JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Abstract

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Introduction

הקיבולת של hPSCs לבדל לכיוון רקמות בוגרות multilineage פתחה אפיקים חדשים לטיפול בחולים הסובלים ממחלות קשות הכרוכים בלב וכלי דם, כבד, לבלב, ומערכות נוירולוגיות 1-4. סוגי תאים שונים הנגזרים מhPSCs היינו גם מספקים פלטפורמות סלולריות חזקות לדוגמנות מחלה, הנדסה גנטית, הקרנת סמים, ו1,4 בדיקה טוקסיקולוגית. הנושא המרכזי המבטיח יישומים הקליניים ותרופתיים עתידם הוא הדור של מספרים גדולים של hPSCs קליני כיתה באמצעות תרבית תאים במבחנה. עם זאת, מערכות התרבות הנוכחיות הם או לא מספיק או מטבעו משתנה, הכוללים תרבויות ומזין ללא מזין שונות של hPSCs כמושבות 5,6.

צמיחת מושבה מסוג מניות hPSCs הרבה תכונות מבניות של מסת התאים הפנימית (ICM) של עוברי יונקים מוקדמים. ICM הוא נוטה להתמיין לשלוש ניבט שכבותבסביבה תאית, בשל קיומה של הדרגתיים איתות הטרוגנית. לכן, הרכישה של ההטרוגניות בהתפתחות עוברית מוקדמת נחשבת כתהליך הנדרש לבידול, אבל תכונה לא רצויה של תרבות hPSC. ההטרוגניות בתרבות hPSC מושרה לעתים קרובות על ידי אותות אפופטוטיים מוגזמים והתמיינות ספונטנית בשל תנאי גידול אופטימליים. כך, בתרבות של מושבה מסוג התאים הטרוגנית הם נצפו לעתים קרובות בפריפריה של המושבות 7,8. זה כבר גם הראה כי התאים בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) מושבות תגובות ההפרש תערוכה למולקולות איתות כגון BMP-4 9. יתר על כן, שיטות תרבות המושבה לייצר תשואות תא נמוכות, כמו גם שיעורי החלמה תא נמוך מאוד מהקפאה בשל שיעורי צמיחה בלתי נשלטים ואיתות אפופטוטיים מסלולי 6,9. בשנים האחרונות, תרבויות השעיה שונות פותחו עבור hPSCs culturing, particulקארלי להרחבה של כמויות גדולות של hPSCs ובמזין תנאים 6,10-13 ללא מטריצה. ברור שיש להם מערכות תרבות שונות יתרונות משלהם וחסרונות. באופן כללי, הטבע הטרוגנית של hPSCs מייצג את אחד החסרונות העיקריים בשיטות מושבה מסוג והתרבות מצטברת, שהם הכי מוצלח להעברת חומרי DNA ו-RNA לhPSCs להנדסה גנטית 6.

ברור, יש צורך הכרחי כדי לפתח מערכות חדשות הלעקוף כמה חסרונות של שיטות תרבות הנוכחיות. התגליות של מעכבי מולקולה קטנים (כגון מעכב ROCK Y-27632 וJAK מעכב 1) המשפרות את הישרדות תא בודד לסלול את הדרך לתרבות ניתק-hPSC 14,15. עם השימוש במולקולות קטנות אלה, יש לנו לאחרונה פיתחו שיטת תרבות המבוססת על סוג הלא מושבה צמיחה (מלח"י) של ניתק-hPSCs 9. שיטת התרבות החדשנית זו משלבת גם passaging תא בודד וצפיפות גבוההציפוי שיטות, מאפשר לנו לייצר כמויות גדולות של hPSCs הומוגנית תחת מחזורי צמיחה עקביים ללא פגמים בכרומוזומים עיקריים 9. לחלופין, תרבות לח"י עלולה להיות מיושמת עם מולקולות קטנות שונות ומטריצות מוגדרות (כגון laminins) על מנת לייעל את שיטת התרבות עבור יישומים רחבים. כאן, אנו מציגים כמה פרוטוקולים מפורטים המבוססים על תרבות לח"י ולהתוות נהלים מפורטים להנדסה גנטית. כדי להדגים את הרבגוניות של פרוטוקולים מלח"י, אנחנו גם נבדקו תרבות לח"י עם מעכבי ROCK מגוונים ועם איזופורם laminin אחת 521 (כלומר, LN-521).

Protocol

תרבות monolayer סוג הלא מושבה תא בודד מבוסס (מלח"י) של hPSCs.

1. הכנות

  1. הפוך 500 מיליליטר של מדיום לתרבות של fibroblasts העכבר העוברי (MEFs): מדיום DMEM בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו0.1 חומצות מ"מ שאינו חיוניים אמינו (NEAA).
  2. לבודד fibroblasts עכבר העוברי תאים (MEFs) נגזרים מזן CF1 בעקבות פרוטוקול שגרתי 16 והתרבות MEFs על 0.1% צלחת תרבית תאי 6 גם ג'לטין מצופה במדיום DMEM. לחלופין, לרכוש מניות MEF בחלוף 3 ממקורות מסחריים.
  3. הכן את צלחות Matrigel.
    1. לדלל 5 מיליליטר של מניית Matrigel hESC מוסמך עם 5 מיליליטר של מדיום DMEM/F12 (המקורר ב ~ 4 ° C) וחנות כaliquots 50% ב-20 ° C במקפיא. להפשיר את מניית Matrigel הקפואה במקרר (~ 4 ° C) O / N ולדלל את Matrigel נוסף במדיום DMEM/F12 קר (כדי להצמיח ריכוז עובד 2.5%).
    2. צלחות מעיל 6 גם תרבית תאים עם 1.5 מיליליטר של .2.5% Matrigel לכל טוב, אחסן את הצלחות מצופים במקרר O / N (הערה: להשתמש בצלחת Matrigel מצופה בתוך 2 שבועות).
    3. הסר את צלחת Matrigel מהמקרר, לאפשר את הצלחת כדי לחמם ב RT במכסת מנוע תרבית תאים ל10-30 דקות (שים לב: לא לחמם את הצלחת בתרבית תאי חממה), ולשאוב DMEM לפני ציפוי בינוני hPSCs.
  4. הפוך 500 בינוני מיליליטר hESC: 80% בינוניים DMEM/F12, 20% KSR, 2 מ"מ L-גלוטמין, 0.1 חומצות אמינו לא חיוניות מ"מ, 0.1 מ"מ β-mercaptoethanol, ו -4 ng / מיליליטר של FGF-2.
  5. הכן 10 מיליליטר של מדיום הקפאת 2X hPSC: FBS 60%, DMSO 20%, ו20 מיקרומטר Y-27632 במדיום mTeSR1, לעקר על ידי סינון, ולהשתמש במדיום בתוך השבוע 1.

. 2 פרוטוקול 1 (בסיסי): לגדול hPSC מושבות על האכלה

  1. השתמש במספרים מעבר MEF ב 5 או 6 (כאזור P5 ו P6) לתרבות hPSC על מנת לקבל resul העקביts. Mitotically להשבית MEFs על ידי טיפול בתאים עם C mitomycin 10 מיקרוגרם / מיליליטר למשך 3 שעות ב 37 ° C, לשטוף את התאים 3x עם פוספט שנאגר מלוח של 1X Dulbecco (D-PBS), ולאחר מכן לנתק את MEFs עם 0.05% טריפסין ב0.53 מ"מ EDTA. לחלופין, להקרין MEFs במינון של 8,000 ראד עם irradiator רנטגן.
  2. לספור מספרים סלולריים בשיטת הרחקת כתם Trypan הכחולה מתחת למיקרוסקופ. לחלופין, השתמש בדלפק תא אוטומטי.
  3. MEFs מוקרן צלחת על צלחות קלקר 6 היטב מצופה ג'לטין 0.1% בצפיפות של 1.88 x 10 5 תאים לכל טוב (כלומר, 1.96 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר). דגירה התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2 למשך 24 שעות.
  4. הסר את מדיום תרבות MEF על ידי שאיפה עם פיפטה פסטר (שים לב: לא צעדים לשטוף צורך בשלב זה).
  5. מושבות Triturate hPSC מהתרבות קודמת לגושים קטנים, לבחון את הגושים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח הגדלים שלהם החל frאום 50-100 מיקרומטר בקטרים, וצלחת גושי hPSC בחלק העליון של שכבות מזין MEF בבאר אחת המכיל 2 מיליליטר של מדיום hPSC.
  6. שינוי hESC בינוני ביום למשך 3 עד 5 ימים, צמיחת מושבה שיא בתמונה, לסמן כל מושבות מורפולוגית שינו או הבדיל (~ 5%), ולהסיר באופן ידני את המושבות המסומנות בעדינות על ידי שאיפה עם פיפטה פסטר.
  7. יש לשטוף את המושבות שנותרו על MEFs פעמיים (2 דקות כל אחד עם D-PBS), דגירה המושבות עם 2 מיליליטר של 1 מ"ג / IV collagenase מיליליטר במדיום hPSC ל10-30 דקות), ולבחון את הניתוק של מושבות hPSC מ משטח מצופה-MEF (הערה: להשתמש מגרד כדי לסייע בתהליך הניתוק רק אם המושבות הן מחוברים בחוזקה לצלחת).
  8. הוסף 5 מיליליטר של מדיום hPSC היטב כל אחד כדי למזער תגובות אנזימטיות, מושבות להעביר צינור 15 מיליליטר, לאפשר מושבות hPSC למשקעים במשך 3 עד 5 דקות ב RT, ולהבטיח את שקיעה של מושבות על ידי הדמיה ישירה של גאמות בחלק התחתון של הצינור (הערה: לא צנטריפוגות הצינור בשלב זה).
  9. הסר את supernatants המכיל MEFs שייר וניתק תאים בודדים, resuspend המושבות עם 5 מיליליטר של מדיום hESC, ולחזור על שלב השיקוע פעמיים.
  10. הסר את המדיום, מושבות hPSC triturate לתוך גושים קטנים, חנות ב1X hPSC הקפאה בינונית (או בינוני הקפאת CryoStore CS10) לשימור בהקפאה (מחוברות 1 גם לכל בקבוקון קפוא) או צלחת על צלחת 6 היטב לpassaging תא.

3 פרוטוקול 2:. המרת hPSC מושבות מהאכלה ללח"י

  1. יש לשטוף את כדורי hPSC בD-PBS פעם אחת, דגירה את כדורים עם 1 מיליליטר של 1X Accutase עבור 10 דקות, ולבחון את התגובה האנזימטית תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק מתא בודד.
  2. לסיים את התגובות אנזימטיות בעדינות על ידי resuspending התאים ב5 מיליליטר של מדיום mTeSR1 מכיל 10 מיקרומטר Y-27632 ואחריו צנטריפוגה ב XG 200 ב RT למשך 5 דקות(שים לב, לא משתמשים בכוחות צנטריפוגה מוגזמים הגורמים לניזק לתאים).
  3. הוסף 5 מיליליטר של מדיום mTeSR1 לגלולה, resuspend את הכדור כתאים בודדים, ומסנן ניתק תאים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר (כדי להסיר כל אגרגטים תא שיורי).
  4. הזרעים 1.3-2 x 10 6 hPSCs לאחד היטב (1.4-2.1 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר) של צלחת 6 היטב מצופה Matrigel hESC מוסמך 2.5%, להוסיף בינוני mTeSR1 עד 2.5 מיליליטר, וכולל 10 מיקרומטר Y-27632 במדיום (כדי להקל על ציפוי תא בודד 24 שעות הראשוניות). לחלופין, לנצל את המולקולות קטנות הבאות כדי להחליף 10 מיקרומטר Y-27632 לציפוי תא בודד שיפור: 1 מיקרומטר Y-39983, phenylbenzodioxane 1 מיקרומטר (ROCK השני מעכב), thiazovivin 1 מיקרומטר (מעכב ROCK רומן) (ROCK אני מעכב) , ומעכב JAK 2 1 מיקרומטר.
  5. החלף את המדיום עם מדיום ללא סמים mTeSR1 ביום שלמחרת (תוך 24 hr), לנתק את תאים מאחד נוסףגם ו, לספור את המספר הסלולרי כדי לקבוע את יעילות ציפוי תא בודד (הערה: כ, 50-90% מיעילות ציפוי תא בודד שניתן להשיג בשלב זה).
  6. לאפשר לתאים לגדול כ- נוצר תא בודד monolayer לכמה ימים עם 3 מיליליטר של מדיום mTeSR1. שנה בינונית מדי יום.
  7. באופן אמפירי לקבוע את לוח הזמנים לpassaging לח"י הותאם בהתאם לצפיפות התא. מעבר כאשר צמיחת תאים מגיעה למפגש ביום 3 או יום 4, או בנקודת הזמן 4 שעות לאחר היעלמותם של גבולות תא אל התא. לנתק את התאים ב 1 מיליליטר של Accutase, השתמש 1 עד 3 יחס פיצול (כלומר, מחוברות 1 גם של תאים מצופים ב3 בארות של צלחת 6 היטב) לpassaging תא, ולייצב את מלח"י הותאם על ידי 5 קטעים.
  8. הקפאת תא
    1. לנצל היטב אחת מחוברות (~ 5-6 x10 6 תאים) לבקבוקון אחד קפוא: לנתק את התאים ממחוברות אחת גם עם 1 מיליליטר של Accutase 10 דקות.
    2. לדלל wה-i 5 מיליליטר של תאים בינוניים ו צנטריפוגות mTeSR1 כפי שתואר לעיל.
    3. Resuspend את הכדור ב500 μl של מדיום mTeSR1 ולאחר מכן להוסיף לאט 500 μl של מדיום הקפאת 2X hPSC (המכיל 20 מיקרומטר Y-27632) בבקבוקון שימור בהקפאה. לחלופין, resuspend התאים במדיום הקפאת 1X hPSC המכילים מעכבי JAK 2 1 מיקרומטר או בינוני 1X CryoStor CS10 בנוכחות שני 10 מיקרומטר Y-27632 או 2 מעכבי JAK 1 מיקרומטר.
    4. מניחים צלוחיות קפוא לcryocontainer קרח צונן (תחתון מלא בisopranol) ולהעביר את cryocontainer ל-80 ° C במקפיא באופן מיידי.
    5. העברת תאים מ-80 ° C במקפיא למכל חנקן נוזלי (ביום למחרת) לשימור בהקפאה לטווח ארוך.
  9. הפשרת תא
    1. לנצל בקבוקון הקפאה אחד לציפוי גם 1 של צלחת 6 באר.
    2. בינוני mTeSR1 טרום חמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, תאי הפשרה באותו אמבט מים במשך 2 דקות,ירידה מבחינת להוסיף תאים ל5 מיליליטר של מדיום mTeSR1 מראש חימם מכיל 10 מיקרומטר Y-27632, ו צנטריפוגות כמתואר לעיל.
    3. בעדינות resuspend את כדורי תא עם 2 מיליליטר של מדיום mTeSR1 מכיל 10 מיקרומטר Y-27632 ולהעביר לאט תאים גם מצופה מראש עם Matrigel (הערה: להימנע מהפקת בועות אוויר).
    4. שנה בינונית מדי יום וצופה צמיחת hPSC למגיעה למפגש ביום 3 או 4.

4 פרוטוקול 3:. המרת hPSC מושבות על Matrigel ללח"י תרבות

  1. הסר את צלחת Matrigel מצופה ממקרר, מניח את הצלחת במכסת המנוע בתרבית רקמה ל10-30 דקות, להסיר את המדיום מבאר כל הצלחת, ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום mTeSR1 מראש חימם היטב כל אחד.
  2. העברת triturated גושי hPSC מתרבות המזין (שלב 2.10 של הפרוטוקול הבסיסי) לצלחת Matrigel לעיל. הוסף בינוני mTeSR1 עד 2.5 נפח סופי מיליליטר בכל טוב.
  3. שנה בינונית ביום למשך 3 עד 4 ימיםשל עד מושבות מגיעים למפגש 80-90%.
  4. לpassaging תא: לשטוף את המושבות עם D-PBS פעמיים, טיפול בתאים עם 1 מיליליטר של 2 מ"ג / מיליליטר dispase ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15-20 דקות, ומשקעים והמעבר תאים כגושים.
  5. לתרבות לח"י: חזור על שלבים 3.1-3.9 מתוארים בפרוטוקול 2.

5 4 פרוטוקול:. לח"י תרבות של hPSCs על LN-521

  1. להפשיר את פתרון LN-521 רקומביננטי על 4 מעלות צלזיוס לפני יום השימוש ולהפוך את פתרון ציפוי laminin (LCS) על ידי דילול laminin מופשר עם 1X D-PBS (המכיל Ca 2 + / Mg 2 +) לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
  2. הוסף 1 מיליליטר של LCS לאחד גם בצלחת 6 היטב (הערה: הימנע מיבש במהלך תהליך הציפוי).
  3. חותם את הצלחת המצופה עם Parafilm כדי למנוע אידוי ולאחסן את הצלחת במקרר (4 מעלות צלזיוס) O / N (הערה: להשתמש בצלחת בתוך השבוע 1).
  4. בעדינות להסיר את LCS עם פיפטה פסטר ללא לuching המשטח המצופה ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום mTeSR1 לאחד טוב.
  5. לחמם את כל פתרונות התרבות (כולל D-PBS) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות.
  6. המרת מושבות hPSC ללח"י
    1. לנתק אגרגטים תא לתאים בודדים עם Accutase כפי שתואר בפרוטוקול 2.
    2. הזרעים 1.3-2 x 10 6 hPSCs לאחד LN-521 מצופה היטב (1.4-2.1 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר) ללא הנוכחות של מעכבי ROCK.
    3. שנה בינונית ביום למשך 3 עד 4 ימים.
    4. לנתק את התאים ב 1 מיליליטר של Accutase ביום 3 או 4 לpassaging התא הבא באמצעות 1 עד 3 יחס פיצול.

. 6 פרוטוקול 5: לח"י תרבות לפלסמיד דנ"א Transfection

  1. להתאים מושבות hPSC לתרבות לח"י כמתואר בפרוטוקולים 2 עד 4.
  2. צלחת ניתקה hPSCs ב12 גם צלחת עם צפיפות תאים של 7.5 x 10 5 תאים / היטב במדיום mTeSR1 בנוכחות 10 מיקרומטר Y-27632.
  3. החלף בינוני mTeSR1 עם ללא סמים בינוניים mTeSR1 בין 4-8 שעות לאחר ציפוי התאים.
  4. לכל transfection, לדלל 2.5 מיקרוגרם של פלסמידים ביטוי (למשל, pmaxGFP) ו -5 μl של Lipofectamine 2000 בצינורות Eppendorf נפרדים ב125 μl כל אחד מOpti-ממ מופחת סרום בינוני.
  5. אחרי 5 דקות, לערבב את חומרים כימיים בדילול מלא ודגירה של 20 דקות ב RT (ליצירת קומפלקסי transfection).
  6. הוסף את 250 מתחמי transfection μl לכל hPSCs היטב המכיל 1 מיליליטר בינוני mTeSR1 דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור במשך 24 שעות.
  7. לבחון את יעילות transfection תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולצלם באופן אקראי לחישוב יעילות transfection בפועל.

. 7 6 לפרוטוקול: מלח"י תרבות לTransfection של מיקרו RNA

  1. לנתק hPSCs למחצה מחוברות ביום 2 בתנאים מלח"י על ידי הוספת 1 מיליליטר של Accutase לכל טוב ב6 היטב צלחת.
  2. הוסף 10 מיליליטר של מדיום mTeSR1 לדלל תגובות ו צנטריפוגות האנזימטית ב XG 200 למשך 5 דקות.
  3. Resuspend התא גלולה עם מדיום mTeSR1, זרע התאים בצפיפות של 7.5 x 10 5 תאים לכל היטב צלחת 12 גם במדיום mTeSR1 מכילה 10 מיקרומטר Y-27632, ולתת לתאים לצרף ל4 שעות.
  4. החלף בינוני עם בינוני mTeSR1 Y27632 חינם.
  5. השתמש במייקרו RNA זמין באופן מסחרי (למשל, מירנה Transfection בקרת miRIDIAN ללא מיקוד שכותרתו עם Dy547). לכיל ריכוזים הנעים 0-160 ננומטר באמצעות חומרים כימיים הניתנים ולעקוב אחר הוראות היצרנים.
  6. לייעל את יעילות transfection עבור כל ריכוז בקווי hPSC ידי ההדמיה הקרינה Dy547 של תאי חיים תחת מיקרוסקופ ב24 שעות לאחר transfection.
  7. לחשב את יעילות transfection מבוססת על אחוז התאים החיוביים Dy547 על כל תאי הדמיה.
. ייתכנו "> 8 7 לפרוטוקול: מלח"י תרבות לתמרה של lentiviral וקטור

  1. חזור על שלבים 7.1-7.4 של פרוטוקול 6.
  2. לחשב את הכמויות של חלקיקים נגיפיים שישמשו לתמרה: השתמש בנוסחה הבאה: TU = (משרד הפנים x CN) / VT, ואילו TU מציין את המספר הכולל של הפיכת יחידות, משרד הפנים שווים לריבוי הרצוי של זיהום בבאר (משרד הפנים או TU / תא), CN מציין את מספר התאים בכל טוב, וVT מציין כותרות מניית ויראלי (TU / מיליליטר). לדוגמא, בהתחשב בכך שכותרות נגיפיות המניה לוקטור סמארט shRNA שווה 1 x 10 9 TU / מיליליטר (הפיכת יחידות למ"ל), 7.5 x 10 5 תאים לכל גם בזמן של התמרה, ומשרד הפנים צפויים של 20: להשתמש 15 μl של החלקיקים נגיפיים המניה לכל אחד גם (שים לב: במצב זה מומלץ לזירוז lentiviral חולף).
  3. 300 μl טרום חם של מדיום mTeSR1 עם 10 מ"ג / מיליליטר של polybrene ל30 דקות.
  4. הוסף 15 μl של חלקיקים נגיפיים לתוך המניהמדיום mTeSR1 המחומם מראש המכיל polybrene ולערבב בעדינות את הפתרון.
  5. החלף את מדיום תרבית תאים עם 300 μl של מדיום prewarmed המכיל חלקיקים נגיפיים.
  6. לאחר 4 שעות דגירה, לבחון את הקרינה turboGFP (יצרנית לביטוי shRNA) כדי לקבוע את יעילות התמרה.
  7. הוסף 300 μl של מדיום mTeSR1 נוסף לtransducing גם כאשר התאים מתחילים לבטא turboGFP.
  8. לאחר הדגירה 12-16 שעות, לבחון מחדש את הביטוי הטורבו-GFP.
  9. לבצע ניסויי מעקב רצויים עם תאי transduced אלה בתוך 72 שעה.

תוצאות

סכימה כללית של תרבות לח"י

איור 1 מייצג סכימת תרבות לח"י טיפוסית מראה את השינויים הדינמיים של hPSCs לאחר ציפוי תא בודד בצפיפות גבוהה בנוכחות מעכב ROCK Y-27632. שינויים מורפולוגיים אלה כוללים קשרים אינטר לאחר ציפוי, ?...

Discussion

ישנן שתי דרכים עיקריות לhPSCs התרבות במבחנה: תרבות קונבנציונלית מושבה מהסוג (של תאים במתקני האכלה או מטריצות תאיים) ותרבות השעיה של hPSCs כמו אגרגטים ללא ניזונים 6. המגבלות של שיטות תרבות הן המושבה מסוג וההשעיה כוללות הטרוגניות שנצברה ושינויים אפיגנטיים בירושה...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) at the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. We would like to thank Dr. Ronald D. McKay for his discussion and comments on this project.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Countess automated cell counterInvitrogen Inc.C10227Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray SystemFaxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL Model RX-650X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL 6-well platesBecton Dickinson Labware353046Polystyrene plates
DMEMInvitrogen Inc.11965–092For MEF medium
Mitomycin CRoche107409Mitotic inhibitor
TrypsinInvitrogen Inc.25300-054For MEF dissociation
DMEM/F12Invitrogen Inc.11330–032For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Invitrogen Inc.31985-062For hPSC transfection
Heat-inactivated FBSInvitrogen Inc.16000–044Component of MEF medium
Knockout Serum ReplacementInvitrogen Inc.10828–028KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SalineInvitrogen Inc.14190-144D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acidsInvitrogen11140–050NEAA, component of hPSC medium
L-GlutamineInvitrogen 25030–081Component of hPSC medium
mTeSR1 & SupplementsStemCell Technologies5850Animal protein-free
TeSR2 & SupplementsStemCell Technologies5860Xeno-free medium
β-mercaptoethanolSigma M7522Component of hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC		American Type Culture Collection (ATCC) SCRC-1040For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified MatrigelBD Bioscience354277For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521BioLaminaLN521-02Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic)R&D Systems, MN223-FBGrowth factor in hPSC medium
CryoStor CS10StemCell Technologies7930
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-1041X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor IEMD4 Biosciences420099An inhibitor of Janus kinase
Y-27632EMD4 Biosciences688000ROCK inhibitor
Y-27632Stemgent04-0012ROCK inhibitor
Y-39983Stemgent04-0029ROCK I inhibitor
PhenylbenzodioxaneStemgent04-0030ROCK II inhibitor
ThiazovivinStemgent04-0017A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell StrainerBD Bioscience35234040 µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °CThermo Scientific C6516F-1“Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000Invitrogen Inc.11668-027Transfection reagents
DharmaFECT DuoThermo ScientificT-2010-02Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection ControlThermo ScientificIP-004500-01-05Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs 
SMART-shRNAThermo Scientific To be determinedLentiviral vector
pmaxGFPamaxa Inc (Lonza)Included in every transfection kitExpression plasmid for transfection control
Oct-4Santa Cruz Biotechnologysc-5279Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1Santa Cruz Biotechnologysc-21702Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4Santa Cruz Biotechnologysc-21704Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60Santa Cruz Biotechnologysc-21705 Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81Santa Cruz Biotechnologysc-21706Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51)Santa Cruz Biotechnologysc-8020Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoproteinSanta Cruz Biotechnologysc-8399AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19)Santa Cruz Biotechnologysc-9187FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1)Thermo ScientificMS-295-P0Mouse IgG1
DesminThermo ScientificRB-9014-P1Rabbit IgG
Anti-NANOGReproCELL Inc, JapanRCAB0004P-FPolyclonal antibody 
Rat anti-GFAPZymed13-0300Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3)Cedarlane Laboratories Ltd.CL2513AMouse IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4)DakoCytomation IncIR611/IS611Mouse IgG2a
NestinChemicon InternationalMAB5326Rabbit polyclonal antibody
TUBB3Convance IncMMS-435PTuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12)Cell Signaling Technologies3113Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution)Electron Microscopy Sciences15710PFA, fixative, diluted in D-PBS

References

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167 (2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

89pluripotentpluripotentmonolayerRhoY 27632transfection

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved