JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Abstract

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Introduction

قدرة hPSCs للتمييز نحو أنسجة البالغين multilineage فتحت آفاقا جديدة لعلاج المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية الشديدة التي تنطوي، الكبد، البنكرياس، والنظم العصبية 1-4. أن مختلف أنواع الخلايا المشتقة من hPSCs أيضا توفير منصات الخلوية قوية لنمذجة المرض، والهندسة الوراثية، وفحص المخدرات، واختبار السمية 1،4. القضية الرئيسية التي تضمن التطبيقات السريرية والدوائية مستقبلهم هو الجيل أعداد كبيرة من hPSCs السريرية الصف من خلال زراعة الخلايا في المختبر. ومع ذلك، ونظم الثقافة الحالية هي إما غير كافية أو متغيرة بطبيعتها، تضم مختلف المغذية وخالية من تغذية ثقافات hPSCs كما المستعمرات 5،6.

مستعمرة من نوع نمو أسهم hPSCs العديد من الميزات الهيكلية من كتلة الخلايا الداخلية (ICM) الأجنة الثدييات المبكرة. الحركة الدستورية هو عرضة للتمييز في طبقات الجرثومية الثلاثفي بيئة متعددة الخلايا بسبب وجود تدرجات إشارات غير المتجانسة. وبالتالي، يعتبر اكتساب التجانس في التطور الجنيني المبكر كعملية المطلوبة للتمايز، ولكن ميزة غير المرغوب فيها من ثقافة hPSC. وغالبا ما يسببها عدم التجانس في الثقافة hPSC بواسطة إشارات أفكارك المفرطة والتمايز عفوية بسبب ظروف النمو الأمثل. وهكذا، في مستعمرة من نوع الثقافة، وكثيرا ما لوحظ الخلايا غير المتجانسة في محيط المستعمرات 7،8. وقد تبين أيضا أن الخلايا الجنينية البشرية في الخلايا الجذعية (HESC) مستعمرات الردود التفاضلية المعرض إلى إشارات الجزيئات مثل BMP-4 9. وعلاوة على ذلك، وأساليب الثقافة مستعمرة تنتج غلة الخلية المنخفض، وكذلك معدلات الاسترداد الخلية منخفضة جدا من الحفظ بالتبريد نظرا لمعدلات النمو لا يمكن السيطرة عليها وإشارات أفكارك مسارات 6،9. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت مختلف الثقافات تعليق لhPSCs زراعة، particulآرلي للتوسع كميات كبيرة من hPSCs في وحدة تغذية خالية من مصفوفة الشروط 6،10-13. من الواضح، ونظم الثقافة المختلفة لها مزاياها وعيوبها. بشكل عام، وطبيعة غير متجانسة من hPSCs تمثل واحدة من العوائق الرئيسية في مستعمرة من نوع والثقافة المجمعة الأساليب، والتي هي دون المستوى الأمثل لتقديم مواد الحمض النووي والحمض النووي الريبي في hPSCs للهندسة الوراثية 6.

ومن الواضح أن هناك حاجة ملحة لتطوير نظم جديدة أن تحايل بعض أوجه القصور في أساليب الثقافة الحالية. اكتشافات مثبطات جزيء صغير (مثل مثبط ROCK Y-27632 وJAK المانع 1) التي تعمل على تحسين البقاء على قيد الحياة وحيدة الخلية تمهيد الطريق للثقافة فصلها-hPSC 14،15. مع استخدام هذه الجزيئات الصغيرة، وقد وضعنا في الآونة الأخيرة طريقة ثقافة قائمة على نوع غير مستعمرة (NCM) نمو فصلها-hPSCs 9. هذا الأسلوب يجمع بين كل من الثقافة رواية الركض وحيدة الخلية وذات الكثافة السكانية العاليةأساليب الطلاء، مما يسمح لنا لإنتاج كميات كبيرة من hPSCs متجانسة في إطار دورات نموا ثابتا دون شذوذ الكروموسومات الرئيسية 9. بدلا من ذلك، يمكن أن تنفذ الثقافة NCM مع جزيئات صغيرة ومصفوفات محددة (مثل laminins) المختلفة من أجل تحسين الأسلوب الثقافة لتطبيقات واسعة. هنا، نقدم عدة بروتوكولات مفصلة على أساس الثقافة NCM وتحدد الإجراءات التفصيلية للهندسة الوراثية. للتدليل على براعة بروتوكولات NCM، ونحن أيضا اختبار الثقافة NCM مع مثبطات ROCK المتنوعة ومع laminin الإسوي واحد 521 (أي LN-521).

Protocol

خلية واحدة غير القائمة على مستعمرة من نوع أحادي الطبقة (NCM) ثقافة hPSCs.

1. الاستعدادات

  1. جعل 500 مل من المتوسط ​​للثقافة الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs): المتوسطة DMEM تستكمل مع FBS 10٪، 2 مم L-الجلوتامين، و 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA).
  2. عزل الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) الخلايا المشتقة من سلالة CF1 بعد بروتوكول روتيني 16 و ثقافة MEFs على 0.1٪ 6 جيدا لوحة خلية ثقافة المغلفة الجيلاتين في DMEM المتوسطة. بدلا من ذلك، شراء أسهم في مرور 3 MEF من الموارد التجارية.
  3. إعداد لوحات Matrigel.
    1. تمييع 5 مل من HESC المؤهلين Matrigel الأسهم مع 5 مل من DMEM/F12 المتوسطة (برود في ~ 4 ° C) وتخزين 50٪ مأخوذة في الفريزر -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد في الأسهم Matrigel المجمدة في الثلاجة (4 ~ ° C) O / N والمزيد من تمييع Matrigel في البرد المتوسطة DMEM/F12 (أن تؤدي إلى تركيز العمل 2.5٪).
      2. معطف 6 جيدا لوحات زراعة الخلايا مع 1.5 مل من 2.5٪ Matrigel لكل بئر، وتخزين لوحات مغلفة في الثلاجة O / N (ملاحظة: استخدام لوحة Matrigel المغلفة في غضون 2 أسابيع).
    2. إزالة لوحة Matrigel من الثلاجة، والسماح لوحة لتدفئة في RT في هود زراعة الخلايا لمدة 10 إلى 30 دقيقة (ملاحظة: لا تدفئة لوحة في حاضنة الثقافة الخلية)، ونضح DMEM المتوسطة قبل الطلاء hPSCs.
  4. جعل 500 مل HESC المتوسطة: 80٪ DMEM/F12 المتوسطة، و 20٪ KSR، 2 مم L-الجلوتامين، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، 0.1 ملم β المركابتويثانول، و 4 نانوغرام / مل من جمعية جيل المستقبل-2.
  5. تحضير 10 مل من 2X hPSC تجميد المتوسطة: 60٪ FBS، 20٪ DMSO و 20 ميكرومتر Y-27632 في mTeSR1 المتوسطة، تعقيم عن طريق الترشيح، واستخدام المتوسط ​​في حدود 1 في الاسبوع.

2 بروتوكول 1 (الأساسية): تنمو المستعمرات hPSC على مغذيات

  1. استخدام أرقام مرور MEF في 5 أو 6 (تسمى P5 P6 و) للثقافة hPSC من أجل الحصول على بالنتيجه متسقةنهاية الخبر. ميتوتيكلي تعطيل MEFs عن طريق علاج الخلايا مع 10 ميكروغرام / مل C ميتوميسين لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية، وغسل الخلايا 3x أخرى مع 1X Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (D-PBS)، ثم فصل MEFs مع 0.05٪ التربسين في 0.53 ملم EDTA. بدلا من ذلك، أشرق MEFs بجرعة 8،000 راد مع irradiator الأشعة السينية.
  2. حساب الأرقام الخلية باستخدام التريبان الأزرق طريقة وصمة عار الإقصاء تحت المجهر. بدلا من ذلك، استخدام عداد الخلايا التلقائي.
  3. لوحة MEFs المشع على لوحات البوليسترين 6 جيدا المغلفة مع الجيلاتين 0.1٪ في كثافة 1.88 × 10 5 خلايا لكل بئر (أي 1.96 × 10 4 خلية / سم 2). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
  4. إزالة مستنبت MEF بواسطة الشفط مع ماصة باستور (ملاحظة: لا يغسل الخطوات اللازمة في هذا الوقت).
  5. المستعمرات يسحن hPSC من الثقافة السابقة في كتل صغيرة، ودراسة كتل تحت المجهر لضمان أحجامها تتراوح الابام 50-100 ميكرون في أقطار، وكتل لوحة hPSC على الجزء العلوي من طبقات MEF المغذية في واحدة تحتوي أيضا 2 مل من hPSC المتوسط.
  6. تغيير HESC المتوسطة يوميا لمدة 3 إلى 5 أيام، والنمو مستعمرة سجل عن طريق الصورة، علامة على أي مستعمرات تغييرها شكليا أو متمايزة (~ 5٪)، ويدويا إزالة المستعمرات التي تميزت تطلع بلطف مع ماصة باستور.
  7. شطف المستعمرات المتبقية على MEFs مرتين (2 دقيقة لكل منهما مع مد برنامج تلفزيوني)، واحتضان المستعمرات مع 2 مل من 1 ملغ / مل كولاجيناز الرابع في hPSC متوسطة لمدة 10 إلى 30 دقيقة)، ودراسة مفرزة من المستعمرات hPSC من سطح MEF المغلفة (ملاحظة: استخدام مكشطة للمساعدة في عملية مفرزة إلا إذا تعلق المستعمرات بإحكام لوحة).
  8. إضافة 5 مل من hPSC المتوسطة إلى كل بئر للحد من التفاعلات الإنزيمية، المستعمرات نقل إلى أنبوب 15 مل، والسماح للمستعمرات hPSC الرواسب لمدة 3 إلى 5 دقائق على RT، وضمان الترسيب من المستعمرات التي كتبها التصور المباشر من جأذرع في الجزء السفلي من الأنبوب (ملاحظة: لا أنبوب الطرد المركزي في هذه الخطوة).
  9. إزالة supernatants تحتوي على MEFs المتبقية وفصل الخلايا واحد، resuspend والمستعمرات مع 5 مل من HESC المتوسطة، وكرر الخطوة الترسيب مرتين.
  10. إزالة المتوسطة، المستعمرات hPSC يسحن إلى كتل صغيرة، وتخزينها في 1X hPSC تجميد المتوسطة (أو CryoStore CS10 المتوسطة التجميد) لحفظ البرودة (1 متكدسة جيدا في قنينة مجمدة) أو لوحة على لوحة 6 جيدا لالركض الخلية.

