling in invertebrates any similarities to vertebrate neuropeptide Y signaling. Peptides. 32 (6), 1335-1355 (2011).
  17. Grimmelikhuijzen, C. J. P., Hauser, F. Mini-review The evolution of neuropeptide signaling. Regul Pept. 177, S6-S9 (2012).
  18. Caers, J., Verlinden, H., Zels, S., Vandersmissen, H. P., Vuerinckx, K., Schoofs, L. More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs an overview. Front Endocrinol (Lausanne. 3 (151), 1-30 (2012).
  19. Kozak, M. An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs). Nucleic Acids Res. 15 (20), 8125-8148 (1987).
  20. Offermanns, S., Simon, M. I. Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase. CJ Biol Chem. 270 (25), 15175-15180 (1995).
  21. Ral Conklin, B., et al. Carboxyl-terminal mutations of Gqα and Gsα that alter the fidelity of receptor activation. Mol Pharmacol. 50 (4), 885-890 (1996).
  22. Kostenis, E. Is Gα16 the optimal tool for fishing ligands of orphan G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 22 (11), 560-564 (2001).
  23. Robas, N. M., Fidock, M. D. Identification of orphan G protein-coupled receptor ligands using FLIPR assays. Methods Mol Biol. 306, 17-26 (2005).
  24. Caers, J., Peeters, L., Janssen, T., De Haes, W., Gäde, G., Schoofs, L. Structure-activity studies of Drosophila adipokinetic hormone (AKH) by a cellular expression system of dipteran AKH receptors. Gen Comp Endocrinol. 177 (3), 332-337 (2012).
  25. Peeters, L., et al. A pharmacological study of NLP-12 neuropeptide signaling in free-living and parasitic nematodes. Peptides. 34 (1), 82-87 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

89 G GPCR deorphanization HEK293T 4 FlexStation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved