Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

Özet

Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) fonksiyonel olarak aktive edici ligandın (ler) in belirlenmesi için, bir orta-throughput ters farmakoloji tarama sistemidir.

Özet

20 yılı aşkın için, ters farmakoloji yetim G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) 'in aktive ligandlarını bulmak için, önde gelen bir strateji olmuştur. Bir ters farmakoloji tahlilin başlangıcı bir hücre sentezleme sistemi içinde ilgi konusu bir GPCR klonlanması ve sonraki transfeksiyonudur. Heterolog ifade alıcısı daha sonra, reseptör-ligand aktive edici (ler) tanımlamak için aday ligand bileşiği kütüphanesi ile meydan. Reseptör aktivasyonu, cAMP gibi bir kalsiyum ya da ikinci haberci haberci moleküllerin konsantrasyonunda değişiklikler ölçülerek değerlendirilebilir. Burada açıklanan flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyonu tahlil sıklıkla kullanılan bir orta throughput farmakoloji tahlili tersidir. Yetim GPCR geçici olarak insan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücreleri olarak ifade edilmiştir ve bir karışık Gα ₁₆ konstrukt ile birlikte transfekte edilmiş olmasıdır. Ligand bağlama sonra, ₁₆ alt-biriminin Gα aktivasyonu kalsiyum f salınmasını uyarmaktadırendoplazmik retikulum rom. Önceki ligand tarama için, reseptör-eksprese eden hücreler, bir fluoresan kalsiyum göstergesi, Fluo-4 asetoksimetil ile yüklenir. Fluo-4 ve flüoresan sinyal istirahat durumunda hücrelerinde ihmal edilebilir, ancak reseptör aktivasyonuna sonra serbest kalsiyum iyonları ile etkileşimi üzerine bir 100-kat daha güçlendirilmiş olabilir. Tarif edilen teknik, genetik malzeme ile transfekte konakçı hücre genomuna entegre edildiği stabil olarak transfekte edilmiş hücre çizgilerinin zaman alıcı kuruluş gerektirmez. Bunun yerine, geçici transfeksiyon, hedef genin ekspresyonunu geçici olarak üreten, tarama tahlili gerçekleştirmek için yeterlidir. Kurulum bileşiklerin yüzlerce orta veri akışı taramasını sağlar. En GPCRs çiftler ne olursa olsun, endojen Sett nativ sinyal yolunun, hücre içi sinyal yolu kalsiyumun serbest yönlendirildiği sağlar karışık Gα _16, ko-transfeksiyonrinde. HEK293T hücrelerin kullanımı kolay olan ve reseptör deorphanization deneylerde yıllar boyunca etkinliğini kanıtlamıştır. Bununla birlikte, özel reseptör tahlilinin optimizasyonu gerekli kalabilir.

Giriş

G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) bütün hücre yüzeyi proteinleri arasında en büyük ve en çeşitli ailelerin birini oluşturmaktadır. Omurgalılarda Bunların varlığı, omurgasızlar, bitkiler, mayalar, ve balçık kalıp yanı sıra, Protozoa ve erken diploblastic in Hayvanların GPCR'ler sinyal transdüksiyonu ¹ ile bağlantılı en eski moleküller arasında olduğunu gösterir. Onların doğal aktifleştiren ligandlar peptidler, biyojenik aminler, koku maddeleri, glikoproteinler ve fotonlar ² dahil olmak üzere dış uyaranların geniş bir çeşitlilik içermektedir. Bu nedenle, bu reseptör-ligand sinyalleşme sistemlerinin fizyolojik süreçlerin bir çok çeşitli katılmaktadırlar. Geniş spektrumlu fonksiyonel insan hastalıklarının geniş bir kapak terapötik ilaçların geliştirilmesi için onları ideal uygun hale getirir. Mevcut ilaç hedefleri yaklaşık% 50-60 GPCRs ^3,4 ile temsil edilmektedir. Farmasötik endüstrisinde büyük önem taşımaktadır Bunun yanı sıra, bir GPCR'ler geliştirilmesi için spot da vardırGenel olarak türe özgü insektisit ^5,6 ve pestisitlerin yeni nesil. Birçok GPCRs doğal ligandları hala belirsiz olduğu için, yetim GPCRs olarak sınıflandırılır. Bu reseptörlerin deorphanization organizmalar kendi fizyolojik rollerinin anlaşılmasını sağlayacak ve yeni ilaç uygulamaları ⁷ için varsayılan hedefler ortaya çıkarmak olabilir.

Genomik döneminden itibaren, ters farmakoloji strateji geniş GPCRs ^8'in deorphanization için uygulanır. Bu yaklaşım, bir yetim reseptör "balık out 'için bir' kanca ', bir biyolojik ekstrakt ya da sentetik bileşikler bir kütüphane ile aktive ligand olarak kullanıldığı anlamına gelir. İlgilenilen GPCR nedenle klonlandı ve daha sonra, bir hücre sentezleme sistemi içinde transfekte edilir. En yaygın olarak kullanılan yöntemlerde, reseptör aktivasyonu ikinci haberci moleküllerin konsantrasyonunda değişiklikler ölçülerek belirlenir ⁹ . Ana reseptör tarama tahlilleri (örneğin, aequorin) ¹⁰ ya da floresan kalsiyum göstergeler (örneğin, Fluo-4) ¹¹ kalsiyum duyarlı biyolojik olarak ışık veren proteinler dayanır. Reseptör-eksprese eden hücreler önce ligand tarama için bir fluoresan kalsiyum göstergesi ile yüklenmiş olduğu floresan bazlı deneyler, bunlar nedeniyle kullanım, kısa zaman okuma kolaylığı için, yüksek ölçüde nüfus ayırımına imkan olanaklar ve tarama esnekliğe sahip tek bir plaka üzerinde birden fazla ¹² olan öksüz reseptörlerdir.

Burada, flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil iyice açıklanmıştır ve Drosophila melanogaster kısa nöropeptid F (SNPF) reseptörünün deorphanization işlemi ile görüntülenmiştir. Bu neuropeptidergic sinyalizasyon sistemi, ilk Mertens ve arkadaşları tarafından karakterize edildi. 2002 Çin hamsteri yumurtalık (CHO) hücreleri içinde gerçekleştirilen bir kalsiyum biyoışıldama tahlili ile ¹³¹⁴ ve Feng et al. 2003 kullanarak bir elektrofizyolojik deneyde ile Xenopus oositlerde ^15. SNPF sinyalizasyon sisteminin varlığı, besleme, büyüme, stres reaksiyonları, hareket ve sirkadyan ritim ¹⁶ düzenlenmesi işlemleri de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede karıştığı böcek olarak, bir filum ile sınırlı görünmektedir.

Böceklerde neuropeptidergic sinyalizasyon sistemleri üzerinde araştırma, ancak insektisit gelişimi için yeni hedeflere yol olmayabilir, ama bunların işleyişi bilgisi aynı zamanda birçok sinyal sistemleri genellikle iyi evrim ¹⁷ boyunca muhafaza edilmiştir diğer organizmalar karşı çıkarım olabilir. Son on yılda büyük ilerleme böcek nöropeptid GPCRs deorphanization sürecinde yapılmıştır. Bu çabalara rağmen, reseptörlerin sadece küçük sayıda komşu bir ligand eşleştirilir ve sekans bilgileri yükler için olanYeni öksüz GPCR'ler nedeniyle genomik ¹⁸ patlama için kullanılabilir hale gelmiştir. Yaygın olarak uygulanan bir tekniktir ^9,18 olduğu kanıtlanmıştır floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahliliyle gibi orta / yüksek verimli tarama yaklaşımların kullanılabilirliği, bu nedenle ölçülemez.

Burada tarif edildiği gibi floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil, insan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücre hattı içinde yapılır ve reseptör aktivasyonu üzerine hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri belirlemek için bir flüoresan probun kullanır. Yüksek ifade ve reseptörün için düzeyde olmasını sağlamak için bir Kozak konsensüs sekansı, ^19, daha sonra bir sentezleme vektörüne (memeli hücre çizgileri için, örneğin, pcDNA vektör serileri) klonlanır reseptör-kodlama dizisinin, 5 'ucuna eklenir. Bu sekans bilgileri göre yetim GPCR endojen G-protein bağlanmasını tahmin etmek zor olduğutek başına, reseptör aktivasyonundan sonra modüle edilir, ikinci haberci molekülleri (örn., kalsiyum veya cAMP) genellikle önce ligand tanımlama bilinmemektedir. Bu sorunu aşmak için, çoğu GPCRs ile etkileşim ve G _q ailesi (örneğin, kemirgen Gα ₁₅ veya [Burada kullanılan] insan Gα ₁₆₎ veya flimerik G proteinleri (örneğin, Gα _qi5) arasında gelenle G proteinleri kalsiyum salgılanmasını can ^20,21,22 birlikte ifade edilebilir. Kendi reseptörüne ligand bağlanması üzerine, GPCR özel hücre içi yolların aktivasyonuna yol açan yapısal bir değişiklik olur. Gα ₁₆ alt ünitesine istirahat durumunda bağlı guanosin difosfat (GDP) molekül, bir guanosin trifosfat (GTP) molekülü ile değiştirilecektir. Bu, ₁₆ ve Gα Gβγ alt birim içinde heterotrimeric G proteinin ayrışma kışkırtır. Gα ₁₆ alt-birimi, fosfolipaz C ve aktive# 946; Da zara bağlı diaçilgliserol sonuçlanan fosfatidilinositol bifosfat (PIP ₂₎ (DAG) ile inositol trifosfat (IP ₃₎ hidroliz (PLCβ). IP ₃ sitoplazma boyunca yayılmış ve sitoplazma içine kalsiyum salınmasını uyarmaktadır endoplazmik retikulum zarında mevcut IP ₃ bağımlı kalsiyum kanallarını aktive edecektir.

Reseptör aktivasyonu üzerine kalsiyum salma saniye içinde oluşur ve Fluo-4 asetoksimetil (AM) ¹¹ gibi, kalsiyuma duyarlı boya ile tarama deneyinde önce hücrelerin yüklenmesi ile tespit edilebilir. AM ester grubu, hücre zarı geçmeye flüorofor sağlayan ve bir kez hücre içi sitoplazmik esterazlar tarafından kesilir. Sonuç olarak, floresan boya eden eksi yükler tarafından hücre dışında difüzyon ve kalsiyum iyonları ile etkileşime izin engelleyen, maskesiz edilir. Flüoresan sinyal of Fluo-4 sadece nanomolar aralığında kalsiyum konsantrasyonlarını ihtiva eden bir dinlenme koşulları altında hücrelerde ihmal edilebilir düzeydedir. Kalsiyum reseptörü aktivasyon üzerine bırakıldığında, ancak, sinyal burada geniş bir sinyal-gürültü oranı sağlanması, daha bir 100-kat konsantrasyon-bağımlı artırabilir. Fluo-4, aynı zamanda geniş bir hücre aralığı içinde fizyolojik olarak ilgili kalsiyum değişiklikleri ölçmek için uygundur, 345 nM'lik bir _Kd (kalsiyum) yaklaşık [kalsiyum] raporlama için geniş bir dinamik aralığı sergiler. Fluo-4 uyarılma 488 nm'de meydana gelmektedir ve floresan emisyon 525 ^{nm, 11} ölçülür. Flüoresan görüntüleme plaka okuyucu (FLIPR) ^23, NovoStar veya FlexStation (istasyon cihazı) ¹² gibi Fluorimeters her iyi eş zamanlı bileşik ilave edilmesini ve reseptör aktivasyonu üzerine Fluo-4 sinyalin algılanmasına izin orta / yüksek verimli sistemlerdir bir deney plakasında. Burada anlatılan kalsiyum mobilizasyon deney istasyonunda dayanırCihaz, 96 oyuklu mikro-plaka sistemi.

SoftMax Pro yazılımı (software) veri analizi için hem de istasyon cihazı çalıştırmak için kullanılır. Program hemen 96 kuyulu formatta grafik olarak sonuçları görüntüler. Çoklu kuyular aynı grafik üzerinde bu kuyuların sonucunu karşılaştırmak için aynı anda seçilebilir. Her sütunda kuyu nispi floresan ünitesi (RFU) değerleri aynı anda kuyulara bileşiklerinin ilave edilmesinden önce başlayan ve reseptör aktivasyonu sonra flüoresan sinyal ölçümü sonra devam eden, iki dakikalık bir süre boyunca ölçülür. Bir aktive bileşik floresan sinyalinin hızlı bir artış ile sonuçlanan, hücrelere ilave kadar Tipik olarak bir agonist eğrinin eğilim taban aynı hizadadır. Tepe yükseklik çukurdaki nihai agonist konsantrasyonu ile ilişkilidir. Tepe sonra flüoresan sinyal yavaşça taban seviyesine doğru düşer. BFÜ ölçümler can ligandın _EC50 değeri (yarı maksimal etkin konsantrasyonu) belirlemek için konsantrasyon-yanıt eğrileri dönüştürülebilir. Genel olarak, en az üç bağımsız ekranlar, bir dizi konsantrasyon üç kopyaları da dahil olmak üzere her biri, güvenilir bir konsantrasyon-tepki eğrisi oluşturmak için gerçekleştirilmelidir.

Bu deney tasarımında çok sayıda pozitif ve negatif kontroller için tavsiye edilir. Her şeyden önce, bir transfeksiyon kontrolü, bilinen bir ligand ile bir reseptör uygulanmasında, yani test edilmelidir. Bu transfeksiyon ajanı işlevsel olup olmadığını doğrulamak sağlar. Hücre hattı ve bir negatif kontrol (örn., yıkama tamponu) içinde bir reseptör için endojen bir agonisti ile bir kontrol deneyi de dahil edilmesi, hücrelerin sağlık ve yaşamı sürdürme kabiliyetini izlemek için ve yıkama tamponu ile kirlenmiş ihtimalini dışlamak için tavsiye edilir Bir oto-fluore ortaya bir faktörkoku yanıt. Sık kullanılan agonistler asetilkolin reseptörünü aktive eden bir PAR ₁ selektif agonisti ya da karbakol gibi davranır, proteaz tarafından aktive edilen reseptör-1 (PAR ₁₎ 'den elde edilen bir peptid bulunmaktadır. Boş bir sentezleme vektörü ile transfekte edilmiş hücreler, aktif bileşikler, hücrenin endojen reseptörleri ile etkileştikleri dışlamak için test edilmelidir. Aşağıdaki protokolde tarif edilen çeşitli parametrelerin optimizasyonu, farklı sinyal verme sistemleri için gerekli olabilir. Tam flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon deneyinin şematik bir şekil Şekil 1 'de gösterilmektedir.

Floresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahliliyle Şekil 1.. Genel şeması. Otomatik sıvı taşıma ve eşzamanlı floresan ölçümler istasyonu ile yapılıryazılım tarafından yönlendirilen cihaz mikroplaka okuyucu. Hücre plaka için bir, levha bileşik ve ucu raf: istasyon cihaz üç çekmece içerir. Yap-pipet transfer bileşik plakanın bir sütundan, hücre levhasının (aşama 1) karşılık gelen sütun bileşikler yer alır. , Hücre levhasının her biri de, ilgi konusu GPCR ve karışık Gα ₁₆ alt-birimi ile birlikte-transfekte edilmiş hücrelerde HEK293T bir tek tabaka içerir. Bir bileşik reseptörünü aktive olduğunda, Gα ₁₆ GDP-bağlı GTP ile değiştirilir. Gα ₁₆ alt-birimi, daha sonra Gβγ karmaşık ayrışmaktadır ve sırayla fosfatidilinositol bifosfat (PIP ₂₎ diaçilgliserol (DAG) ile inositol trifosfat (IP ₃₎ sonuçlanan hidrolize fosfolipaz Cö (PLCβ) aktive eder. IP ₃ kalsiyum int salınımını başlatma, endoplazmik retikulum zarında mevcut IP ₃ bağımlı kalsiyum kanallarını aktive edersitoplazma o. Fluo-4 (hücreler ek bileşik önce yüklenir hangi) ile kalsiyum etkileşimi bir flüoresan sinyal (aşama 2) ile sonuçlanır. Yazılım nispi floresan ünitesi, zamanın bir fonksiyonu olarak (RFU) değerleri olarak sonuçlarını göstermektedir, ve pik yükseklikleri konsantrasyona bağlı bir şekilde ligand konsantrasyonu ile ilişkilidir. Bu veriler daha sonra, bir ligand-reseptör çifti (aşama 3) ve _EC50 değerini belirlemek için bir konsantrasyon-tepki eğrisi dönüştürülebilir.

Protokol

Not: hücreler de dahil olduğu tüm işlemler, bir laminar akış içinde çalışarak, steril bir ortamda yapılmalıdır.

HEK293T Hücre Hattı 1. Bakım

1. % 5 _CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de bir T-75 balonuna HEK293T hücreleri büyütün.
2. Geçiş% 80 bir birleşme elde edilir hücreler. Not: Bu, normal olarak 3-4 gün sürer. Sürekli kültür içinde hücreler, tarama için 20-25 kullanılabilir pasajlar sağlar.
   1. Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür, PBS-tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) olmaksızın Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) koyun ve büyüme ortamında (500 ml (500 ml PBS, 10 ml tripsin-EDTA çözeltisi ve 4.5 ml% 4 EDTA ile takviye edilmiş) Dulbecco'nun modifiye Eagle orta - yüksek glukoz [DMEM] önceden oda sıcaklığında,% 10 cenin sığır serumu [FBS] ve 1 mM penisilin-streptomisin [PS]) yarım saat ile takviye edilmiştir.
   2. Kaldırmakhücrelerden eski büyüme ortamı. 3 ml PBS ile ölü hücreleri durulayın ve tekrar PBS kaldırmak.
   3. , 3 ml PBS-tripsin-EDTA ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübe edilir ve çözelti Not çıkarın: Hücrelerin morfolojisi değişecektir yıldız şeklinde küre-şekilli.
   4. Hafifçe vurmak suretiyle şişenin tabanından hücreleri gevşetin ve taze büyüme ortamına 10 ml alt birkaç kez durulama ile hücreleri toplamak.
   5. 14 ml yeni büyüme ortamı içeren, ve bir% 5 _CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de inkübe yeni bir T-75 balon içine Aktarım hücre kültürünün 1 mi.

HEK293T Hücreler 2. Geçici transfeksiyonu

1. 3 gün gerçek kalsiyum mobilizasyon analizden önce bir T-75 balonuna HEK293T hücreler büyümek gerçekleşir. Emin, üç T-75 balonları, reseptör yapısı, boş bir ifade vektörü, negatif kontrol ve o ile transfeksiyonu için bir ile transfeksiyonu için kullanmak için emin oluntransfeksiyon kontrolü için ne. Not: Aşama 1.2 'de tarif edildiği gibi hücre pasajı gerçekleştirilir. Birden 96-kuyu plakalar elenecek varsa, T-150 matara (adımlarla 1.2.5, 2.3, 3.1.3 ve 3.1.4 bunu yapmak, çift listelenen tüm miktarlarda) hücrelerin daha yüksek bir verim elde etmek için kullanılabilir .
2. Hücre kültürleri 50-70% izdiham varana kadar 20-24 saat boyunca bir% 5 _CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de şişeler inkübe edin.
3. Ilgi ve Gα ₁₆ yapının GPCR, boş vektör ile Gα ₁₆ yapısı ile ikinci balon ve transfeksiyon kontrol ve Gα ₁₆ yapısı ile üçüncü kodlayan ekspresyon vektörü ile hücrelerinin Co-transfect bir popülasyon. Not: Bu protokol, Drosophila SNPF reseptörünün bir pcDNA3.1 memeli sentezleme vektöründe ¹³ klonlandı. Jetprime transfeksiyon gerçekleştirmek için kullanıldı, ancak diğer transfeksiyon reaktifler de kullanılabilir.
   1. At ekle7.8 ug DNA (3.9 ug reseptör yapısı, ya da boş bir vektör, ve 3.9 ug Gα ekspresyon yapısı, _16), bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve Jetprime tampon 500 ul ekleyin oplam. Tüp vorteks ile iyice karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün.
   2. Jetprime reaktif, girdap 37.5 ul ekleyin ve 14,000 x g'de 1 dakika aşağı doğru döndürün. Oda sıcaklığında, transfeksiyon karışımı 10 dakika inkübe edin.
   3. Hücre kültür ortamına transfeksiyon karışımı damla damla ilave edin ve kültür şişenin duvarları ile temas kaçınarak ortam haline doğrudan pipetle emin olun. 20-24 saat boyunca bir% 5 _CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de şişeler inkübe edin.

3.. Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi

1. Transfekte edilmiş hücreleri toplamak ve 96 oyuklu siyah duvarlı, şeffaf dipli plakalar içerisinde bunları tohum.
   1. PBS, PBS-tripsin-EDTA ile DMEM transfer sıvısının,% 10 diyaliz edilmiş FBS ile takviye edilmiş (500 ml DMEM yerleştirinve önceden% 1 PS), oda sıcaklığında yarım saat.
   2. Coat 96 oyuklu (plaka başına 5.85 ml PBS ve 150 ul fibronektin [% 0.1]) oyuk başına fibronektin (0.0025%) içeren PBS içinde 60 ul, siyah duvarlı, şeffaf tabanlı plakalar. Üzerinde kapak ile 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Kuyulardan çözüm çıkarın ve oda sıcaklığında kapağındaki olmadan, 1 saat boyunca tekrar inkübe edin. Alternatif olarak, bu daha iyi bir hücre eklenmesi için önceden kaplanmış plakalar kullanmak mümkündür.
   3. Hücrelerden eski büyüme ortamı çıkarmak ve 3 ml PBS ile ölü hücreleri durulayın ve PBS kaldırmak.
   4. , 3 ml PBS-Tripsin-EDTA ekleyin, 1 dakika boyunca inkübe edilir, daha sonra solüsyon çıkarın. Not: Bu küre şeklindeki ikinci yıldız şeklinde hücreler değişikliklerin morfolojisi.
   5. Hafifçe vurmak suretiyle şişenin tabanından hücreleri gevşetip DMEM transfer ortamının 10 ml ile bir kaç kez durulanarak toplarlar. Bir 50 ml Falcon tüpü içine hücreleri aktarın.
   6. Sayısıml başına hücre sayısı (burada NucleoCounter ile yapılan, ancak bir Bürker en odası kabul edilebilir). Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, hücre kültürünün 100 ul ekleyin. 100 ul lizis tamponu ekleyin ve tüp dokunarak karıştırın. 100 ul stabilize tamponunu ekleyin ve dokunarak karıştırın.
   7. Hücre süspansiyonu ile bir NucleoCassette doldurun ve sayaç ile hücreleri sayın. Liziz ekleme ve aşama 3.1.6 tamponu stabilize zaman hücreler, üç faktör ile seyreltilmiş olarak üçe hücre sayısını çarpın.
   8. 600.000 hücre / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar hücrelere seyreltin ve / oyuk başına 90,000 hücre, bir hücre yoğunluğu elde etmek üzere kaplanmış levhaları üzerinde göz başına 150 ul hücre tohum. Hava kabarcıklarını önlemek ve bir bitişik hücre katmanı elde etmek için eşit hücreleri yaymak için plaka dokunun. 16-24 saat boyunca bir% 5 _CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
2. Floresan boya ile hücreleri yükleyin ve co hazırlamakmpound plakası.
   1. Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) Hazırlama / HEPES / Ca ^{2 +} / sığır serum albümini (BSA) tampon maddesi (damıtılmış su içinde 1 M _CaCI2 [dH ₂ O] - oda sıcaklığında saklayın) 165 ul _CaCl2 stok solüsyonu ekleyin 500 ul HEPES stok çözeltisi (1 M HEPES dH ₂ O, pH 7.4 'de - oda sıcaklığında saklayın) ve 50 ml HBSS 0.05 g BSA. Yağ asitleri, ilgi konusu reseptörün kalsiyum sinyal bozucu, reseptörleri aktive gibi bu yağ asitsiz BSA, kalsiyum tahlilleri için kullanılır edin.
   2. Probenesid çözeltisi (100 x, 250 mM) hazırlanması: 5 ml NaOH (1 M) içerisinde 0.71 g probenesit çözülür ve 50 ul HEPES stok çözeltisi ve HBSS / HEPES / Ca ^{2 +} / BSA tampon içinde 5 ml - her zaman taze solüsyon hazırlanır. Not: Probenesid dolayısıyla floresan sinyalini azaltır sitoplazmadan Fluo-4 bağdaki inorganik anyon taşıyıcılarını inhibe eder. Bu boya yükleme gerçekleştirmek için tavsiye edilirprobenesid varlığı ve yokluğu probenesid da agonist aracılı sinyal azaltabilir gibi inorganik anyon taşıyıcıları, inceleme altındaki belirli hücre hatlarında potansiyel bir sorun mevcut olup olmadığını belirlemek için.
   3. Yıkama tamponu hazırlayın: 50 ml HBSS / HEPES / Ca ^{2 +} / BSA tampon 500 ul probenesid çözeltisi eklemek pH'ı 7.4 'e ayarlayın ve tampon çözeltisi süzün. Her zaman taze tamponu hazırlamak ve plaka gereklidir başına 50 ml tampon.
   4. % 10 pluronik asit çözeltisi hazırlayın: 50 ul DMSO ile 50 ul karıştırın pluronik asit (dimetil-sülfoksit içinde 20% w / v [DMSO]) - kristalizasyon oluşursa, ısı 37 ° C'ye kadar ve her zaman taze solüsyon hazırlanır.
   5. Fluo-04:00 çözeltisi (1 mM) hazırlayın: tamamen eriyene kadar 50 ug Fluo-4:00 ve vorteks içeren bir şişeye, 44 ul% 10 pluronik asit solüsyonu ekleyin. Floroforun beyazlatma önlemek için ışığa maruz kalmaktan kaçının.
   6. Yükleme tamponu hazırlayın: add 8.8 ml DMEM katkılanan10 mM HEPES ve Fluo-04:00 çözeltisi (44 ul) ve vorteks 2.5 mM probenesid (pH 7.4) ile d. Her zaman taze tampon kullanın.
   7. Hücrelerden ortam atılır, oyuk başına 200 ul PBS ile hücrelerin yıkayın ve PBS çıkarın.
   8. Oyuk başına 55 ul yükleme tamponu ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Işığa plakanın maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile plaka sarın.
   9. Bu hücre sentezleme sistemi için zararlı (örn., asetonitril) çözücü maddeler içinde çözülür ise, ekranın önce bileşiklerin kuru olduğundan emin olun.
   10. Silikon 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde, yıkama tamponu içinde peptidleri çözünürleştirilir. Bir konsantrasyon-tepki analizi gerçekleştirmek için bir ligandın _EC50 değerini belirlemek için bir seyreltme serisi hazırlanır. Bileşik levhanın (V-şekilli 96 oyuklu plakalar) çok iyi karşılık gelen ligandın 70 ul eklenir ve her plaka üzerine pozitif (endojen agonisti) ve negatif kontroller (yıkama tamponu) içerir. Değil e: bir bileşik, yıkama tamponu içinde çözünebilir değilse, bu tür bir su veya yağ ve diğer suda çözülmeyen maddelerin (örneğin, Kolliphor EL) emülsiyon ve çözeltiler gibi çözündürülmesi, araştırma altındaki hücreler için zararlı olmayan diğer çözücüler, deneyin .
   11. Bütün numuneler üç kopya halinde ölçün. Bileşik plakasından bir ligandın 50 ul deney süresince, hücre levhasının 100 ul yıkama tamponu ile bir kuyuya aktarılır göz önünde bulundurun, yani arzu edilen nihai konsantrasyon 3 kat da bileşikleri hazırlamak.
   12. Hücre plakasından yükleme tamponu atılır ve her bir oyuğa 100 ul yıkama tamponu ilave edin. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkalayın plaka ve ışığa maruz kalmasını engeller.
   13. Hücre plakasından yıkama tamponu atılır ve her bir oyuğa 100 ul yeni yıkama tamponu ilave edin.
   14. 37 ° C'de 15 dakika boyunca hücre plakası, bileşik plaka ve bir uç raf (96-çukurlu, istasyon cihazı pipet uçları) inkübe

İstasyon Cihaz üzerinde başlığı "> 4. Deneyi

1. Oluşturun ve yazılım ile istenilen protokol dosyasını yüklemek ve okuma odası için sıcaklık kontrol ünitesi etkinleştirin. Burada, 525 nm'de (tam bir 96 oyuklu plaka yaklaşık olarak 25 dakika sürer ölçüm) ardı ardına arasında 1.52 saniyelik bir aralık ile her seferinde bir satır 2 dakika boyunca 37 ° C'de kalsiyum tepkileri ölçer. 488 nm Fluo-4 uyarılmasını ayarlamak ve 26 ul / sn belirlenen dağıtım hızı ve 135 ul bir pipet yüksekliği ile, hücre plakası, okuma başladıktan sonra 18 saniye için bileşik 50 ul bir toplam hacim aktarın.
2. Istasyon cihazın uygun çekmeceleri olan bir bileşiğin ve hücre plakası ve uç raf yerleştirin.
3. FLEX modunda gerçek ekran başlamadan önce, son nokta modunda aynı eksitasyon ve emisyon dalga boyunda, hücre levhasının tek bir okuma gerçekleştirin. Not: Bu ölçüm nispi floresan ünitesi (RFU) değerleri verir ve biz arasındaki değişkenliği tespit edilmesine olanakLevhanın LLS. 20,000 ile 40,000 arasında değerler olarak kabul edilebilir olarak kabul edilmektedir.
4. Tahlil başlatın ve yazılımı ile verileri analiz.

Sonuçlar

50 uM 0.001 nM arasında değişen konsantrasyon serisi dört Drosophila SNPF peptidler (: AQRSPSLRLRFamide, Drome-SNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-SNPF-3: PQRLRWamide, Drome-SNPF-4: PMRLRWamide Drome-SNPF-1) için test edilmiştir geçici Drosophila SNPF reseptörü ve karışık Gα ₁₆ altünitesini ifade HEK293T hücreleri üzerinde. GPCR 0.1 nM kadar son konsantrasyonlarda dört peptidler tarafından etkin hale getirilemez ve reseptör aktivasyonu konsantrasyona bağlı oldu. Şekil 2, bu Drome-SNPF-1 konsantrasyon serisi üç kopyaları birine karşılık gelen grafikler tasvir etmektedir. (- 1 uM PAR ₁₎ güçlü bir aktivasyonu ortaya endojen proteaz tarafından aktive edilen (± 30,000 RFU), yüksek floresan sinyaline yol açan, reseptörü-1, negatif kontrol (yıkama tamponu) pozitif kontrol ederken, bir flüoresan sinyal uyarmadı. Not edilmelidir ki bir sapmaTipik eğri anormallikler gösterebilir. Örneğin, taban çizgisine geri dönmeden eğri sürekli bir artış, örneğin kalsiyum ionofor varlığında, ya da kalsiyum sızıntı neden olan bir kesintiye lipid çift katmanı gibi reseptör olmayan aracılı sinyalleri ile ilişkili olabilir.

Yazılım aktivasyon yüzdesi veya diğerleri arasında farklı konsantrasyonları standart hataları belirlemek için formüller giren sağlar. Şekil 3'te dört Drome-SNPF peptidleri için gösterildiği gibi, elde edilen verileri, EC ₅₀ değerlerini tahmin etmek için ön konsantrasyon-tepki eğrileri oluşturmak için kullanılır. Şekil 3'ün Eğimler aynı zamanda, negatif kontrol konsantrasyon serisi için verileri içerir Drome-SNPF peptidler boş pcDNA3.1 vektörü ile transfekte edilmiş HEK293T hücreler üzerinde test edilmiştir. Sonuçlar, bu hücrelere peptitlerin ilavesinin endojen reseptör üzerinde bir etkiye sahip olduğuna, ancak gerçekten activSöz konusu alıcıyı yedi. Flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon deney daha sonra üç kere, bağımsız bir şekilde tekrar edildi. Başlangıç ​​ekranının ön konsantrasyon-yanıt eğrileri göre, test edilen konsantrasyon eğrisinin dinamik aralık (Şekil 4) kapsayacak şekilde adapte edilmiştir. Drome-SNPF-1 (2.04 ± 1.48 nM [% 95 güven aralığı]), Drome-SNPF-2 (5.89 ± 3.74 nM), Drome-SNPF-3 (5.55 ± 3.95 nM) ve Drome-SNPF-of EC50 değerleri, 4 (0.50 ± 1.01 nM) da reseptörünü aktive etmek için aynı derecede etkili olduğunu gösteren, benzer.

Bir dizi konsantrasyon (50 uM 0.001 nM arasında). On iki son konsantrasyonları o bir reseptör aracılı floresan tepkisi için yazılım Şekil 2. Grafiksel çıktıf Drome-SNPF-1 peptit Drome-SNPF reseptörü üzerinde test edildi. Aktivasyon nispi floresan ünitesi (RFU) değerleri olarak ifade edilir. Üst grafik altı yüksek konsantrasyonlarının sonuçları ve altı düşük konsantrasyonları alt grafiğini vermektedir. (-) Yıkama tamponu olan pozitif kontrol (+) PAR ₁ (1 uM) ve negatif kontrolüdür.

Şekil 3,. Tek flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon analizi ile belirlenen Drosophila SNPF peptidlerin ön konsantrasyon-tepki eğrileri. Geçici dört Drosophila SNPF peptidler için HEK293T hücrelerinde ifade Drosophila SNPF reseptörünün konsantrasyon-yanıt eğrileri mavi gösterilmiştir. (Kırmızı ile gösterilen) negatif kontroller için, peptidler HEK293T üzerinde test edilmiştirboş pcDNA3.1 vektörü ile transfekte edilen hücreler. Floresan yanıtları en yüksek değere (% 100 aktivasyon) için göreceli olarak (%) olarak gösterilmiştir. Eğriler, her konsantrasyon serisi üç kez ölçülmüş olup, ki içinde, bir deneyin sonucudur. Dikey çubuklar (bu durumda, sadece semboller gösterilmiştir) bazen kullanılan sembollerin daha küçük ortalama (SEM), standart hatayı temsil eder.

Şekil 4,. Konsantrasyon-yanıt eğrileri ve üç bağımsız flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon deneyleri ile tespit Drosophila SNPF peptidlerin EC ₅₀ değerlerine tekabül etmektedir. Geçici dört Drosophila SNPF peptidler için HEK293T hücrelerinde ifade Drosopihla SNPF reseptörünün konsantrasyon-tepki eğrileri, bir sonucudur üç bağımsız bendenasurements her bir üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir (n ≥ 9). Floresan yanıtları en yüksek değere (% 100 aktivasyon) için göreceli olarak (%) olarak gösterilmiştir. Yıldız n ≤ 9. Hata çubukları, bazen de (bu durumda, sadece semboller gösterilmiştir) kullanılan sembollerin daha küçüktür SEM, işaret etmektedir için konsantrasyonlarını gösterir. EC ₅₀ değerleri% 95 güven aralıkları ile gösterilir.

Tartışmalar

Flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlil daha önce başarılı bir şekilde Mertens ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiştir Drosophila SNPF peptiderjik sinyalizasyon sistemi, fonksiyonel karakterizasyonu teyit etmek için uygulanmıştır. bir biyoışıldama tahlili ve Feng et al. Elektrofizyolojik deney ^13,15 ile. Drome-SNPF-; fluo = 2.04 nM, Lumi = 51 nM: HEK293T hücrelerinde floresan deneyi ile elde edilen _EC50 değerleri, yaklaşık CHO hücreleri (Drome-SNPF-1 içerisinde gerçekleştirilen biyoışıldama tahlili ile elde edilenden daha az bir 10-kat 2: fluo = 5.89 nM, Lumi = 42 nM; Drome-SNPF-3: fluo = 5.55 nM, Lumi = 31 nM; Drome-SNPF-4: fluo = 0.50 nM, Lumi = 75 nM). Bu varyasyonlar, kullanılan sentezleme sistemlerinden biri, belirli bir reseptörünün fonksiyonel ifadesi için daha uygun olabilir, ya da reseptörlerinin katlama c daha az verimli olduğu gerçeği de dahil olmak üzere çeşitli faktörlere açıklanabilirertain hücre türleri. Genel olarak in vivo peptid-reseptör etkileşimi fizyolojik önemi destek, floresans ve biyoışıldama tahlili ile her iki reseptörü üzerinde test edildiği zaman, dört Drome-SNPF peptidlerin _EC50 değerleri, nanomolar aralıkta bulunmaktadır.

Drosophila SNPF sinyalizasyon sistemi normal deney düzeneğinde en transfeksiyon kontrolü için aktive ligand bilindiği için bir reseptör ile bir transfeksiyon kontrol olarak, burada sunulan ekranına dahil dikkat etmek gerekir. HEK293T hücreleri (PAR ₁₎ ve negatif kontrol (yıkama tamponu) içinde bir endojen ligandı olan pozitif kontrol ekranında dahil edilmiştir. PAR _1'in sonuçları hücreler, iyi durumda olduğunu göstermiştir. Negatif kontrol (yıkama tamponu) olan peptidler çözündürülür hangi orta inf olabilecek herhangi bir yabancı maddelerden arındırılmış olduğunu gösterir, bir flüoresan sinyal neden olmamıştırsonuçlarını luence.

Karakterize edici özelliği, daha önce Drosophila SNPF sinyalizasyon sistemi, flüoresan bazlı kalsiyum mobilizasyon tahlilini açıklamak için kullanılmıştır. Bu amaç için, aktive edici ligandların konsantrasyonu hemen dizi test edilmiştir. Yetim reseptör bileşiklerinin yüzlerce içeren bir kütüphane test etmek için bir tarama tahlilinde aşırı ekspresyonuna getirilir, ancak, bu ligandlar (örn.., 10 ya da 1 uM) nispeten yüksek nihai konsantrasyonları ile, birinci ekranına karşılık tavsiye edilir. Bir aktive bileşiğin tespiti sonra, bu bileşiğin bir seyreltme serisi bir konsantrasyon-tepki eğrisi oluşturmak için ve _EC50 değerini belirlemek için taranabilir.

Bir reseptörün aktive ligand belirlendikten sonra, hücre içi sinyal yolu ayrıca protokol uyarlanması ile araştırılabilir. Deney, yukarıda tarif edildiği gibi gerçekleştirildi, ancak G eş zamanlı olarak transfekte olmayan ^ alınabilir5, ₁₆ alt-birimi. Bir kalsiyum tepki ölçülür, bu demektir ki, alıcı hücre sentezleme sistemi bir endojen Gα _q alt-birimi ile çiftler. Herhangi bir flüoresan sinyal bakıldığında, diğer ikinci haberciler (örn.., CAMP) konsantrasyonlarda değişiklikleri ölçmek için protokoller uygulanabilir.

Yapı-aktivite ilişkisi (SAR) çalışmaları da reseptör aktivasyonu için gerekli olan peptidin çekirdek dizisini tanımlamak için gerçekleştirilebilir. İlk olarak, kesik sekanslar, yine de reseptörünü de aktive edebilmektedir peptidin en az bir amino asit dizisini belirlemek için değerlendirilir. Daha sonra, peptidler, sistematik olarak, her bir amino asit bir alanin kalıntısı ile ikame edilmiş olan test edilebilir. Reseptörü üzerinde sentetik alanin-ikame dizi test reseptör aktivasyonu ^24,25 için amino asitlerin her birinin önemini belirlemek için izin verir.

Sık kullanımının ve kanıtlanmış zorunlu kılmakta rağmenCacy, burada açıklanan tahlil ilgi belirli reseptörleri için en iyi sonuçları elde etmek için bazı uyarlamalar gerekebilir vurgulanmalıdır. Gα ₁₆ alt-birimi çoğu GPCRs bağlanan bir avantajı vardır, ama aynı zamanda reseptörleri üzerinde dominant-negatif bir etkiye sahip olabileceğini endojen Gα _q ²² ile bir çift. Bu durumda, bu yeni kalsiyum tahlilinde en iyi duruma getirilmesi sırasında G proteinlerinin farklı kombinasyonları test etmek ve Gα ₁₆ yokluğunda veya varlığında, Gα _{q-bağlanmış} reseptörler için sonuçları karşılaştırmak için yararlı olabilir. Reseptör aktivasyonunu tespit etmek için etkileşim G protein bağımsız alternatif tahliller, aynı zamanda, GFP-etiketli arrestin olan translokasyon, veya zar potansiyeli (örneğin,., FLIPR zar potansiyeli Assay Kit) değişimlerin tespiti gibi, gerçekleştirilebilir. Fluo-4:00, burada diğer kalsiyum duyarlı fluorophores geniş bir dizi, kendi spektral ve Chemic her yanında;al özellikleri mevcuttur. En uygun florofor GPCR, hücre tipine ve mevcut plaka okuyucusu göre seçilebilir, ancak deneysel doğrulama gereklidir. Transfekte edilmiş DNA ve her reseptör-transfeksiyon reaktifi-hücre hattı kombinasyonu için belirlenecek DNA / transfeksiyon ayıracı oranı ihtiyacı miktarları. Son olarak, sürekli bir kültür içinde hücreleri sadece 20-25 kullanılabilir geçitleri tarama tahlilleri yapmak için izin akılda tutulmalıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293T cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Trypsin-EDTA solution (0.25%)	Sigma-Aldrich	T4049
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	MP Biomedicals	195173
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose  (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Penicillin-Streptomycin (P-S)	Sigma-Aldrich	P4333
jetPRIME	Polyplus transfection	114-01	FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies)
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
Fibronectin from human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Reagent A100, Lysis buffer	Chemometec	910-0003
Reagent B, Stabilizing buffer	Chemometec	910-0002
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H8264
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761
NaOH (1 M)	Vel	2781
Pluronic acid	Invitrogen	P-3000MP
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1, ... (Invitrogen)
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)	Sigma-Aldrich	Z707503 and Z707554
FlexStation device	Molecular Devices		NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom	Greiner Bio-One	655090	Corning 96-well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates
NucleoCassette	Chemometec	941-0001
NucleoCounter NC-100	Chemometec
Microcentrifuge tubes, siliconized	BioCision	BCS-2470
Polystyrene V-shaped 96-well plates	Greiner Bio-One	651101
96-Well, FlexStation pipette tips	Molecular Devices	9000-0912
Soft Max Pro software	Molecular Devices