3 بروتوكول 2: تحويل hPSC المستعمرات من مغذيات لNCM

  1. شطف الكريات hPSC في مد PBS مرة واحدة، واحتضان الكريات مع 1 مل من 1X Accutase لمدة 10 دقيقة، ودراسة رد الفعل الأنزيمية تحت المجهر للتأكد من التفكك وحيدة الخلية.
  2. إنهاء التفاعلات الإنزيمية عن طريق إعادة التعليق بلطف الخلايا في 5 مل من mTeSR1 المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 تليها الطرد المركزي في 200 x ج في RT لمدة 5 دقائق(ملاحظة، لا تستخدم القوات الطرد المركزي المفرطة التي تسبب تلف الخلايا).
  3. إضافة 5 مل من mTeSR1 المتوسطة إلى بيليه، resuspend الكرية كما الخلايا واحدة، ومرشح فصل الخلايا من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر (لإزالة أي خلايا المجاميع المتبقية).
  4. البذور 1،3-2 × 10 6 hPSCs في بئر واحدة (1،4-2،1 × 10 5 خلية / سم 2) من لوحة 6 جيدا المغلفة مع 2.5٪ HESC المؤهلين Matrigel، إضافة mTeSR1 المتوسطة ما يصل الى 2.5 مل، وتشمل 10 ميكرومتر Y-27632 في المتوسط ​​(لتسهيل الأولي 24 ساعة الطلاء وحيدة الخلية). بدلا من ذلك، استخدام الجزيئات الصغيرة التالية لاستبدال 10 ميكرومتر Y-27632 لتعزيز وحيدة الخلية تصفيح: 1 ميكرومتر Y-39983 (ROCK أنا المانع)، 1 ميكرومتر phenylbenzodioxane (ROCK الثاني المانع)، 1 ميكرومتر thiazovivin (أ ROCK المانع رواية) ، و 2 ميكرومتر المانع JAK 1.
  5. استبدال المتوسطة مع خالية من المخدرات mTeSR1 المتوسطة في اليوم التالي (في غضون 24 ساعة)، فصل الخلايا من واحد إضافيأيضا، وحساب عدد الخلايا لتحديد خلية واحدة كفاءة الطلاء (ملاحظة: حوالي 50 إلى 90٪ من خلية واحدة والطلاء الكفاءة التي يمكن تحقيقها في هذه المرحلة).
  6. تسمح للخلايا أن تنمو باعتبارها شكلت خلية واحدة أحادي الطبقة لبضعة أيام مع 3 مل من mTeSR1 المتوسط. تغيير المتوسطة اليومية.
  7. تجريبيا تحديد جدول زمني لالركض تكييفها NCM اعتمادا على كثافة الخلية. مرور عندما يصل نمو الخلايا التقاء في اليوم 3 أو 4 أيام، أو في نقطة زمنية 4 ساعة بعد اختفاء الخلية الى خلية الحدود. فصل الخلايا في 1 مل من Accutase، استخدم 1-3 نسبة تقسيم (أي 1 متكدسة جيدا من الخلايا مطلي في 3 آبار من لوحة 6 جيدا) لالركض الخلايا، وتحقيق الاستقرار تكييفها NCM بنسبة 5 مقاطع.
  8. تجميد الخلايا
    1. الاستفادة من بئر واحدة متموجة (5-6 ~ X10 6 خلايا) لقنينة واحدة مجمدة: فصل خلايا متكدسة من بئر واحدة مع 1 مل من Accutase لمدة 10 دقيقة.
    2. تمييع ثإيث 5 مل من الخلايا المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي mTeSR1 كما هو موضح أعلاه.
    3. resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من mTeSR1 المتوسطة ثم قم بإضافة ببطء 500 ميكرولتر من 2X hPSC تجميد المتوسطة (التي تحتوي على 20 ميكرومتر Y-27632) في قارورة الحفظ بالتبريد. بدلا من ذلك، resuspend الخلايا في 1X hPSC تجميد المتوسطة التي تحتوي على 2 ميكرومتر المانع JAK 1 أو 1X CryoStor CS10 المتوسطة في وجود إما 10 ميكرومتر Y-27632 أو 2 ميكرومتر المانع JAK 1.
    4. وضع قارورة المجمدة إلى cryocontainer الجليد المبرد (شغل القاع مع isopranol) ونقل cryocontainer إلى -80 ° C الثلاجة على الفور.
    5. نقل الخلايا من الفريزر -80 درجة مئوية إلى خزان النتروجين السائل (في اليوم التالي) لحفظ البرودة على المدى الطويل.
  9. ذوبان الخلية
    1. استخدام واحد قارورة الحفظ بالتبريد لتصفيح 1 بئر من لوحة 6 جيدا.
    2. قبل الدافئة المتوسطة mTeSR1 في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وخلايا ذوبان الجليد في نفس الحمام المائي لمدة 2 دقيقة،إسقاط الحكيم إضافة خلايا إلى 5 مل من قبل تحسنت المتوسطة mTeSR1 تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632، وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه.
    3. resuspend بلطف الخلايا الكريات مع 2 مل من mTeSR1 المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 وببطء نقل الخلايا إلى بئر المغلفة مسبقا مع Matrigel (ملاحظة: تجنب إنتاج فقاعات الهواء).
    4. تغيير متوسطة يوميا ونتوقع نموا hPSC للوصول إلى نقطة التقاء في اليوم 3 أو 4.

4 بروتوكول 3: تحويل hPSC المستعمرات على Matrigel لNCM الثقافة

  1. إزالة لوحة Matrigel المغلفة من الثلاجة، ووضع لوحة في الثقافة هود الأنسجة لمدة 10 إلى 30 دقيقة، وإزالة المتوسطة من كل بئر من لوحة، وإضافة 2 مل من قبل تحسنت المتوسطة mTeSR1 إلى كل بئر.
  2. نقل كتل hPSC المسحوقة من الثقافة المغذية (الخطوة 2.10 البروتوكول الأساسية) إلى لوحة Matrigel أعلاه. إضافة mTeSR1 المتوسطة ما يصل الى 2.5 مل الحجم النهائي في كل بئر.
  3. تغيير متوسطة يوميا لمدة 3 إلى 4 أيامق حتى مستعمرات تصل إلى 80 إلى 90٪ التقاء.
  4. لالركض الخلية: شطف المستعمرات مع D-PBS مرتين، علاج الخلايا مع 1 مل من 2 ملغ / مل dispase عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة، والرواسب ومرور الخلايا كما كتل.
  5. للثقافة NCM: تكرار الخطوات 3،1-3،9 الموصوفة في البروتوكول 2.

5 بروتوكول 4: NCM ثقافة hPSCs على LN-521

  1. ذوبان الجليد في المؤتلف LN-521 الحل في 4 درجات مئوية قبل يوم من الاستخدام ويجعل الحل laminin طلاء (LCS) من خلال تمييع laminin إذابة مع 1X PBS-D (التي تحتوي على الكالسيوم 2 + / + 2 ملغ) إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل.
  2. إضافة 1 مل من LCS لاحد جيد في لوحة 6 جيدا (ملاحظة: تجنب الجفاف من خلال عملية الطلاء).
  3. ختم لوحة المغلفة مع parafilm لمنع التبخر وتخزينها في الثلاجة لوحة (4 ° C) O / N (ملاحظة: استخدام لوحة في حدود 1 في الاسبوع).
  4. بلطف إزالة LCS مع ماصة باستور دون لuching السطح المطلي وإضافة 2 مل من mTeSR1 المتوسط ​​إلى واحد أيضا.
  5. تدفئة جميع الحلول الثقافة (بما في ذلك مد PBS) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
  6. تحويل المستعمرات إلى hPSC NCM
    1. فصل الركام الخلية إلى الخلايا واحد مع Accutase كما هو موضح في البروتوكول 2.
    2. البذور 1،3-2 × 10 6 hPSCs في واحدة LN-521-المغلفة جيدا (1،4-2،1 × 10 5 خلية / سم 2) من دون وجود مثبطات ROCK.
    3. تغيير متوسطة يوميا لمدة 3 إلى 4 أيام.
    4. فصل الخلايا في 1 مل من Accutase في اليوم 3 أو 4 لالركض الخلية التالية باستخدام 1-3 نسبة تقسيم.

6 بروتوكول 5: NCM الثقافة للDNA البلازميد ترنسفكأيشن

  1. التكيف مع المستعمرات hPSC للثقافة NCM كما هو موضح في البروتوكولات 2-4.
  2. لوحة فصلها hPSCs في 12 لوحة جيدا مع كثافة خلية من 7.5 × 10 5 خلية / جيدا في mTeSR1 المتوسطة في ظل وجود 10 ميكرومتر Y-27632.
  3. استبدال mTeSR1 المتوسطة مع خالية من المخدرات mTeSR1 المتوسطة بين 4-8 ساعة بعد الطلاء الخلايا.
  4. لكل ترنسفكأيشن، وتمييع 2.5 ميكروغرام من البلازميدات التعبير (على سبيل المثال، pmaxGFP) و 5 ميكرولتر من Lipofectamine عام 2000 في أنابيب إيبندورف منفصلة في 125 ميكرولتر من كل غروب MEM المصل انخفاض متوسط.
  5. بعد 5 دقائق، مزج الكواشف المخفف واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT (على شكل مجمعات ترنسفكأيشن).
  6. إضافة 250 ميكرولتر المجمعات ترنسفكأيشن لتحتوي كل منها على hPSCs جيدا في 1 مل mTeSR1 المتوسطة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لمدة 24 ساعة.
  7. دراسة كفاءة ترنسفكأيشن تحت المجهر مضان وصورة عشوائيا لحساب كفاءة ترنسفكأيشن الفعلي.

7 بروتوكول 6: NCM الثقافة للترنسفكأيشن من MicroRNAs

  1. فصل hPSCs شبه متموجة في يوم 2 في ظل ظروف NCM بإضافة 1 مل من Accutase لكل بئر في 6 جيدا لوحة.
  2. إضافة 10 مل من mTeSR1 المتوسطة لتخفيف التفاعلات الإنزيمية وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
  3. resuspend الكرية الخلية مع mTeSR1 المتوسطة، البذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 7.5 × 10 5 خلايا لكل بئر في لوحة 12 جيدا في mTeSR1 المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632، والسماح للخلايا نعلق لمدة 4 ساعة.
  4. استبدال المتوسطة مع خالية من Y27632 mTeSR1 المتوسط.
  5. استخدام المتاحة تجاريا microRNAs (على سبيل المثال، وعدم استهداف miRIDIAN ميرنا تحكم ترنسفكأيشن المسمى مع Dy547). يعاير بتركيزات تتراوح 0-160 نانومتر باستخدام الكواشف المقدمة واتباع تعليمات الصانعين.
  6. تحسين كفاءة ترنسفكأيشن لكل تركيز في خطوط hPSC عن طريق التصوير مضان Dy547 من الخلايا الحية تحت المجهر في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
  7. حساب الكفاءة ترنسفكأيشن على أساس النسبة المئوية للخلايا إيجابية Dy547 على جميع الخلايا المصورة.
. TLE "> 8 بروتوكول 7: NCM الثقافة للتنبيغ من ناقلات Lentiviral

  1. كرر الخطوات من 7،1-7،4 البروتوكول 6.
  2. حساب كميات من الجسيمات الفيروسية لاستخدامها في تنبيغ: استخدام الصيغة التالية: = TU (وزارة الداخلية س CN) / VT، في حين TU يدل على العدد الإجمالي من وحدات تحويل، وزارة الداخلية يساوي تعدد المطلوب من العدوى في البئر (وزارة الداخلية أو TU / خلية)، CN يحدد عدد الخلايا في كل بئر، وVT يشير الأسهم التتر الفيروسية (TU / مل). على سبيل المثال، بالنظر إلى أن الأسهم التتر الفيروسية لSMART-shRNA ناقلات يساوي 1 × 10 9 TU / مل (وحدات تحويل لكل مل)، 7.5 × 10 5 خلايا لكل بئر في وقت تنبيغ، وزارة الداخلية المتوقعة من 20: استخدام 15 ميكرولتر من الأسهم الجسيمات الفيروسية لكل بئر (ملاحظة: ينصح هذا الشرط لعابرة lentiviral الاستقراء).
  3. قبل الدافئة 300 ميكرولتر من mTeSR1 المتوسطة مع 10 ملغ / مل من polybrene لمدة 30 دقيقة.
  4. إضافة 15 ميكرولتر من الجسيمات الفيروسية في الأسهمالمتوسط ​​mTeSR1 قبل حرارة تحتوي على polybrene والمزيج بلطف الحل.
  5. استبدال مستنبت الخلايا مع 300 ميكرولتر من المتوسطة prewarmed تحتوي على جسيمات فيروسية.
  6. بعد 4 ساعات الحضانة، دراسة turboGFP مضان (صانع للshRNA التعبير) لتحديد كفاءة تنبيغ.
  7. إضافة 300 ميكرولتر من المتوسطة mTeSR1 إضافية إلى transducing بشكل جيد عندما تبدأ الخلايا في التعبير عن turboGFP.
  8. بعد 12-16 ساعة الحضانة، وإعادة النظر توربو GFP التعبير.
  9. أداء المطلوب التجارب المتابعة مع هذه الخلايا transduced في غضون 72 ساعة.

النتائج

والمخطط العام للثقافة NCM

يمثل الشكل 1 نموذجي NCM الثقافة مخطط يوضح التغيرات الدينامية من hPSCs بعد ارتفاع الكثافة الطلاء وحيدة الخلية في وجود المانع ROCK Y-27632. وتشمل هذه التغييرات المورفولوجية وصلات بين الخلايا بعد ا?...

Discussion

هناك طريقتان الرئيسية لhPSCs الثقافة في المختبر: الثقافة التقليدية مستعمرة من نوع (الخلايا على مغذيات أو مصفوفات خارج الخلية) والثقافة تعليق hPSCs كما المجاميع دون مغذيات 6. وتشمل القيود المفروضة على حد سواء من نوع المستعمرة وتعليق وسائل الثقافة التجانس المترا...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) at the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. We would like to thank Dr. Ronald D. McKay for his discussion and comments on this project.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Countess automated cell counterInvitrogen Inc.C10227Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray SystemFaxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL Model RX-650X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL 6-well platesBecton Dickinson Labware353046Polystyrene plates
DMEMInvitrogen Inc.11965–092For MEF medium
Mitomycin CRoche107409Mitotic inhibitor
TrypsinInvitrogen Inc.25300-054For MEF dissociation
DMEM/F12Invitrogen Inc.11330–032For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Invitrogen Inc.31985-062For hPSC transfection
Heat-inactivated FBSInvitrogen Inc.16000–044Component of MEF medium
Knockout Serum ReplacementInvitrogen Inc.10828–028KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SalineInvitrogen Inc.14190-144D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acidsInvitrogen11140–050NEAA, component of hPSC medium
L-GlutamineInvitrogen 25030–081Component of hPSC medium
mTeSR1 & SupplementsStemCell Technologies5850Animal protein-free
TeSR2 & SupplementsStemCell Technologies5860Xeno-free medium
β-mercaptoethanolSigma M7522Component of hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC		American Type Culture Collection (ATCC) SCRC-1040For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified MatrigelBD Bioscience354277For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521BioLaminaLN521-02Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic)R&D Systems, MN223-FBGrowth factor in hPSC medium
CryoStor CS10StemCell Technologies7930
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-1041X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor IEMD4 Biosciences420099An inhibitor of Janus kinase
Y-27632EMD4 Biosciences688000ROCK inhibitor
Y-27632Stemgent04-0012ROCK inhibitor
Y-39983Stemgent04-0029ROCK I inhibitor
PhenylbenzodioxaneStemgent04-0030ROCK II inhibitor
ThiazovivinStemgent04-0017A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell StrainerBD Bioscience35234040 µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °CThermo Scientific C6516F-1“Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000Invitrogen Inc.11668-027Transfection reagents
DharmaFECT DuoThermo ScientificT-2010-02Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection ControlThermo ScientificIP-004500-01-05Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs 
SMART-shRNAThermo Scientific To be determinedLentiviral vector
pmaxGFPamaxa Inc (Lonza)Included in every transfection kitExpression plasmid for transfection control
Oct-4Santa Cruz Biotechnologysc-5279Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1Santa Cruz Biotechnologysc-21702Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4Santa Cruz Biotechnologysc-21704Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60Santa Cruz Biotechnologysc-21705 Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81Santa Cruz Biotechnologysc-21706Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51)Santa Cruz Biotechnologysc-8020Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoproteinSanta Cruz Biotechnologysc-8399AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19)Santa Cruz Biotechnologysc-9187FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1)Thermo ScientificMS-295-P0Mouse IgG1
DesminThermo ScientificRB-9014-P1Rabbit IgG
Anti-NANOGReproCELL Inc, JapanRCAB0004P-FPolyclonal antibody 
Rat anti-GFAPZymed13-0300Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3)Cedarlane Laboratories Ltd.CL2513AMouse IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4)DakoCytomation IncIR611/IS611Mouse IgG2a
NestinChemicon InternationalMAB5326Rabbit polyclonal antibody
TUBB3Convance IncMMS-435PTuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12)Cell Signaling Technologies3113Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution)Electron Microscopy Sciences15710PFA, fixative, diluted in D-PBS

References

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167 (2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

89 Y 27632

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved