אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

Summary

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

Abstract

במשך יותר משנים 20, פרמקולוגיה ההפוכה הייתה האסטרטגיה הדגולה לגלות ligands ההפעלה של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs). תחילתה של assay פרמקולוגיה ההפך היא השיבוט וtransfection הבא של GPCR של עניין במערכת ביטוי תאית. קולט Heterologous הביע אז תיגר עם ספרייה מורכבת של ligands המועמד לזהות יגנד הפעלת קולטן (ים). הפעלת קולטן יכולה להיות מוערכת על ידי מדידת שינויים בריכוז של מולקולות כתב השליח השניה, כמו סידן או במחנה. Assay גיוס הקרינה מבוססת סידן שתואר כאן הוא מדיום תפוקה משמשת לעתים קרובות להפוך assay פרמקולוגיה. GPCR היתום מתבטא transiently ב293T כליה העוברית האנושי לתאים (HEK293T) ומבנה Gα ₁₆ מופקר הוא שיתוף transfected. בעקבות יגנד מחייב, הפעלה של מקטע Gα ₁₆ גורמת לשחרור של f סידןrom reticulum endoplasmic. לפני הקרנת יגנד, תאי קולטן להביע נטענים עם מחוון סיד ניאון, Fluo-4 acetoxymethyl. אות הניאון של Fluo-4 היא זניחה בתאים בתנאי מנוחה, אבל יכולה להיות מוגבר יותר מ פי 100 על האינטראקציה עם יוני סידן שפורסמו לאחר הפעלת קולט. הטכניקה המתוארת אינה דורשת הקמתה של שורות תאי transfected ביציבות שבו החומר הגנטי transfected משולב לתוך הגנום התא המארח זמן רב. במקום זאת, transfection חולף, שהניבו ביטוי זמני של גן היעד, מספיק כדי לבצע את assay ההקרנה. ההתקנה מאפשרת הקרנה בינונית תפוקה של מאות תרכובות. Co-transfection של ₁₆ Gα המופקר, שהזוגות ביותר GPCRs, מאפשר מסלול האיתות תאית כדי להיות מנותב לכיוון שחרורו של סידן, ללא קשר למסלול איתות היליד בגד 'אנדוגניטים. תאי HEK293T קלים לטפל והוכיחו את יעילותם לאורך השנים במבחני deorphanization הקולטן. עם זאת, אופטימיזציה של assay לקולטנים ספציפיים עשויה להישאר צורך.

Introduction

קולטני G-חלבון בשילוב (GPCRs) מהווה אחת המשפחות הגדולות והמגוונת ביותר בין כל החלבונים בתא השטח. הנוכחות שלהם בבעלי חוליות, חסרי חוליות, צמחים, שמרים, ועובש רפש, כמו גם בפרוטוזואה וdiploblastic המוקדם צורות החיים מצביעים על כך שGPCRs הן בין המולקולות הוותיקות מקושרות עם העברת אותות ^1. ligands ההפעלה הטבעי שלהם מהווה מגוון רחב של גירויים חיצוניים כולל פפטידים, אמינים ביוגני, ניחוחי, גליקופרוטאינים, ופוטונים ^2. ככזה, מערכות איתות הקולטן ליגנד האלה מעורבים במגוון רחב של תהליכים פיסיולוגיים. הספקטרום הפונקציונלי הרחב הופך אותם מתאים באופן אידיאלי לפיתוח תרופות טיפוליות המכסות מגוון רחב של מחלות בבני אדם. כ 50-60% ממטרות התרופה הנוכחיות מיוצגים על ידי GPCRs ^3,4. מלבד החשיבות הגדולה שלהם בתעשיית התרופות, GPCRs גם הן באור הזרקורים לפיתוחדור חדש של חומרי הדברה מינים ספציפיים ^5,6 וחומרי הדברה באופן כללי. בגלל ligands הטבעי של GPCRs רבות עדיין לא מזוהה, הם מסווגים כGPCRs יתומה. Deorphanization של קולטנים אלה ישפר את ההבנה של התפקידים הפיסיולוגיים שלהם באורגניזמים ועלול לחשוף את מטרות המשוערת עבור יישומי תרופה חדשים ^7.

מאז העידן הגנומי, אסטרטגית פרמקולוגיה הפוכה מיושמת באופן נרחב לdeorphanization של GPCRs ^8. הגישה מרמזת כי קולטן יתום משמש כ 'וו' ל 'דג מחוץ' ליגנד ההפעלה שלה מתמצית ביולוגית או מספרייה של תרכובות סינתטיות. GPCR של עניין הוא משובט לכן וtransfected לאחר מכן במערכת ביטוי תאית. בשיטות הנפוצות ביותר, הפעלת קולטן נקבעת על ידי מדידת שינויים בריכוז של מולקולות שליח השניה ⁹ . מבחני מיון קולט העיקריים מסתמכים על חלבוני bioluminescent סידן רגיש (למשל, aequorin) ¹⁰ או אינדיקטורים סיד ניאון (למשל, Fluo-4) ^11. מבחני הקרינה מבוססת, שבו תאי קולטן להביע נטענים עם מחוון סיד ניאון לפני הקרנת יגנד, יש את היתרון שהם מאפשרים תפוקה גבוהה הקרנה בשל קלות שימוש שלהם, זמן קריאה קצר, ואת הגמישות של הקרנה קולטנים יתום מרובים על צלחת אחת ^12.

הנה, assay גיוס סידן המבוסס על הקרינה מתואר באופן יסודי ומאויר על ידי תהליך deorphanization של F נוירופפטידים הקצר melanogaster דרוזופילה קולט (sNPF). מערכת איתות neuropeptidergic זו התאפיינה במקור על ידי מרטנס et al. ב2002 ¹³ עם assay פליטת אור סידן שבוצע בשחלת אוגר הסינית תאים (CHO)¹⁴ ועל ידי פנג et al. ב2003 עם assay אלקטרו באמצעות Xenopus ביציות ^15. הנוכחות של מערכת איתות sNPF נראית מוגבלת מהערכה של Arthropoda, שבו הוא מעורב במגוון רחב של תהליכים, כולל הרגולציה של האכלה, צמיחה, תגובות לחץ, תנועה, ומקצבי היממה ^16.

מחקר על מערכות איתות neuropeptidergic בחרקים לא יכול להוביל רק למטרות חדשות לפיתוח של חומרי הדברה, אך הידע של התפקוד שלהם יכול גם להסיק כלפי אורגניזמים אחרים מערכות איתות רבות, בדרך כלל כבר נשמרים היטב לאורך האבולוציה ^17. בעשור האחרון, התקדמות רבה נעשתה בתהליך deorphanization של GPCRs נוירופפטידים חרקים. למרות מאמצים אלה, רק מספר קטן של קולטנים שכבר מתאימים ליגנד מאותו המקור שלהם, והמון מידע רצףGPCRs היתום החדשה הפכה זמינה בשל הרועם של גנומיקה ^18. הזמינות של מדיום / גישות הקרנת תפוקה גבוהה, כמו assay גיוס הקרינה מבוססת סידן שהוכיח את עצמו בטכניקה מיושמת באופן נרחב ^9,18, לכן לא יסולא בפז.

Assay גיוס הקרינה מבוססת סידן כפי שמתוארים כאן מתבצע ב293T הכליה העוברי האנושי שורת תאים (HEK293T) ומשתמש בבדיקת ניאון כדי לקבוע שינויים בריכוז סידן תוך תאי על הפעלת קולט. כדי להבטיח ביטוי גבוה ורמות תרגום של הקולטן, רצף קונסנסוס קוזאק ¹⁹ מתווסף לסוף '5 של רצף קידוד קולטן, שהוא משובט לאחר מכן בוקטור ביטוי (למשל, סדרת וקטור pcDNA לשורות תאי יונקים). כמו שקשה לחזות את החלבון-G הצימוד אנדוגני של GPCR יתום המבוססים על מידע רצףלבד, המולקולות השניה השליח (לדוגמא, סידן או cAMP) כי הם מווסתים לאחר הפעלת קולטן לעתים קרובות אינן ידועות מראש לזיהוי ליגנד. כדי לעקוף בעיה זו, חלבוני G מופקרים של משפחת G _q (למשל, עכברי ₁₅ Gα או Gα אדם ₁₆ [משמש כאן]) או חלבוני chimeric G (למשל, _qi5 Gα) כי אינטראקציה עם רוב GPCRs ולגרום לשחרורו של סידן יכול להיות שותף הביע ^20,21,22. על הכריכה של ליגנד לקולטן שלו, GPCR עובר שינוי קונפורמציה שגורם להפעלה של מסלולים תאיים מסוימים. מולקולת דיפוספט guanosine (תמ"ג), מחויבת בתנאי מנוחה למקטע Gα _16, תוחלף על ידי אדנוזין guanosine מולקולה (GTP). זה מעורר את הניתוק של חלבון G heterotrimeric במקטע Gα ₁₆ וGβγ. מקטע Gα ₁₆ מפעיל פוספוליפאז C &946 #; (PLCβ), אשר בתורו hydrolyzes bisphosphate הקרום הנכנס phosphatidylinositol (PIP ₂₎ וכתוצאה מכך diacylglycerol (DAG) וtrisphosphate אינוסיטול (IP _3). IP ₃ יתפשט בציטופלסמה ומפעיל IP ערוצי סידן ₃ תלויים בהווה בקרום של reticulum endoplasmic, אשר גורם לשחרור של סידן לתוך הציטופלסמה.

שחרור סידן על הפעלת קולטן מתרחש תוך שניות ויכול להיות מזוהה על ידי טעינת תאים לפני assay ההקרנה עם צבע סידן רגיש, כמו Fluo-4 acetoxymethyl (AM) ^11. קבוצת אסתר AM מאפשרת fluorophore לחצות את קרום התא, והוא הבקיע את ידי esterases cytoplasmic פעם אחת בתוך התא. כתוצאה מכך, המטענים השליליים של צבע הניאון הם חשפו, ומונעים ממנו לשדר אל מחוץ לתא ומאפשר לו אינטראקציה עם יוני סידן. O אות הניאוןו Fluo-4 הוא זניחים בתאים בתנאי מנוחה המכילים רק ריכוזי סידן בטווח nanomolar. עם זאת, כאשר סידן משתחרר עם הפעלת קולטן, האות יכול להגדיל את ריכוז dependently ליותר מ פי 100, מה שמבטיח יחס אות לרעש גדול בזאת. Fluo-4 גם מפגין טווח דינמי גדול לדיווח [סיד] סביב _ד K (סידן) של 345 ננומטר, מה שהופך אותו מתאים למדידה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לשינויים בסידן במגוון רחב של תאים. העירור של Fluo-4 מתרחש ב488 ננומטר וקרינת הפליטה נמדדת ב525 ¹¹ ננומטר. Fluorimeters כמו קורא צלחת דימות פלואורסצנטי (FLIPR) ^23, NOVOstar, או FlexStation (מכשיר תחנה) ¹² הן מערכות בינוניות / תפוקה גבוהה המאפשרות בנוסף מתחם בו זמנית וזיהוי של אות Fluo-4 על הפעלת קולטן לכל גם בצלחת assay. Assay גיוס הסיד המתואר כאן מסתמך על התחנהמערכת microplate 96, גם מכשיר.

Pro תוכנת SoftMax (תוכנה) משמשת כדי להפעיל את המכשיר לתחנה, כמו גם לניתוח נתונים. התכנית מציגה באופן מיידי את התוצאות כגרפים בפורמט 96 היטב. ניתן לבחור בארות מרובות בו זמנית כדי להשוות את התוצאה של הבארות הללו על אותו הגרף. ערכי יחידת הניאון יחסית (RFU) בארות בכל עמודה נמדדים בו זמנית, לתקופה של שתי דקות, שמתחילים לפני התוספת של תרכובות לבארות והמתמשכות לאחר המדידה של אות הניאון הבא הפעלת קולט. בדרך כלל, את המגמה של עקומת אגוניסט מתיישר עם קו הבסיס ועד מתחם הפעלה מתווסף לתאים, וכתוצאה מכך עלייה מהירה של אות הניאון. גובה השיא מתואם עם ריכוז אגוניסט הסופי בבאר. אחרי השיא, אות הניאון יורדת באיטיות לכיוון רמת הבסיס. מדידות RFU caלהיות n מומר לעקומות ריכוז בתגובה לקביעת ערך EC ₅₀ (ריכוז יעיל חצי מקסימאלי) של ליגנד. באופן כללי, לפחות שלושה מסכי עצמאיים, שכל אחד מהם שלושה העתקים של סדרת ריכוז, יש לבצעו להלחין עקומת ריכוז בתגובה אמינה.

מומלץ לכלול כמה בקרות חיוביות ושליליות בעיצוב ניסיוני. קודם כל, שליטת transfection, כלומר היישום של קולט עם יגנד ידוע, צריכה להיבדק. זה מאפשר אימות אם סוכן transfection היה מבצעי. התאגדות של ניסוי שליטה עם אגוניסט לרצפטור אנדוגני של הקו הסלולרי ובקרה שלילית (למשל, לשטוף חיץ) מומלצות גם לעקוב אחר בריאותם ויכולת הקיום של התאים וכדי לשלול את האפשרות כי לשטוף החיץ היה מזוהם עם גורם שעלול לעורר-fluore אוטומטיתגובת ריח. אגוניסטים משמשים לעתים קרובות הם פפטיד הנגזר ממופעל פרוטאז קולט-1 (PAR _1), אשר משמש כאגוניסט PAR ₁ סלקטיבית, או carbachol, אשר מפעיל את קולטן האצטילכולין. תאי transfected עם וקטור ביטוי ריק גם צריכים להיבדק כדי לשלול כי חומרים פעילים באינטראקציה עם קולטנים אנדוגני של התא. אופטימיזציה של מספר פרמטרים שתוארו בפרוטוקול שלהלן עשויה להידרש למערכות איתות שונות. דמות סכמטית של assay התגייסות מלא הקרינה מבוססת סידן מתואר באיור 1.

מדידות איור 1. תכנית כוללת של assay גיוס סידן המבוסס על הקרינה. אוטומטי טיפול נוזלי וקרינה בו זמנית מבוצעות עם התחנהmicroplate מכשיר קורא, מונע על ידי התוכנה. מכשיר התחנה מכיל שלוש מגירות: אחת לצלחת התא, צלחת מתחם ומתל קצה. העברות pipettor הצטברות בתרכובות מטור אחד של צלחת המתחם לעמודה המתאימה של צלחת התא (שלב 1). היטב בכל צלחת התא מכיל monolayer של תאי HEK293T כי כבר שיתוף transfected עם GPCR של עניין ומקטע Gα ₁₆ המופקר. כאשר מתחם מפעיל את הקולטן, תמ"ג Gα ₁₆ הנכנס הוא הוחלף על ידי GTP. מקטע Gα ₁₆ dissociates לאחר מכן מGβγ המורכב ומפעיל פוספוליפאז Cβ (PLCβ), אשר בתורו hydrolyzes bisphosphate phosphatidylinositol (PIP ₂₎ וכתוצאה מכך diacylglycerol (DAG) וtrisphosphate אינוסיטול (IP _3). IP ₃ מפעיל IP ערוצי סידן ₃ תלוי בהווה בקרום של reticulum endoplasmic, וישכנע את שחרורו של int סידןo ציטופלסמה. האינטראקציה של סידן עם Fluo-4 (שבה התאים נטענים לפני המתחם בנוסף) תוצאות באות ניאון (שלב 2). התוכנה מציגה את התוצאות כיחידת ניאון יחסי ערכים (RFU) בפונקציה של זמן, וגבהים שיא לתאם עם הריכוז ליגנד באופן תלוי ריכוז. לאחר מכן ניתן להמיר נתונים אלה לעקומת ריכוז בתגובה לקביעת ערך EC ₅₀ של זוג (שלב 3) ליגנד לקלוט.

Protocol

שימו לב: יש לבצע את כל הפעולות שבו תאים מעורבים בסביבת סטרילית על ידי עבודה בזרימה למינרית.

1. תחזוקה של הקו הסלולרי HEK293T

1. לגדל את תאי HEK293T בבקבוק T-75 על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באינקובטור humidified.
2. מעבר התאים כאשר מגיעים לנקודת מפגש של 80%. הערה: זה בדרך כלל לוקח 3 עד 4 ימים. תאים בתרבית רציפה יאפשר 20-25 מעברים שמישים להקרנה.
   1. הנח מלוח של Dulbecco פוספט (PBS) ללא סידן כלורי ומגנזיום כלורי, PBS-טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (500 מיליליטר PBS בתוספת 10 מיליליטר פתרון טריפסין-EDTA ו4.5 מיליליטר 4% EDTA) ומדיום גידול (500 מיליליטר המדיום של הנשר שונה Dulbecco - גלוקוז גבוהה [DMEM] בתוספת 10% בסרום שור עוברי [FBS] ומ"מ 1 [נ.ב.] פניצילין, סטרפטומיצין) בטמפרטורת חדר כחצי שעה מראש.
   2. להסירמדיום גידול הישן מהתאים. לשטוף את התאים מתים עם 3 מיליליטר PBS ולהסיר את PBS שוב.
   3. הוסף 3 מיליליטר PBS-טריפסין-EDTA, דגירה 1 דקות בטמפרטורת חדר ולהסיר את הערה הפתרון: המורפולוגיה של התאים תשתנה לספירה בצורת בצורת כוכב.
   4. שחרר את התאים מהחלק התחתון של הבקבוק על ידי הקשה עדינה ולאסוף את התאים על ידי שטיפה מספר פעמים התחתונה עם 10 מיליליטר של מדיום גידול טרי.
   5. העברה 1 מיליליטר של תרבית התאים לT-75 בקבוק חדש המכיל 14 מיליליטר מדיום גידול טרי, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באינקובטור humidified.

2. Transfection חולף של תאי HEK293T

1. לגדל את תאי HEK293T בבקבוק T-75 3 ימים לפני assay גיוס סידן בפועל מתרחש. הקפד להשתמש בשלוש T-75 צלוחיות, אחת לtransfection עם מבנה הקולטן, אחד עבור transfection עם וקטור ריק ביטוי, שליטה שלילית, וoנה לשליטת transfection. הערה: passaging של התאים מתבצע כמתואר בשלב 1.2. כאשר צלחות 96 היטב מרובות צריכה להיות מוקרנים, ניתן להשתמש בם T-150 צלוחיות כדי לקבל תשואה גבוהה יותר של תאים (כדי לעשות את זה, כפול כל כמות הרשומה בצעדים 1.2.5, 2.3, 3.1.3 ו3.1.4) .
2. דגירה צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באינקובטור humidified ל20-24 שעה עד שתרביות התאים להתקרב מפגש 50-70%.
3. אוכלוסייה אחת שיתוף transfect תאים עם וקטור ביטוי קידוד GPCR של ריבית ומבנה Gα _16, את הבקבוק השני עם הווקטור הריק ולבנות Gα _16, ושלישי עם שליטת transfection ומבנה Gα _16. הערה: בפרוטוקול זה, קולט דרוזופילה sNPF שובט בוקטור ביטוי יונקים pcDNA3.1 ^13. JetPRIME שימש לביצוע transfection, אך ניתן להשתמש ריאגנטים transfection אחרים גם כן.
   1. להוסיף בסך כל של 7.8 מיקרוגרם DNA (3.9 מבנה מיקרוגרם קולט או וקטור ריק, ו3.9 מיקרוגרם מבנה ביטוי ₁₆ Gα) לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהוסיף 500 μl של חיץ JetPRIME. מערבבים היטב על ידי vortexing הצינור, ספין למטה תוך זמן קצר.
   2. הוספת 37.5 μl של מגיב JetPRIME, המערבולת וספין למטה 1 דקות ב14,000 X גרם. דגירה transfection תמהיל 10 דקות בטמפרטורת חדר.
   3. מוסיף את תערובת transfection dropwise למדיום תרבית תאים ולוודא פיפטה ישירות לתוך מדיום הימנעות ממגע עם הקירות של בקבוק התרבות. דגירה צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באינקובטור humidified ל20-24 שעה.

3. Assay גיוס הסיד

1. לאסוף את תאי transfected וזרעם בצלחות שחורות חומה, ברורות תחתון 96 היטב.
   1. הנח את PBS, PBS-טריפסין-EDTA ובינוני העברת DMEM (500 מיליליטר DMEM בתוספת 10% FBS dialyzedו1% PS) בטמפרטורת חדר כחצי שעה מראש.
   2. מעיל 96 גם צלחות, שחור קירות, ברורות תחתית עם 60 μl של PBS עם פיברונקטין (0.0025%) בכל טוב (5.85 מיליליטר PBS ו150 μl פיברונקטין [0.1%] לכל צלחת). דגירה הצלחות בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 במכסה. הסר את הפתרון מהבארות ודגירת הצלחות שוב במשך שעה 1 ללא המכסה על בטמפרטורת חדר. לחלופין, אפשר להשתמש בצלחות מראש מצופים לקובץ מצורף תא מוגבר.
   3. תוריד את מדיום גידול הישן מהתאים ולשטוף תאים מתים מעל עם 3 מיליליטר PBS ולהסיר את PBS.
   4. הוסף 3 מיליליטר PBS-טריפסין-EDTA, דגירה במשך 1 דקות, ולאחר מכן להסיר את הפתרון. הערה: המורפולוגיה של התאים משתנה מצורת כוכב לכדור בצורת.
   5. שחרר את התאים מהחלק התחתון של הבקבוק על ידי הקשה עדינה ולאסוף אותם על ידי שטיפה מספר פעמים עם 10 מיליליטר של מדיום DMEM העברה. להעביר את התאים לתוך צינור פלקון 50 מיליליטר.
   6. רוזןמספר התאים למ"ל (הופיע עם NucleoCounter כאן, אבל התא של 'שודד גופות מקובל). הוספה של תרבית התאים 100 μl בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. הוספת 100 מאגר תמוגה μl ומערבבים על ידי הקשה על הצינור. הוספת 100 חיץ μl ייצוב ומערבבים על ידי הקשה.
   7. מלא NucleoCassette עם ההשעיה התא ולספור את התאים עם הדלפק. להכפיל את מספר התאים על ידי שלוש, כפי שהתאים היו מדוללים בפקטור של שלוש בעת הוספת תמוגה וייצוב חיץ בשלב 3.1.6.
   8. לדלל את התאים לריכוז סופי של 600,000 תאים / מיליליטר וזרעים 150 μl של התאים לכל גם בצלחות מצופים כדי להשיג צפיפות תאים של כ 90,000 תאים לכל / כן. למנוע בועות אוויר ולנצל את הצלחת על מנת להפיץ את התאים באופן שווה על מנת לקבל שכבת תאים רציפה. דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO ₂ באינקובטור humidified ל16-24 שעה.
2. טען את התאים עם פלורסנט לצבוע ולהכין את שיתוףצלחת mpound.
   1. הכן תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) / HEPES / Ca ^{2 +} / אלבומין בסרום שור (BSA) חיץ: להוסיף 165 פתרון מניות μl CaCl ₂ (1 M CaCl ₂ במים מזוקקים [DH ₂ O] - לאחסן בטמפרטורת חדר), פתרון מניות 500 HEPES μl (1 M HEPES ב DH ₂ O, pH 7.4 - לאחסן בטמפרטורת חדר), ו0.05 BSA גרם ל50 מיליליטר HBSS. שים לב שBSA החופשי של חומצות שומן המשמש למבחנים בסידן, כמו חומצות שומן יכולות להפעיל קולטנים ספציפיים, פוגם באות סידן של הקולטן של עניין.
   2. הכן פתרון פרובנציד (100x, 250 מ"מ): להמס פרובנציד 0.71 גרם ב 5 מיליליטר NaOH (1 M) ולהוסיף 50 HEPES μl פתרון מניות ו5 מיליליטר של / HEPES / Ca ^{2 +} / החיץ BSA HBSS - תמיד להכין תמיסה טריות. הערה: פרובנציד מעכב מובילי אניון אורגניים שיכול לעקור Fluo-4 מציטופלסמה, ובכך להפחית את אות הניאון. מומלץ לבצע את טעינת הצבע בהנוכחות והיעדר פרובנציד כדי לקבוע אם מובילי אניון אורגניים מהווים בעיה פוטנציאלית בשורות תאים מסוימות תחת חקירה, כפרובנציד אולי אפילו להקטין את האות בתיווך אגוניסט.
   3. הכן לשטוף חיץ: להוסיף 500 μl פתרון פרובנציד 50 מיליליטר HBSS / HEPES / Ca ^{2 +} / חיץ BSA, התאם את ה-pH 7.4 ותסנין פתרון החיץ. תמיד להכין חיץ טרי, ו50 מיליליטר חיץ לנדרשת צלחת.
   4. הכן 10% תמיסת חומצת pluronic: חומצת pluronic לערבב 50 μl (20% w / v בדימתיל-sulfoxide [DMSO]) עם 50 DMSO μl - אם התגבשות מתרחשת, חום ל37 מעלות צלזיוס, תמיד להכין תמיסה טריות.
   5. הכן פתרון Fluo-4 בבוקר (1 מ"מ): להוסיף 44 פתרון μl 10% חומצה pluronic לבקבוקון המכיל 50 מיקרוגרם Fluo-4 בבוקר ומערבולת עד שהוא נמס לגמרי. הימנע מחשיפה לאור כדי למנוע הלבנת של fluorophore.
   6. הכן את חיץ טעינה: להוסיף 8.8 מיליליטר DMEM supplementeד עם 10 HEPES מ"מ ו2.5 פרובנציד מ"מ (pH 7.4) לפתרון Fluo-4 בבוקר (44 μl) ו המערבולת. השתמש תמיד חיץ טרי.
   7. בטל בינוני מהתאים, לשטוף את התאים עם 200 μl PBS לכל טוב, ולהסיר את PBS.
   8. הוסף 55 חיץ טעינת μl לכל טוב ודגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. עטוף את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה של הצלחת להדליק.
   9. הקפד לייבש את התרכובות לפני שהמסך אם הם מומסים בממסים שמשפיעים לרעה (למשל, אצטוניטריל) למערכת הביטוי התאי.
   10. Solubilize פפטידים בחיץ לשטוף בצינורות 1.5 microcentrifuge מיליליטר siliconized. להכין סדרת דילול לבצע ניתוח ריכוז תגובה וכדי לקבוע את ערך EC ₅₀ של ליגנד. הוספת 70 μl של ליגנד במקביל גם של הצלחת המורכבת (צלחות 96, גם בצורת V) וכולל בקרות חיוביות (אגוניסט אנדוגני) ושליליות (חיץ לשטוף) על כל צלחת. לא דואר: אם תרכובת אינה מסיסה בחיץ לשטוף, אפשר לנסות ממסים אחרים שאינם מזיקים לתאים תחת חקירה, כגון מים או פתרונות שemulsify וsolubilize שמנים וחומרים אחרים לא מסיסים במים (לדוגמא, Kolliphor EL) .
   11. למדוד את כל הדגימות בשלושת עותקים. זכור כי 50 μl של ליגנד מצלחת המתחם יועבר להיטב עם 100 לשטוף חיץ μl של צלחת התא במהלך assay, אז להכין את התרכובות ב3x הריכוז הסופי הרצוי שלהם.
   12. מחק את חיץ הטעינה מצלחת התא ולהוסיף למאגר לשטוף 100 μl היטב כל אחד. דגירה דקות צלחת 15 בטמפרטורת חדר ולמנוע חשיפה לאור.
   13. מחק את החיץ לשטוף מצלחת התא ולהוסיף 100 לשטוף חיץ חדש μl היטב כל אחד.
   14. דגירה את צלחת התא, צלחת המתחם, ומתלת קצה (96 היטב, טיפים פיפטה מכשיר תחנה) ל15 דקות ב 37 ° C.

הכותרת "> 4. Assay על ההתקנים התחנה

1. ליצור ולטעון את קובץ הפרוטוקול הרצוי עם התוכנה ולהפעיל את יחידת בקרת הטמפרטורה לחדר הקריאה. כאן, למדוד תגובות סידן ב37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות שורה אחת בכל פעם עם 1.52 מרווח שניות בין קריאות רצופות (מדידת צלחת 96 היטב מלאה לוקחת כ 25 דקות) ב525 ננומטר. הגדר את העירור של Fluo-4-488 ננומטר ולהעביר נפח כולל של 50 μl של מתחם לצלחת התא, 18 שניות לאחר תחילת הקריאה, עם המהירות לוותר נקבעה על 26 μl / sec וגובה פיפטה של ​​135 μl.
2. מקם את המתחם וצלחת תא, ואת מדף הקצה במגירות המתאימות של מכשיר התחנה.
3. בצע אחת קריאה של צלחת התא באותו אורך גל העירור ופליטה במצב נקודת הסיום, לפני שמתחיל את המסך בפועל במצב FLEX. הערה: מדידה זו נותנת יחידת הקרינה יחסי ערכים (RFU) ומאפשרת איתור שונות בינינוLLS של הצלחת. ערכים שבין 20,000 ו -40,000 נחשבים כמקובל.
4. התחל assay ולנתח את הנתונים עם התוכנה.

תוצאות

סדרת ריכוז הנעה בין 50 מיקרומטר ל0.001 ננומטר נבדקו עבור כל ארבעת פפטידים דרוזופילה sNPF (Drome-sNPF-1: AQRSPSLRLRFamide, Drome-sNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-sNPF-3: PQRLRWamide, Drome-sNPF-4: PMRLRWamide) על תאי HEK293T שtransiently לבטא את קולט דרוזופילה sNPF ומקטע Gα ₁₆ המופקר. GPCR הופעל על ידי כל ארבעת פפטידים בריכוזים סופיים עד 0.1 ננומטר, והפעלת קולטן הייתה תלוי ריכוז. איור 2 מתאר את הגרפים המתאימים לאחד משלושה העתקים של סדרת הריכוז Drome-sNPF-1. הבקרה השלילית (לשטוף חיץ) לא לגרום לאות ניאון, תוך הבקרה החיובית ₍₁ PAR - 1 מיקרומטר) שהושרו על הפעלה חזקה של אנדוגני קולט-1, מה שמוביל לאות גבוהה ניאון (± 30,000 RFU) מופעל פרוטאז. יצוין, כי סטייה שלהעקומה האופיינית עשויה להצביע על ליקויים. לדוגמא, עלייה מתמשכת של העקומה מבלי לחזור לנקודת ההתחלה עשויה להיות קשורה לאותות שאינם קולטן בתיווך, כגון הנוכחות של יונופורים סידן, או bilayer שומנים שיבש דליפות סידן.

התוכנה מאפשרת הזנת נוסחאות כדי לקבוע את אחוז ההפעלה או שגיאות התקן של ריכוזים השונים בין יתר. הנתונים המתקבלים משמשים להלחין עקומות ריכוז בתגובה ראשוניות כדי לאמוד את EC ₅₀ ערכים, כפי שמוצגים לארבעה פפטידים Drome-sNPF באיור 3. העקומות של איור 3 כוללות גם את הנתונים לביקורת השלילית שבו הריכוז של הסדרה פפטידים Drome-sNPF נבדקו על תאי HEK293T transfected עם וקטור pcDNA3.1 ריק. התוצאות מצביעות על כך שהתוספת של פפטידים לתאים אלה אין להם השפעה על קולטני אנדוגני, אבל אכן Activאכלתי את הקולטן של עניין. Assay גיוס סידן המבוסס על הקרינה לאחר מכן חזר שלוש פעמים באופן עצמאי. בהתבסס על עקומות ריכוז בתגובה הראשוניות של המסך הראשוני, הריכוזים שנבדקו היו מותאמים כדי לכסות את הטווח הדינמי של העקומה (איור 4). ערכי EC50 של Drome-sNPF-1 (2.04 ± 1.48 ננומטר [95%]), Drome-sNPF-2 (5.89 ± 3.74 ננומטר), Drome-sNPF-3 (5.55 ± 3.95 ננומטר) וDrome-sNPF- 4 (0.50 ± 1.01 ננומטר) הם דומים, מה שמעידים שהם חזקים באותה מידה על מנת להפעיל את קולט.

פלט איור 2. גרפי של התוכנה לתגובת הקרינה קולטן בתיווך של סדרת ריכוז. עשרה ריכוזים סופיים (החל 50 מיקרומטר ל0.001 ננומטר) oו פפטיד Drome-sNPF-1 נבדק על קולט Drome-sNPF. ההפעלה באה לידי ביטוי ביחידת ניאון יחסי ערכים (RFU). הגרף העליון נותן את התוצאות של ששת הריכוזים הגבוהים ביותר וגרף התחתון של ששת הריכוזים הנמוכים ביותר. הביקורת החיובית (+) היא PAR ₁ (1 מיקרומטר) והבקרה השלילית (-) הוא לשטוף חיץ.

איור 3. עקומות ריכוז בתגובה ראשוניות של פפטידים דרוזופילה sNPF נקבעים על ידי assay התגייסות חד הקרינה מבוססת סידן. עקומות ריכוז-התגובה של הקולטן דרוזופילה sNPF הביע transiently בתאי HEK293T לארבעה פפטידים דרוזופילה sNPF מוצגות בכחול. לבקרות השליליות (מסומנות באדום), פפטידים נבדקו על HEK293Tתאי transfected עם וקטור pcDNA3.1 ריק. תגובות הניאון מוצגות כיחסי (%) לערך הגבוה ביותר (הפעלת 100%). העקומות הן התוצאה של ניסוי אחד שבו כל אחת מסדרות ריכוז נמדדו בשלושה עותקים. הקווים האנכיים מייצגים סטיות התקן של הממוצע (SEM), שלפעמים הם קטנים יותר מאשר הסמלים המשמשים (במקרה זה, רק סימנים מתוארים).

איור 4. עקומות ריכוז בתגובה ומתאימה EC ₅₀ ערכים של פפטידים דרוזופילה sNPF נקבעים על ידי שלושה מבחני גיוס סידן המבוסס על הקרינה עצמאי. עקומות תגובת הריכוז של הקולטן Drosopihla sNPF הביעו transiently בתאי HEK293T לארבעה פפטידים דרוזופילה sNPF הן התוצאה מהשלוש עצמאייםasurements כל בוצע בשלושה עותקים (n ≥ 9). תגובות הניאון מוצגות כיחסי (%) לערך הגבוה ביותר (הפעלת 100%). כוכביות מצביעות על ריכוזים שלn ≤ 9. ברים שגיאה מצביעים SEM, שלפעמים הם קטנים יותר מאשר הסמלים המשמשים (במקרה זה, רק סימנים מתוארים). EC ₅₀ ערכים מוצגים עם מרווחי הביטחון של 95% שלהם.

Discussion

Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת יושם בהצלחה על מנת לאשר את האפיון הפונקציונלי של מערכת איתות peptidergic דרוזופילה sNPF, שכבר בוצעה על ידי מרטנס et al. עם assay פליטת אור ועל ידי פנג et al. עם ^13,15 assay אלקטרו. EC ₅₀ הערכים שהושגו עם assay הקרינה בתאי HEK293T הם על פי 10 פחות מאלה שהושגו עם assay פליטת אור שבוצע בתאי CHO (Drome-sNPF-1: fluo = 2.04 ננומטר, לומים = 51 ננומטר; Drome-sNPF- 2: fluo = 5.89 ננומטר, לומים = 42 ננומטר; Drome-sNPF-3: fluo = 5.55 ננומטר, לומים = 31 בננומטר; Drome-sNPF-4: fluo = 0.50 ננומטר, לומים = 75 ננומטר). ניתן להסביר וריאציות אלה על ידי מספר גורמים, לרבות העובדה כי אחת ממערכות הביטוי בשימוש עשוי להיות מתאים יותר לביטוי תפקודי של הקולטן נתון, או הקיפול של כמה קולטנים יכול להיות פחות יעיל בגסוגי תאי ertain. EC ₅₀ הערכים של כל ארבעת פפטידים Drome-sNPF הם בטווח nanomolar כאשר נבדקו על הקולטן שלהם עם שתי הקרינה וassay פליטת אור, בדרך כלל תמיכה רלוונטית הפיזיולוגית של האינטראקציה פפטיד קולטם in vivo.

שים לב שאין שליטת transfection עם הקולטן ליגנד שמפעיל ידוע נכללה במסך שהוצג כאן, כי מערכת איתות דרוזופילה sNPF היא בדרך כלל שליטת transfection במערכי ניסוי. הבקרה החיובית עם יגנד אנדוגני של תאי HEK293T (PAR ₁₎ ובקרה השלילית (לשטוף חיץ) נכללו במסך. התוצאות של PAR ₁ הראו כי התאים היו במצב טוב. הבקרה השלילית (לשטוף חיץ) לא לעורר אות ניאון, אשר מצביעה על כך שהמדיום שבו הם מומסים פפטידים היה נקי מכל מזהמים שיכולים INFluence התוצאות.

מערכת איתות דרוזופילה sNPF אפיין בעבר שימשה כאן כדי להסביר את assay גיוס סידן המבוסס על הקרינה. לצורך כך, סדרת ריכוז של ליגנד ההפעלה נבדקו באופן מיידי. עם זאת, כאשר קולטן יתום הוא הביא לביטוי היתר בassay הקרנה לבחון ספרייה המכילה מאות תרכובות, מומלץ למסך הראשון עם ריכוזים סופיים גבוהים יחסית של ליגנד (למשל., 10 או 1 מיקרומטר). בעקבות זיהוי של מתחם הפעלה, סדרת דילול של מתחם שיכולה להיות מוקרנת כדי להלחין עקומת ריכוז בתגובה ועל מנת לקבוע את ערך EC _50.

ברגע יגנד ההפעלה של קולטן נקבע, מסלול האיתות תאית יכול להיחקר יותר על ידי התאמת הפרוטוקול. Assay יכול להתבצע כפי שתואר לעיל, אך ללא שיתוף transfecting G ^5; ₁₆ למקטע. כאשר תגובת סידן נמדדה, זה אומר שזוגות קולט עם מקטע _q אנדוגני Gα של מערכת הביטוי התאי. כאשר אין אות ניאון הוא ציין, יכול להיות מיושמים על פרוטוקולים כדי למדוד שינויים בריכוזים של שליחים משניים נוספים (למשל., CAMP).

יכולים גם להתבצע מחקרי קשר בין מבנה לפעילות (SAR) להגדיר רצף הליבה של פפטיד הנדרש להפעלת קולט. ראשית, רצפים קטועים מוערכים להגדיר את רצף חומצות אמינו המינימלי של פפטיד זה הוא עדיין מסוגל להפעיל את קולט. בשלב הבא, ניתן לבדוק פפטידים שבו באופן שיטתי בכל חומצת אמינו הוחלפה לשאריות אלאנין. בדיקת סדרת אלנין-החלפה סינתטית על קולט מאפשרת לקבוע את החשיבות של כל אחת מחומצות אמינו להפעלת קולט ^24,25.

למרות השימוש התכוף שלה ואפים מוכחיםcacy, יש בו כדי להדגיש כי assay המתואר כאן עשוי צריך קצת התאמות כדי לקבל תוצאות אופטימליות לקולטנים ספציפיים של עניין. יש למקטע Gα ₁₆ היתרון כי הוא נקשר ביותר GPCRs, אלא גם עשוי להיות השפעה דומיננטית שלילית על קולטנים שאופן אנדוגני זוג באמצעות _q Gα ^22. במקרה זה, זה עשוי להיות שימושי כדי לבדוק שילובים שונים של חלבוני G באופטימיזציה של assay סיד רומן ולהשוות את התוצאות לקולטנים מצמידים _q Gα בהעדר או הנוכחות של Gα _16. מבחני אלטרנטיביים שאינם תלויים חלבון G האינטראקציה לזהות הפעלת קולטן יכולים גם להתבצע, כגון טרנסלוקציה של arrestin-GFP שכותרתו, או זיהוי של שינויים בפוטנציאל הממברנה (למשל., על ידי ערכת Assay פוטנציאל FLIPR ממברנה). חוץ מAM Fluo-4 המשמש כאן, מגוון רחב של fluorophores סידן רגיש האחר, כל אחד עם רפאים משלו וchemicמאפייני אל, הוא זמינים. Fluorophore המתאים ביותר ניתן לבחור על בסיס GPCR, סוג התא וקורא הצלחת זמין, אבל אימות ניסיוני היא הכרחית. הכמויות של ה-DNA transfected וצורך היחס מגיב DNA / transfection שייקבע עבור כל שילוב שורה מגיב תאי קולטן transfection. לבסוף, יש לזכור כי תאים בתרבית רציפה לאפשר רק 20-25 מעברים שמישים כדי לבצע את מבחני המיון.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK293T cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Trypsin-EDTA solution (0.25%)	Sigma-Aldrich	T4049
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	MP Biomedicals	195173
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose  (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
Penicillin-Streptomycin (P-S)	Sigma-Aldrich	P4333
jetPRIME	Polyplus transfection	114-01	FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies)
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392
Fibronectin from human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Reagent A100, Lysis buffer	Chemometec	910-0003
Reagent B, Stabilizing buffer	Chemometec	910-0002
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H8264
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761
NaOH (1 M)	Vel	2781
Pluronic acid	Invitrogen	P-3000MP
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1, ... (Invitrogen)
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150)	Sigma-Aldrich	Z707503 and Z707554
FlexStation device	Molecular Devices		NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom	Greiner Bio-One	655090	Corning 96-well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates
NucleoCassette	Chemometec	941-0001
NucleoCounter NC-100	Chemometec
Microcentrifuge tubes, siliconized	BioCision	BCS-2470
Polystyrene V-shaped 96-well plates	Greiner Bio-One	651101
96-Well, FlexStation pipette tips	Molecular Devices	9000-0912
Soft Max Pro software	Molecular Devices