Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

Resumen

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Resumen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Introducción

La capacidad de hPSCs para diferenciar hacia los tejidos adultos multilinaje ha abierto nuevas vías para el tratamiento de pacientes que sufren de enfermedades graves que involucran cardiovasculares, hepáticas, pancreáticas, y los sistemas neurológicos ^1-4. Varios tipos de células derivadas de hPSCs también proporcionarían plataformas móviles robustos para el modelado de la enfermedad, la ingeniería genética, la detección de drogas y ^1,4 pruebas toxicológicas. La cuestión clave que garantiza sus futuras aplicaciones clínicas y farmacológicas es la generación de un gran número de hPSCs de grado clínico a través de cultivo celular in vitro. Sin embargo, los sistemas de cultivo actuales son insuficientes o intrínsecamente variables, diversos cultivos de alimentación y libres de alimentador de hPSCs como colonias ^5,6.

Crecimiento de tipo colonia de acciones hPSCs muchas características estructurales de la masa celular interna (ICM) de embriones de mamíferos tempranos. El ICM es propenso a diferenciarse en las tres capas germinalesen un entorno multicelular debido a la existencia de gradientes de señalización heterogéneos. Por lo tanto, la adquisición de la heterogeneidad en el desarrollo embrionario temprano se considera como un proceso necesario para la diferenciación, pero una característica no deseada de la cultura HPSC. La heterogeneidad en la cultura HPSC es a menudo inducida por señales apoptóticas excesivas y diferenciación espontánea debido a las condiciones de crecimiento subóptimas. Por lo tanto, en el tipo de colonia de cultivo, las células heterogéneas se observan a menudo en la periferia de las colonias ^7,8. También se ha demostrado que las células en células madre embrionarias (células madre) colonias de respuestas diferenciales de exposición a moléculas de señalización tales como ^BMP-9 4. Por otra parte, los métodos de cultivo de colonias producen rendimientos bajos de células, así como las tasas de recuperación muy bajo de células de la criopreservación, debido a las tasas de crecimiento incontrolable y señalización apoptótica pathways ^6,9. En los últimos años, diversos cultivos en suspensión han sido desarrollados para hPSCs de cultivo, particulArly para la expansión de grandes cantidades de hPSCs en subordinado, y las condiciones de matriz libre ^6,10-13. Obviamente, diferentes sistemas de cultivo tienen sus propias ventajas y desventajas. En general, la naturaleza heterogénea de hPSCs representa uno de los principales inconvenientes en los métodos de tipo colonia y cultura agregada, que son subóptimas para la entrega de materiales de ADN y de ARN en hPSCs para la ingeniería genética ^6.

Claramente, existe una necesidad imperiosa de desarrollar nuevos sistemas que evitan algunas deficiencias de los métodos de cultivo actuales. Los descubrimientos de inhibidores de moléculas pequeñas (como el inhibidor de la ROCA Y-27632 y JAK inhibidor 1) que mejoran la supervivencia de una sola célula preparan el terreno para el cultivo disociado-HPSC ^14,15. Con el uso de estas moléculas pequeñas, hemos desarrollado recientemente un método de cultivo basado en el tipo no-colonia (NCM) de crecimiento de-hPSCs disociadas ^9. Este método de cultivo de la novela combina pases de una sola célula y de alta densidadchapado métodos, que nos permite producir grandes cantidades de hPSCs homogéneas bajo ciclos de crecimiento consistentes sin mayores anomalías cromosómicas ^9. Alternativamente, la cultura NCM podría ser implementado con diferentes moléculas pequeñas y matrices definidas (tales como lamininas) con el fin de optimizar el método de cultivo para amplias aplicaciones. A continuación, presentamos varios protocolos de detalle sobre la base de la cultura NCM y delinear los procedimientos detallados para la ingeniería genética. Para demostrar la versatilidad de los protocolos de NCM, también a prueba la cultura NCM con inhibidores de ROCK diversos y con la única isoforma laminina 521 (es decir, LN-521).

Protocolo

Basada en células Individual tipo no colonia monocapa (NCM) cultura de hPSCs.

1. Preparación

1. Hacer 500 ml de medio de cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs): medio DMEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, y 0,1 mM de aminoácidos no esenciales (NEAA).
2. Aislar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) células derivadas de la cepa CF1 siguiendo un protocolo de rutina ¹⁶ y la cultura MEFs en 0,1% 6-así placa de cultivo celular recubierto con gelatina en medio DMEM. Alternativamente, comprar acciones del MEF en el paso 3 de los recursos comerciales.
3. Preparar placas Matrigel.
   1. Diluir 5 ml de células madre calificado Matrigel acción con 5 ml de medio DMEM/F12 (refrigerado a ~ 4 ° C) y la tienda de un 50% de alícuotas en un -20 ° C congelador. Descongelar la Matrigel de stock congelado en un refrigerador (~ 4 ° C) O / N y más diluir el Matrigel en medio DMEM/F12 frío (para dar lugar a una concentración de trabajo 2,5%).
   2. Coat 6-y placas de cultivo celular con 1,5 ml de 2,5% de Matrigel por pocillo, almacenar las placas recubiertas en el refrigerador O / N (Nota: utilizar la placa recubierta con Matrigel dentro de 2 semanas).
   3. Retire la placa de Matrigel del refrigerador, deje que la placa se caliente a temperatura ambiente en la campana de cultivo de células de 10 a 30 min (Nota: no calentar la placa en una incubadora de cultivo celular), y aspirar DMEM medio antes de chapado hPSCs.
4. Hacer 500 ml de medio de células madre: 80% medio DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM de L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 0,1 mM de β-mercaptoetanol, y 4 ng / ml de FGF-2.
5. Preparar 10 ml de 2X HPSC medio de congelación: 60% de SFB, 20% de DMSO y 20 M Y-27632 en medio mTeSR1, esterilizar por filtración, y utilizar el medio plazo de 1 semana.

. 2 Protocolo 1 (Básico): Crecen HPSC Colonias en Alimentadores

1. Use los números de paso del MEF a las 5 o 6 (designado como P5 y P6) para la cultura HPSC el fin de obtener resul consistentets. Mitóticamente inactivar MEFs mediante el tratamiento de las células con 10 g / ml de mitomicina C durante 3 horas a 37 ° C, se lavan las células 3 veces con fosfato solución salina tamponada con 1X de Dulbecco (D-PBS), y a continuación se disocian los MEFs con 0,05% de tripsina en 0,53 mM EDTA. Alternativamente, irradiar MEFs a una dosis de 8.000 rads con un irradiador de rayos X.
2. Contar el número de células usando el método de exclusión con tinción de azul de tripano bajo el microscopio. Como alternativa, utilice un contador de células automático.
3. Placa MEFs irradiadas en placas de poliestireno de 6 pocillos recubiertas con 0,1% de gelatina a una densidad de 1,88 x 10 ⁵ células por pocillo (es decir, 1,96 x 10 ⁴ células / cm ^2). Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante 24 horas.
4. Retire el medio de cultivo MEF mediante aspiración con una pipeta Pasteur (Nota: no hay pasos de lavado necesarios en este momento).
5. Colonias Triturar HPSC de cultivo previo en pequeños grupos, examinan los grumos con el microscopio para asegurar que sus tamaños que van from 50 a 100 micras de diámetro, y la placa grumos HPSC en la parte superior de las capas alimentadoras MEF en un pocillo que contiene 2 ml de medio HPSC.
6. Cambie hESC medio día durante 3 a 5 días, récord de crecimiento de colonias por fotografía, marcar cualquier colonias morfológicamente alterados o diferenciados (~ 5%), y quitar manualmente las colonias marcadas por aspiración suave con una pipeta Pasteur.
7. Enjuague las colonias restantes en MEFs dos veces (2 min cada uno con D-PBS), e incubar las colonias con 2 ml de 1 mg / ml de colagenasa IV en medio HPSC durante 10 a 30 min), y examinar el desprendimiento de colonias HPSC de la superficie recubierta-MEF (Nota: use un raspador para ayudar al proceso de desprendimiento sólo si las colonias están estrechamente unidos a la placa).
8. Añadir 5 ml de medio de HPSC a cada pocillo para minimizar las reacciones enzimáticas, las colonias de la transferencia a un tubo de 15 ml, permitir colonias HPSC sedimentar durante 3 a 5 min a TA, y garantizar la sedimentación de colonias por visualización directa de la Cells en la parte inferior del tubo (Nota: No centrifugue el tubo en este paso).
9. Retire los sobrenadantes que contienen MEFs residuales y disociada células individuales, volver a suspender las colonias con 5 ml de medio de células madre, y repetir la etapa de sedimentación en dos ocasiones.
10. Retire las medianas, las colonias se tritura HPSC en pequeños grupos, tienda en 1X HPSC medio de congelación (o medio de congelación CryoStore CS10) para la crioconservación (1 confluentes bien por vial congelado) o la placa en una placa de 6 pocillos de pases celulares.

3 Protocolo 2:. Convertir HPSC Colonias de Comederos para NCM

1. Enjuague pellets de HPSC en D-PBS una vez, incubar los gránulos con 1 ml de 1X Accutase durante 10 min, y examinar la reacción enzimática bajo un microscopio para asegurarse de disociación de una sola célula.
2. Terminar las reacciones enzimáticas resuspendiendo suavemente las células en 5 ml de medio mTeSR1 que contiene 10 mM de Y-27632 seguido por centrifugación a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 min(Nota, no utilice fuerzas de centrifugación excesivas que causan daño celular).
3. Añadir 5 ml de medio mTeSR1 al sedimento, resuspender el precipitado como células individuales, y el filtro se disoció las células a través de un filtro de células de 40 m (para eliminar cualquier agregados celulares residuales).
4. Semillas 1,3-2 x 10 ⁶ hPSCs en un pocillo (1.4 a 2.1 x 10 ⁵ células / cm ²⁾ de una placa de 6 pocillos recubiertos con el 2,5%-hESC calificado Matrigel, añadir medio mTeSR1 hasta 2,5 ml, y se compone de 10 M Y-27632 en el medio (para facilitar la 24 hr placa inicial de una sola célula). Como alternativa, utilice los siguientes moléculas pequeñas para reemplazar 10 M Y-27632 para mejorar chapado de una sola célula: 1 M Y-39983 (ROCK I inhibidor), 1 phenylbenzodioxane mM (inhibidor ROCA II), 1 mM thiazovivin (un inhibidor de la ROCA novela) , y el inhibidor de JAK 2 M 1.
5. Sustituya el medio con medio mTeSR1 libre de drogas, al día siguiente (dentro de las 24 horas), disociar las células de una extraasí, y contar el número de células para determinar eficiencia de plaqueo de una sola célula (Nota: aproximadamente, 50 a 90% de eficiencia de deposición electrolítica de una sola célula que se puede lograr en esta etapa).
6. Permita que las células crezcan como una sola célula-formado monocapa durante unos días con 3 ml de medio mTeSR1. Cambio de medio al día.
7. Empíricamente determinar el calendario de pases adaptado NCM dependiendo de la densidad celular. Pasaje cuando el crecimiento celular alcanza la confluencia en el día 3 o 4 días, o en el punto de tiempo de 4 horas después de la desaparición de las fronteras de célula a célula. Disociar las células en 1 ml de Accutase, utilizar una relación de división de 1 a 3 (es decir, 1 confluentes bien de células cultivadas en placas en 3 pocillos de placa de 6 pocillos) para los pases de células, y estabilizar adaptado NCM por 5 pasajes.
8. Congelación de la célula
   1. Utilizar un pozo confluente (~ 5-6 x10 ⁶ células) para un vial congelado: disociar las células de un confluente bien con 1 ml de Accutase durante 10 min.
   2. Diluir wITH 5 ml de células medianas y centrifugar mTeSR1 como se describió anteriormente.
   3. Resuspender el sedimento en 500 l de medio de mTeSR1 y luego añadir lentamente 500 l de 2X HPSC medio de congelación (que contienen 20 mM de Y-27632) en un vial de crioconservación. Alternativamente, resuspender las células en 1X HPSC medio de congelación que contienen inhibidor de JAK 2 M 1 o medio 1X CryoStor CS10 en presencia de ya sea 10 M Y-27632 o 2 inhibidor de JAK M 1.
   4. Coloque los viales congelados en un recipiente criogénico enfriada con hielo (abajo llena con isopranol) y transferir el recipiente criogénico a -80 ° C congelador inmediatamente.
   5. Células de transferencia del -80 ° C congelador a un tanque de nitrógeno líquido (al día siguiente) para la crioconservación a largo plazo.
9. Descongelación celular
   1. Utilizar un vial de crioconservación para recubrir 1 pocillo de una placa de 6 pocillos.
   2. Medio mTeSR1 Pre-caliente en un baño de agua a 37 ° C durante 10 min, las células de deshielo en el mismo baño de agua durante 2 min,gota a gota añadir células a 5 ml de medio mTeSR1 pre-calentado que contienen 10 mM de Y-27632, y se centrifuga como se describió anteriormente.
   3. Resuspender suavemente los sedimentos de células con 2 ml de medio mTeSR1 que contienen 10 mM de Y-27632 y transferir lentamente las células a un pocillo de pre-recubierta con Matrigel (Nota: evitar la producción de burbujas de aire).
   4. Cambiar medio diario y esperamos que el crecimiento HPSC alcanzar confluencia en el día 3 o 4.

4 Protocolo 3:. Convertir HPSC colonias en Matrigel a NCM Cultura

1. Quitar una placa recubierta con Matrigel del refrigerador, coloque la placa en la campana de cultivo de tejidos de 10 a 30 min, se elimina el medio de cada pocillo de la placa, y añadir 2 ml de medio mTeSR1 precalentado a cada pocillo.
2. Transferencia trituró grupos HPSC de la cultura alimentador (Paso 2,10 del protocolo básico) a la placa de Matrigel anteriormente. Añadir medio mTeSR1 hasta 2,5 ml de volumen final en cada pocillo.
3. Cambie medio diario del 3 al 4 díass hasta que las colonias alcanzan 80 a 90% de confluencia.
4. Para pases de células: aclarar las colonias con D-PBS dos veces, el tratamiento de las células con 1 ml de 2 mg / ml dispasa a 37 ° C durante 15 a 20 minutos, y de sedimentos y de paso de células en forma de grumos.
5. Para la cultura NCM: repita los pasos 3.1 a 3.9 describen en el Protocolo 2.

5 Protocolo 4:. NCM Cultura de hPSCs sobre LN-521

1. Descongelar la solución recombinante LN-521 a 4 ° C antes de que el día de uso y hacer que la solución de revestimiento laminina (LCS) diluyendo la laminina descongelado con 1X D-PBS (que contiene Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +)} a una concentración final de 10 g / ml.
2. Añadir 1 ml de la LCS a un pocillo de placa de 6 pocillos (nota: evitar en seco durante el proceso de recubrimiento).
3. Sellar la placa recubierta con Parafilm para evitar la evaporación y almacenar el plato en el refrigerador (4 ° C) O / N (nota: utilizar la placa dentro de 1 semana).
4. Retire con cuidado los LCS con una pipeta Pasteur y sin queuching la superficie recubierta y añadir 2 ml de medio mTeSR1 a un pocillo.
5. Calentar todas las soluciones de cultivo (incluyendo D-PBS) en un baño de agua a 37 ° C durante 25 min.
6. Convertir colonias HPSC a NCM
   1. Disociar agregados celulares de células individuales con Accutase como se describe en el Protocolo 2.
   2. Semillas 1,3-2 x 10 ⁶ hPSCs en una sola LN-521 con revestimiento de pozo (1.4 a 2.1 x 10 ⁵ células / cm ^2), sin la presencia de inhibidores de ROCK.
   3. Cambio de medio al día durante 3 a 4 días.
   4. Disociar las células en 1 ml de Accutase en el día 3 o 4 para la próxima pases de células utilizando una relación de división de 1 a 3.

. 6 Protocolo 5: NCM cultura para el ADN plásmido transfección

1. Adaptar colonias HPSC a la cultura NCM como se describe en los Protocolos 2 a 4.
2. Placa disociado hPSCs en placa de 12 pocillos con una densidad celular de 7,5 x 10 ⁵ células / pocillo en medio mTeSR1 en presencia de 10 mM de Y-27632.
3. Reemplace medio mTeSR1 con medio mTeSR1 libre de drogas entre 4-8 horas después de la siembra de las células.
4. Para cada transfección, diluir 2,5 g de plásmidos de expresión (por ejemplo, pmaxGFP) y 5 l de Lipofectamine 2000 en tubos Eppendorf separados en 125 l de cada uno de Opti-MEM medio de suero reducido.
5. Después de 5 min, mezclar los reactivos diluidos y se incuba durante 20 min a TA (para formar complejos de transfección).
6. Agregue los complejos de transfección mu l 250 a cada pocillo que contiene hPSCs en 1 ml de medio mTeSR1 e incubar las células a 37 ° C en una incubadora de CO ₂ durante 24 horas.
7. Examinar la eficacia de la transfección con un microscopio de fluorescencia y la fotografía al azar para el cálculo de la eficiencia de transfección real.

. 7 Protocolo 6: NCM Cultura para la transfección de microARNs

1. Disociar hPSCs semi-confluentes en el día 2, en condiciones NCM añadiendo 1 ml de Accutase por pocillo en 6 Y placa.
2. Añadir 10 ml de medio mTeSR1 para diluir las reacciones enzimáticas y centrifugar a 200 xg durante 5 min.
3. Resuspender el sedimento celular con medio mTeSR1, sembrar las células a una densidad de 7,5 x 10 ⁵ células por pocillo en una placa de 12 pocillos en un medio que contiene 10 mM mTeSR1 Y-27632, y dejar que las células se adhieren durante 4 horas.
4. Sustituya el medio con medio Y27632 libre mTeSR1.
5. Utilice disponible comercialmente microRNAs (por ejemplo, un miRIDIAN miRNA control de transfección no dirigido etiquetado con Dy547). Valorar concentraciones que van desde 0 hasta 160 nM usando los reactivos proporcionados y siga las instrucciones del fabricante.
6. Optimizar la eficacia de transfección para cada concentración en líneas HPSC por imágenes de la fluorescencia Dy547 de las células vivas con un microscopio a las 24 horas después de la transfección.
7. Cálculo de las eficiencias de transfección basados ​​en el porcentaje de células positivas Dy547 sobre todas las células de imágenes.

. tle "> 8 Protocolo 7: NCM Cultura para la transducción de vector lentiviral

1. Repita los pasos 7.1 a 7.4 del Protocolo 6.
2. Calcule las cantidades de partículas virales que se utilizarán para la transducción: Utilice la siguiente fórmula: TU = (MOI x CN) / VT, mientras que TU denota el número total de unidades de transformación, MOI es igual a la multiplicidad deseada de la infección en el pozo (MOI o TU / célula), CN especifica el número de células en cada pocillo, y VT indica los títulos virales de archivo (TU / ml). Por ejemplo, dado que los títulos virales de acciones para SMART-shRNA vector es igual a 1 x 10 ⁹ TU / ml (unidades de transformación por ml), 7,5 x 10 ⁵ células por pocillo en el momento de la transducción, y una MOI esperado de 20: uso de 15 l de las partículas virales de valores para cada bien (nota: se recomienda esta condición para la inducción lentiviral transitorio).
3. Pre-caliente 300 l de medio de mTeSR1 con 10 mg / ml de polibreno durante 30 min.
4. Añadir 15 l de partículas virales de acciones enel medio mTeSR1 precalentado que contiene polibreno y mezclar suavemente la solución.
5. Reemplazar el medio de cultivo celular con 300 l de medio precalentado que contienen las partículas virales.
6. Después de 4 horas de incubación, examinar turboGFP fluorescencia (una máquina para la expresión shRNA) para determinar la eficacia de la transducción.
7. Añadir 300 l de medio de mTeSR1 adicional a la transducción bien cuando las células comienzan a expresar turboGFP.
8. Después de 12-16 horas de incubación, examinar de nuevo la expresión turbo-GFP.
9. Lleve a cabo los experimentos de seguimiento deseados con estas células transducidas dentro de 72 horas.

Resultados

Un esquema general de la cultura NCM

La figura 1 representa un esquema típico de la cultura NCM que muestra los cambios dinámicos de hPSCs después de alta densidad de placas de una sola célula en presencia del inhibidor de Rock y-27632. Estos cambios morfológicos incluyen conexiones intercelulares después de la siembra, la formación de grupos celulares, y el crecimiento celular exponencial seguida de la condensación de células (Figura 1A).

Discusión

Hay dos formas principales para hPSCs de cultivo in vitro: cultura convencional de tipo colonia (de las células en los comederos o matrices extracelulares) y de cultivo en suspensión de hPSCs como agregados sin alimentadores ^6. Las limitaciones de los métodos de cultivo, tanto de tipo colonia y suspensión incluyen la heterogeneidad acumulada y los cambios epigenéticos heredables. Cultura NCM, basada tanto en los pases de una sola célula y de las planchas de células de alta densidad, r...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray System	Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL	Model RX-650	X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL 6-well plates	Becton Dickinson Labware	353046	Polystyrene plates
DMEM	Invitrogen Inc.	11965–092	For MEF medium
Mitomycin C	Roche	107409	Mitotic inhibitor
Trypsin	Invitrogen Inc.	25300-054	For MEF dissociation
DMEM/F12	Invitrogen Inc.	11330–032	For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Invitrogen Inc.	31985-062	For hPSC transfection
Heat-inactivated FBS	Invitrogen Inc.	16000–044	Component of MEF medium
Knockout Serum Replacement	Invitrogen Inc.	10828–028	KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Invitrogen Inc.	14190-144	D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140–050	NEAA, component of hPSC medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030–081	Component of hPSC medium
mTeSR1 & Supplements	StemCell Technologies	5850	Animal protein-free
TeSR2 & Supplements	StemCell Technologies	5860	Xeno-free medium
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522	Component of hPSC medium
MEF (CF-1) ATCC	American Type Culture Collection (ATCC)	SCRC-1040	For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified Matrigel	BD Bioscience	354277	For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521	BioLamina	LN521-02	Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic)	R&D Systems, MN	223-FB	Growth factor in hPSC medium
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104	1X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor I	EMD4 Biosciences	420099	An inhibitor of Janus kinase
Y-27632	EMD4 Biosciences	688000	ROCK inhibitor
Y-27632	Stemgent	04-0012	ROCK inhibitor
Y-39983	Stemgent	04-0029	ROCK I inhibitor
Phenylbenzodioxane	Stemgent	04-0030	ROCK II inhibitor
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell Strainer	BD Bioscience	352340	40 µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C	Thermo Scientific	C6516F-1	“Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000	Invitrogen Inc.	11668-027	Transfection reagents
DharmaFECT Duo	Thermo Scientific	T-2010-02	Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control	Thermo Scientific	IP-004500-01-05	Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs
SMART-shRNA	Thermo Scientific	To be determined	Lentiviral vector
pmaxGFP	amaxa Inc (Lonza)	Included in every transfection kit	Expression plasmid for transfection control
Oct-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-5279	Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1	Santa Cruz Biotechnology	sc-21702	Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-21704	Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60	Santa Cruz Biotechnology	sc-21705	Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81	Santa Cruz Biotechnology	sc-21706	Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8020	Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoprotein	Santa Cruz Biotechnology	sc-8399	AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9187	FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1)	Thermo Scientific	MS-295-P0	Mouse IgG1
Desmin	Thermo Scientific	RB-9014-P1	Rabbit IgG
Anti-NANOG	ReproCELL Inc, Japan	RCAB0004P-F	Polyclonal antibody
Rat anti-GFAP	Zymed	13-0300	Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3)	Cedarlane Laboratories Ltd.	CL2513A	Mouse IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4)	DakoCytomation Inc	IR611/IS611	Mouse IgG2a
Nestin	Chemicon International	MAB5326	Rabbit polyclonal antibody
TUBB3	Convance Inc	MMS-435P	Tuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12)	Cell Signaling Technologies	3113	Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution)	Electron Microscopy Sciences	15710	PFA, fixative, diluted in D-PBS