JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Аннотация

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Введение

Емкость hPSCs дифференцировать к мультилинейной взрослых тканей открывает новые возможности для лечения пациентов, страдающих от тяжелых заболеваний, которые связаны с сердечно-сосудистой, печени, поджелудочной железы, и неврологические системы 1-4. Различные типы клеток, полученные из hPSCs также обеспечит надежные сотовые платформы для моделирования заболевания, генной инженерии, скрининга лекарственных средств и токсикологические испытания 1,4. Ключевой вопрос, который обеспечивает их будущие клинические и фармакологические приложений является генерация большого числа клинико-класса hPSCs через в пробирке культуре клеток. Тем не менее, в настоящее время системы культуры либо недостаточны, либо по своей сути переменная, с участием различных фидерных и фидерных без культуры hPSCs как колоний 5,6.

Рост колоний тип hPSCs акций многие структурные особенности внутренней клеточной массы (ICM) ранних эмбрионов млекопитающих. ICM склонна к дифференцировке в трех зародышевых слоевв многоклеточного среды из-за существования гетерогенных градиентов сигнализации. Таким образом, приобретение неоднородности в начале эмбрионального развития рассматривается как необходимого процесса дифференциации, но нежелательный особенностью HPSC культуры. Неоднородность в HPSC культуры часто бывают вызваны чрезмерным апоптотических сигналов и спонтанной дифференцировки из-за неоптимальных условий роста. Таким образом, в колонии типа культуры, гетерогенные клетки часто наблюдаются на периферии колоний 7,8. Было также показано, что клетки человеческого эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) колонии экспонат дифференциальные ответы на сигнальные молекулы, такие как BMP-4 9. Более того, методы колония культуры производят низкие урожаи клеток, а также темпы восстановления очень низкая клеток от криоконсервации из-за неконтролируемых темпов роста и апоптоза сигнальных путей 6,9. В последние годы в различных суспензионных культур были разработаны для культивирования hPSCs, particulарли для расширения больших количеств hPSCs в фидерной и матричных без условий 6,10-13. Очевидно, разные системы культуры имеют свои преимущества и недостатки. В общем, гетерогенный характер hPSCs представляет собой один из основных недостатков в колонии типа и агрегированный культуры методов, которые субоптимальным для доставки ДНК и РНК материалов в hPSCs для генной инженерии 6.

Очевидно, что существует настоятельная необходимость в разработке новых систем, которые обойти некоторые недостатки существующих методов культивирования. Открытия низкомолекулярные ингибиторы (например, ROCK ингибитор Y-27632 и JAK ингибитора 1), которые улучшают выживаемость одноклеточные проложить путь к диссоциирован-HPSC культуры 14,15. С использованием этих малых молекул, мы недавно разработали метод культуры, основанной на не-колонии типа (NCM) рост диссоциированных-hPSCs 9. Этот новый метод культура сочетает в себе пассирование одноклеточные и высокой плотностиПокрытие методы, что позволяет нам производить большое количество однородных hPSCs под последовательных циклов роста без серьезных хромосомных аномалий 9. Кроме того, NCM культура может быть реализована с различными малых молекул и определенных матриц (например, ламининами), чтобы оптимизировать способ культивирования для широкого применения. Здесь мы представляем несколько подробных протоколов на основе NCM культуры и разграничить подробные процедуры для генной инженерии. Чтобы продемонстрировать универсальность протоколов NCM, мы также протестировали NCM культуру с разнообразными ингибиторов ROCK и с одной ламинином изоформы 521 (то есть, LN-521).

протокол

Одноклеточный основе не-колония Тип монослой (NCM) культура hPSCs.

1. Подготовка

  1. Сделать 500 мл среды для культуры мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs): DMEM среде, содержащей 10% FBS, 2 мМ L-глутамина и 0,1 мМ заменимых аминокислот (NEAA).
  2. Изолировать мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) клетки, полученные из штамма CF1 после обычного протокола 16 и культуры MEFs на 0,1% желатин покрытием клеточной культуральной пластины 6-луночный в DMEM среде. Кроме того, приобрести акции MEF при прохождении 3 из коммерческих ресурсов.
  3. Подготовка Матригель пластины.
    1. Развести 5 мл чЭСК квалифицированных Матригель складе с 5 мл среды DMEM/F12 (охлажденный при ~ 4 ° С) и хранить в виде 50% в аликвотах -20 ° C морозильник. Разморозить замороженный Matrigel запас в холодильнике (~ 4 ° С) O / N и далее разбавить Матригель в холодной среде DMEM/F12 (рождать рабочей концентрации 2,5%).
      2. Пальто 6-луночные планшеты для культивирования клеток с 1,5 мл 2,5% Матригель на лунку, хранить покрытых пластин в холодильник O / N (Примечание: используйте пластину на Матригель покрытием в течение 2 недель).
    2. Снимите Matrigel тарелку из холодильника, дайте пластины, чтобы нагреть при комнатной температуре в капот культуре клеток для 10 до 30 мин (Примечание: не согреть пластину в инкубаторе для клеточных культур) и аспирации DMEM среде перед покрытием hPSCs.
  4. Сделать 500 мл чЭСК среды: 80% среде DMEM/F12, 20% КСР, 2 мМ L-глутамина, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, и 4 нг / мл FGF-2.
  5. Подготовка 10 мл 2X HPSC морозильной среды: 60% FBS, 20% DMSO, 20 мкМ и Y-27632 в mTeSR1 среды, стерилизуют фильтрацией и используют среду в течение 1 недели.

. 2 Протокол 1 (Начальный): Расти HPSC колонии на Кормушки

  1. Используйте MEF номера проход с 5 или 6 (обозначен p5 и p6) для HPSC культуры для того, чтобы получить последовательную РЕЗУЛЬТАТОВц. Митотически инактивировать MEFs обработкой клеток с 10 мкг / мл митомицина С в течение 3 часов при 37 ° С, промыть клетки 3x с 1X Дульбекко забуференном фосфатом физиологическом растворе (D-PBS), а затем отделить MEFs с 0,05% трипсина в 0,53 мМ EDTA. С другой стороны, облучать MEFs в дозе 8000 рад с рентгеновской излучателем.
  2. Количество чисел клеток с помощью метода Трипановый синевы исключения под микроскопом. Кроме того, использование автоматического счетчика клеток.
  3. Пластинчатые облученные MEFs на полистироловых планшетах 6-луночные покрытые с 0,1% желатина при плотности 1,88 × 10 5 клеток на лунку (т.е. 1,96 × 10 4 клеток / см 2). Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24 часов.
  4. Снимите MEF культуральной среды путем аспирации с помощью пипетки Пастера (Примечание: никаких шагов мытья необходимые в это время).
  5. Triturate HPSC колонии от предыдущей культуры в небольшие пряди, изучить глыбы под микроскопом, чтобы обеспечить их размеры, начиная фром 50 до 100 мкм в диаметрах, и пластины HPSC глыбы на верхней части MEF фидерных слоев в один хорошо, содержащих 2 мл HPSC среды.
  6. Изменение чЭСК среднего ежедневно в течение 3 до 5 дней, роста колоний записи на фотографии и не отмечают никаких морфологически измененных или дифференцированные колонии (~ 5%), так и вручную удалить отмеченные колонии, осторожно стремление с помощью пипетки Пастера.
  7. Промойте оставшиеся колонии на MEFs два раза (2 мин каждый с D-PBS), и инкубировать колонии с 2 мл 1 мг / мл коллагеназы IV в HPSC среды для 10 до 30 мин), и изучить отряд HPSC колоний от поверхность MEF покрытием (Примечание: используйте скребок, чтобы помочь отряд процесс, только если колонии плотно прикреплена к пластине).
  8. Добавить 5 мл HPSC среды в каждую лунку, чтобы минимизировать ферментативных реакций, колонии перевода к 15 мл трубки, позволяют HPSC колонии для осаждения для 3 до 5 минут при комнатной температуре, а также обеспечить осаждение колоний прямой визуализации слоктей в нижней части трубки (примечание: не центрифуге трубки на этом этапе).
  9. Удалить надосадочную жидкость, содержащую остаточные MEFs и диссоциированных отдельные клетки, ресуспендируйте колонии 5 мл чЭСК среды, и повторите шаг оседания дважды.
  10. Удалить среды, растирают колонии HPSC на мелкие сгустки, магазин в 1X HPSC замерзания среды (или CryoStore CS10 замерзания среды) для криоконсервации (1 сливная хорошо за замороженной флакона) или пластины на 6-луночный планшет для сотового пассажей.

3 Протокол 2:. Преобразование HPSC колонии от Кормушки для NCM

  1. Промыть HPSC гранул в D-PBS один раз, инкубировать гранул с 1 мл 1X Accutase в течение 10 мин, и изучить ферментативную реакцию под микроскопом, чтобы обеспечить одно-клеточной диссоциации.
  2. Прекратить ферментативных реакций, осторожно ресуспендирования клеток в 5 мл mTeSR1 среде, содержащей 10 мкМ Y-27632 с последующим центрифугированием при 200 х г при комнатной температуре в течение 5 мин(Примечание, не используйте слишком центрифугирования силы, которые вызывают повреждения клеток).
  3. Добавить 5 мл mTeSR1 среды к осадку, ресуспендируют осадок в виде отдельных клеток, и фильтр в отрыве клеток через клеточный фильтр (для удаления любых остаточных агрегаты клеток) 40 мкм.
  4. Семенной 1.3-2 х 10 6 hPSCs в одну лунку (1,4-2,1 х 10 5 клеток / см 2) 6-луночный планшет, покрытый 2,5% чЭСК квалифицированных Матригель, добавить mTeSR1 среды до 2,5 мл, и включают в себя 10 мкм Y-27632 в среде (для облегчения начального 24 часами покрытие с одной ячейкой). Кроме того, использовать следующие малые молекулы, чтобы заменить 10 мкм Y-27632 для повышения обшивки одноклеточных: 1 мкм Y-39983 (РОК я ингибитора), 1 мкМ phenylbenzodioxane (ингибитор ROCK II), 1 мкМ thiazovivin (новый ингибитор ROCK) , и ЯК ингибитор 2 мкМ 1.
  5. Замените среду с без наркотиков mTeSR1 среды на следующий день (в течение 24 часов), отделить клетки от одного дополнительногону, и считать количество клеток для определения эффективности посева с одной ячейкой (Примечание: примерно, от 50 до 90% от одноклеточного эффективности нанесения покрытия, что может быть достигнуто на данном этапе).
  6. Разрешить клетки расти как одноклеточные сформированный монослой в течение нескольких дней с 3 мл mTeSR1 среды. Изменение средней ежедневно.
  7. Эмпирически определить график пассажей, выполненный с NCM в зависимости от плотности клеток. Прохождение когда рост клеток достигает слияния в день 3 или 4 дня, или в момент времени 4 часа после исчезновения клетки к клетке границ. Диссоциируют клеток в 1 мл Accutase, использовать от 1 до 3 соотношение расщепления (т.е. 1 Конфлюэнтные хорошо клеток высевали в 3 лунки 6-луночный планшет) для клеток пассажей, и стабилизировать адаптированный NCM на 5 проходов.
  8. Сотовый замерзания
    1. Используйте один сливающийся хорошо (~ 5-6 x10 6 клеток) в течение одного замороженного флаконе: отделить клетки от одной сливной хорошо с 1 мл Accutase в течение 10 мин.
    2. Развести жIth 5 мл mTeSR1 средних и центрифуги клеток, как описано выше.
    3. Ресуспендируют осадок в 500 мкл среды mTeSR1, а затем медленно добавить 500 мкл 2X HPSC морозильной среде (содержащей 20 мкм Y-27632) в криоконсервации флаконе. Кроме того, ресуспендирования клеток в 1X HPSC морозильной среде, содержащей 2 мкМ ингибитор JAK 1 или 1x CryoStor CS10 среды в присутствии либо 10 мкМ Y-27632 или 2 мкМ ингибитор JAK 1.
    4. Поместите замороженные флаконы в охлажденного льдом Криорезервуар (снизу заполнены isopranol) и немедленно передать Криорезервуар к -80 ° C морозильник.
    5. Передача клетки из -80 ° C морозильник в баке жидкого азота (на следующий день) для долгосрочного криоконсервации.
  9. Сотовый оттаивания
    1. Используйте один криоконсервации флакон для посева 1 колодец 6-луночный планшет.
    2. Предварительно тепло mTeSR1 среда в ванну с водой 37 ° C в течение 10 мин оттаивания клеток в той же водяной бане в течение 2 мин,каплям добавляют клетки в 5 мл подогретого mTeSR1 среде, содержащей 10 мкМ Y-27632, и центрифуга как описано выше.
    3. Аккуратно ресуспендирования осадка клеток с 2 мл mTeSR1 среде, содержащей 10 мкМ Y-27632 и медленно передавать клетки хорошо предварительно покрывают Матригель (Примечание: избежать получения пузырьков воздуха).
    4. Изменение средней ежедневно и ожидаем, что рост HPSC достичь слияния в день 3 или 4.

4 Протокол 3:. Преобразование HPSC колонии на Матригель к NCM культуры

  1. Удалить пластину с Матригель покрытием из холодильника, поместите пластину в капот культуры ткани от 10 до 30 мин, удалить среды из каждой лунки пластины, и добавить 2 мл подогретого mTeSR1 среды в каждую лунку.
  2. Передача растирают HPSC комки из питателя культуры (этап 2.10 базового протокола) к вышеуказанному Matrigel пластины. Добавить mTeSR1 среды до 2,5 мл конечного объема в каждую лунку.
  3. Изменение средней в день в течение 3 до 4 дняс до колоний достичь от 80 до 90% слияния.
  4. Для клеток пассажей: промыть колонии с D-PBS в два раза, лечить клетки с 1 мл 2 мг / мл диспаза при 37 ° С в течение от 15 до 20 мин, и донного осадка и прохождение клетки как сгустки.
  5. Для NCM культуры: повторите шаги 3,1 до 3,9 описано в Протоколе 2.

5 Протокол 4:. NCM Культура hPSCs на LN-521

  1. Разморозить рекомбинантный LN-521 раствор при 4 ° С до дня применения и сделать раствор ламинин покрытия (ЖК) путем разбавления талой ламинин с 1X D-PBS (содержащий Ca 2 + / Mg 2 +) в конечной концентрации 10 мкг / мл.
  2. Добавьте 1 мл ЛСК в одной скважины в 6-луночный планшет (примечание: избежать сухого во время процесса нанесения покрытия).
  3. Закройте покрытием тарелку с парафильмом для предотвращения испарения и хранить пластинку в холодильнике (4 ° С) O / N (примечание: использовать пластину в течение 1 недели).
  4. Аккуратно удалите LCS с пипетки Пастера без чтобыuching поверхность, покрытую и добавить 2 мл mTeSR1 среде одной яме.
  5. Теплый все культуры растворы (в том числе D-PBS) в ванну с водой 37 ° C в течение 25 мин.
  6. Преобразование HPSC колонии в NCM
    1. Диссоциируют клеточных агрегатов в одиночных камерах с Accutase, как описано в Протоколе 2.
    2. Семенной 1.3-2 х 10 6 hPSCs в один LN-521-лунке (1,4-2,1 х 10 5 клеток / см 2), не присутствии ингибиторов ROCK.
    3. Изменение средней в день в течение 3-х до 4 дней.
    4. Диссоциации клеток в 1 мл Accutase в день 3 или 4 для следующего пассирования клеток с соотношением сторон 1 до 3 расщепления.

. 6 Протокол 5: NCM Культура для плазмиды ДНК трансфекции

  1. Адаптация HPSC колонии NCM культуры, как описано в Протоколах 2 до 4.
  2. Тарелка диссоциирован hPSCs в 12-луночный планшет с клеточной плотности 7,5 х 10 5 клеток / лунку в mTeSR1 среде в присутствии 10 мкМ Y-27632.
  3. Заменить mTeSR1 среду с без наркотиков mTeSR1 среды между 4-8 ч после посева клеток.
  4. Для каждой трансфекции, развести 2,5 мкг плазмид экспрессии (например, pmaxGFP) и 5 мкл Lipofectamine 2000 в отдельных пробирки Эппендорф в 125 мкл каждого из Opti-MEM Снижение сыворотки Средний.
  5. Через 5 мин, смешать разбавленных реагентов и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре (для формирования трансфекции комплексов).
  6. Добавьте 250 мкл трансфекции комплексов в каждую лунку, содержащую hPSCs в 1 мл mTeSR1 среды и инкубируют клетки при 37 ° С в СО 2-инкубаторе в течение 24 часов.
  7. Изучите эффективность трансфекции под флуоресцентным микроскопом и фотографии случайно для расчета фактической эффективности трансфекции.

. 7 Протокол 6: NCM Культура для трансфекции микроРНК

  1. Диссоциируют полуконфлюентного hPSCs на 2-й день в условиях NCM добавлением 1 мл Accutase на лунку в 6 Лунками.
  2. Добавьте 10 мл mTeSR1 среды, чтобы разбавить ферментативных реакций и центрифуги при 200 х г в течение 5 мин.
  3. Ресуспендируют клеточный осадок с mTeSR1 среды, семян клетки при плотности 7,5 х 10 5 клеток на лунку в 12-луночный планшет в mTeSR1 среде, содержащей 10 мкм Y-27632, и пусть клетки приложить в течение 4 часов.
  4. Замените среду с Y27632 без mTeSR1 среды.
  5. Используйте имеющийся в продаже микроРНК (например, не-таргетинга miRIDIAN микроРНК трансфекции управления меченного Dy547). Titrate концентрациях от 0-160 нМ, используя предоставленные реагенты и следуйте инструкциям производителя.
  6. Оптимизация эффективность трансфекции для каждой концентрации в HPSC линий на визуализации флуоресценции Dy547 живых клеток под микроскопом через 24 часа после трансфекции.
  7. Вычислить эффективности трансфекции на основе процента положительных клеток Dy547 над всеми отображаемого клеток.
. TLE "> 8 Протокол 7: NCM Культура для трансдукции лентивирусным вектором

  1. Повторите шаги 7,1 до 7,4 Протокола 6.
  2. Рассчитайте количество вирусных частиц, которые будут использоваться для трансдукции: Используйте следующую формулу: ТУ = (МВД х CN) / VT, а ТУ обозначает общее количество преобразования единиц, МВД равна заданной множественности заражения в скважине (МВД или ТУ / элемент), CN определяет количество клеток в каждой лунке, и VT указывает на акции вирусные титры (ТУ / мл). Например, учитывая, что фондовые вирусные титры для SMART-shRNA вектора равна 1 х 10 9 ТУ / мл (трансформирующие единиц на мл), 7,5 х 10 5 клеток на лунку в момент трансдукции и ожидаемый МВД от 20: использовать 15 мкл из вирусных частиц фондовых для каждой скважины (обратите внимание: это условие рекомендуется для переходного индукции лентивирусным).
  3. Предварительно теплые 300 мкл mTeSR1 среде с 10 мг / мл полибрена течение 30 мин.
  4. Добавить 15 мкл фондовых вирусных частиц вподогретого mTeSR1 среду, содержащую полибрен и аккуратно перемешать раствор.
  5. Заменить клеточную культуральную среду 300 мкл предварительно нагретой среде, содержащей вирусные частицы.
  6. После 4 часов инкубации, изучить TurboGFP флуоресценции (производитель для выражения shRNA), чтобы определить эффективность трансдукции.
  7. Добавить 300 мкл дополнительной mTeSR1 среды в преобразовательного хорошо, когда клетки начинают выражать TurboGFP.
  8. После 12-16 часов инкубирования пересмотреть выражение турбо-GFP.
  9. Выполните необходимые эксперименты последующие с этих трансдуцированных клеток в течение 72 часов.

Результаты

Общая схема NCM культуры

Рисунок 1 представляет собой типичный NCM культуры схему, показывающую динамических изменений hPSCs после высокой плотности посева одноклеточных в присутствии ингибитора ROCK Y-27632. Эти морфологические изменения включают межклеточн?...

Обсуждение

Есть два основных пути к культуре hPSCs в пробирке: обычные колонии типа культуры (ячеек на фидерах или внеклеточных матриц) и подвеска культура hPSCs как агрегатов без фидеров 6. Ограничения и колонии типа подвески и методами культивирования включают накопленный неоднородность ?...

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

This work was supported by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) at the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. We would like to thank Dr. Ronald D. McKay for his discussion and comments on this project.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Countess automated cell counterInvitrogen Inc.C10227Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray SystemFaxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL Model RX-650X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL 6-well platesBecton Dickinson Labware353046Polystyrene plates
DMEMInvitrogen Inc.11965–092For MEF medium
Mitomycin CRoche107409Mitotic inhibitor
TrypsinInvitrogen Inc.25300-054For MEF dissociation
DMEM/F12Invitrogen Inc.11330–032For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Invitrogen Inc.31985-062For hPSC transfection
Heat-inactivated FBSInvitrogen Inc.16000–044Component of MEF medium
Knockout Serum ReplacementInvitrogen Inc.10828–028KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SalineInvitrogen Inc.14190-144D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acidsInvitrogen11140–050NEAA, component of hPSC medium
L-GlutamineInvitrogen 25030–081Component of hPSC medium
mTeSR1 & SupplementsStemCell Technologies5850Animal protein-free
TeSR2 & SupplementsStemCell Technologies5860Xeno-free medium
β-mercaptoethanolSigma M7522Component of hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC		American Type Culture Collection (ATCC) SCRC-1040For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified MatrigelBD Bioscience354277For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521BioLaminaLN521-02Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic)R&D Systems, MN223-FBGrowth factor in hPSC medium
CryoStor CS10StemCell Technologies7930
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-1041X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor IEMD4 Biosciences420099An inhibitor of Janus kinase
Y-27632EMD4 Biosciences688000ROCK inhibitor
Y-27632Stemgent04-0012ROCK inhibitor
Y-39983Stemgent04-0029ROCK I inhibitor
PhenylbenzodioxaneStemgent04-0030ROCK II inhibitor
ThiazovivinStemgent04-0017A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell StrainerBD Bioscience35234040 µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °CThermo Scientific C6516F-1“Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000Invitrogen Inc.11668-027Transfection reagents
DharmaFECT DuoThermo ScientificT-2010-02Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection ControlThermo ScientificIP-004500-01-05Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs 
SMART-shRNAThermo Scientific To be determinedLentiviral vector
pmaxGFPamaxa Inc (Lonza)Included in every transfection kitExpression plasmid for transfection control
Oct-4Santa Cruz Biotechnologysc-5279Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1Santa Cruz Biotechnologysc-21702Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4Santa Cruz Biotechnologysc-21704Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60Santa Cruz Biotechnologysc-21705 Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81Santa Cruz Biotechnologysc-21706Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51)Santa Cruz Biotechnologysc-8020Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoproteinSanta Cruz Biotechnologysc-8399AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19)Santa Cruz Biotechnologysc-9187FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1)Thermo ScientificMS-295-P0Mouse IgG1
DesminThermo ScientificRB-9014-P1Rabbit IgG
Anti-NANOGReproCELL Inc, JapanRCAB0004P-FPolyclonal antibody 
Rat anti-GFAPZymed13-0300Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3)Cedarlane Laboratories Ltd.CL2513AMouse IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4)DakoCytomation IncIR611/IS611Mouse IgG2a
NestinChemicon InternationalMAB5326Rabbit polyclonal antibody
TUBB3Convance IncMMS-435PTuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12)Cell Signaling Technologies3113Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution)Electron Microscopy Sciences15710PFA, fixative, diluted in D-PBS

Ссылки

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167 (2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

89Y 27632

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены