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要約

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

要約

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

概要

多系列成体組織に向かって差別化するhPSCsの容量は、心血管、肝臓、膵臓、および神経システム1-4を伴う重篤な疾患に苦しむ患者の治療に新たな道を開いた。 hPSCsから派生した様々な細胞型はまた、疾患のモデリング、遺伝子工学、薬物スクリーニング、および毒性試験1,4のための堅牢な携帯プラットフォームを提供するであろう。将来の臨床的および薬理学的用途を保証する重要な問題は、 インビトロでの細胞培養を介して臨床グレードhPSCs多数の生成である。しかし、現在の培養系ではコロニー5,6としてhPSCsの様々なフィーダーフィーダーフリーの培養液を含む、不十分であったり、本質的に可変のどちらかである。

hPSCs株哺乳動物の初期胚の内部細胞塊（ICM）の多くの構造的特徴のコロニー型の増殖。 ICMは3生殖層に分化する傾向がある多細胞の環境であるため、異種シグナル勾配の存在。このように、初期胚発生における不均一性の獲得は、分化に必要なプロセスであると考えますが、HPSC文化の不要な機能です。 HPSC培養における不均一性は、多くの場合、過度のアポトーシスシグナルおよび準最適な成長条件による自発的分化によって誘導される。従って、コロニータイプの培養で、不均一な細胞は、しばしば、コロニー7,8の周囲に観察される。また、ヒト胚性幹細胞（hESCの）中の細胞が、例えばBMP-4 9とシグナル伝達分子に展示差動応答をコロニーことが示されている。また、コロニー培養法は、制御不能の成長率およびアポトーシスシグナル伝達経路6,9に低い細胞収量だけでなく、凍結保存と非常に低い細胞回収率を生成する。近年、種々の懸濁培養は、培養のためにhPSCs particulが開発されているフィーダーマトリックスを含まない条件下6,10-13中hPSCs、大量の拡張のためアルリー。明らかに、別の培養システムは、独自の長所と短所を有する。一般に、hPSCsの不均一な性質を遺伝子工学6 hPSCsにDNAとRNAの物質を送達するための準最適であるのコロニー型および凝集培養法における主な欠点のうちの1つを表す。

明らかに、現在の培養方法のいくつかの欠点を回避する新しいシステムを開発する必要性が不可欠である。単一細胞の生存を改善する（このようなROCK阻害剤Y-27632およびJAK阻害剤1のような）低分子阻害剤の発見は解離し、HPSC文化14,15のための道を開く。これらの小分子を使用することで、我々は最近、非コロニー型（NCM）を解離·hPSCs 9の成長に基づいた培養法を開発した。この新規培養法は、単一細胞継代と高密度の両方を兼ね備え、メッキ法、私たちは主要な染色体異常9なしで一貫性のある成長サイクルの下で均質hPSCsを大量に生成することができます。あるいは、NCM培養は広い用途のための培養方法を最適化するために、異なる小分子と（例えば、ラミニンなど）が定義行列を用いて実施され得る。ここでは、NCMのカルチャに基づいて、いくつかの詳細なプロトコルを提示し、遺伝子工学のための詳細な手順を描く。 NCMプロトコルの汎用性を実証するために、我々はまた、多様なROCK阻害剤で、単一のラミニンアイソフォーム521（ すなわち 、LN-521）でNCM文化をテストしました。

プロトコル

hPSCsの単一細胞に基づく非植民地型単層（NCM）の文化。

1。準備

  1. 10％FBS、2mMのL-グルタミン、および0.1mM非必須アミノ酸（NEAA）を補充したDMEM培地：マウス胚線維芽細胞（MEF）の培養のための培地500mlを加える。
  2. DMEM培地中の0.1％ゼラチンでコーティングされた6ウェル細胞培養プレート上のルーチンプロトコル16と培養したMEF以下CF1株に由来するマウス胚線維芽細胞（MEF）細胞を単離する。代わりに、商業資源の一節3でMEFの株式を購入してください。
  3. マトリゲルプレートを準備します。
    1. -20℃の冷凍庫に50％ずつ、5（〜4℃で冷やした）DMEM/F12培地mlのストアとのhESC修飾マトリゲルの株式の5ミリリットルを希釈します。冷蔵庫（約4℃）、O / Nで凍結したマトリゲルのストックを解凍し、さらに（2.5％作用濃度を生じる）冷たいDMEM/F12培地中でマトリゲルを希釈。
    2. ウェルあたり1.5ミリリットル2.5％マトリゲルでコーティング6ウェル細胞培養プレートは、冷蔵庫、O / Nでのコートされたプレートを格納します（注：2週間以内にマトリゲルコートプレートを使用します）。
    3. プレートは10から30分間、細胞培養フード（注：細胞培養​​インキュベーター中でプレートを暖めるません）で、室温で温める、冷蔵庫からマトリゲルプレートを取り外し、吸引したDMEM培地前hPSCsをメッキする。
  4. 500ミリリットルのhESCの媒体を作る：80％DMEM/F12培地、20％KSR、2mMのL-グルタミン、0.1mMの非必​​須アミノ酸、0.1mMのβ-メルカプトエタノール、およびFGF-2の4 ng / mlの。
  5. 、60％のFBS、20％のDMSO、およびmTeSR1培地中に20μMのY-27632濾過により殺菌し、1週間以内にメディアを使用します。2X HPSC凍結培地10mlを準備します。

2プロトコル1（基本）：フィーダー上HPSCコロニーを育て

  1. 一貫resulを取得するために、HPSC培養のために5または6（P5とP6とする）で、MEFの継代数を使用して、TS。有糸分裂細胞を、1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）で3回、次いで0.53mMの0.05％トリプシンでのMEFを解離させる洗浄し、37℃で3時間、10μg/ mlのマイトマイシンCで細胞を処理することによってMEFのを不活性化EDTA。代わりに、X線照射で8000ラドの用量でのMEFを照射。
  2. 顕微鏡下で、トリパンブルー染色排除法を用いて細胞数を数える。別の方法として、自動セルカウンターを使用しています。
  3. 6ウェルポリスチレンプレート上にプレート照射されたMEFを、ウェル当たり1.88×10 5細胞（ すなわち 、1.96×10 4細胞/ cm 2）の密度で0.1％ゼラチンでコーティングした。 37℃で細胞をインキュベートし、5％CO 2で24時間。
  4. （この時に必要ない洗浄ステップに注意していない）パスツールピペットで吸引によりMEF培養液を除去します。
  5. 小さな塊に、前培養からの粉薬HPSCコロニー、FRの範囲にそれらのサイズを確保するために、顕微鏡下で塊を調べるOM 50径の100μmで、よくHPSC培地2mlを含む1にMEFフィーダー層の上にHPSC塊プレート。
  6. 3〜5日間の変化のhESC媒体中の毎日、写真で記録的コロニー成長、いかなる形態学的に改変されたまたは分化コロニー（〜5％）をマークし、手動でパスツールピペットで吸引によって静かにマークされたコロニーを削除します。
  7. 二回のMEF上の残りのコロニーをすすぐ（2分間D-PBSで各々）、10〜30分間HPSC培地中1 mg / mlのコラゲナーゼIV 2mlのコロニーをインキュベート）からHPSCコロニーの分離を調べるMEF-被覆された表面（注：コロニーをしっかりとプレートに取り付けられている場合にのみ、剥離プロセスを支援するためにスクレーパーを使用します）。
  8. 、15mlチューブに酵素反応、転写コロニーを最小限HPSCコロニーをRTで3〜5分間沈降することができ、およびcの直接可視化することによりコロニーの沈降を確実にするために各ウェルにHPSC培地5mlを追加チューブの底のエル（注：このステップでチューブを遠心分離しないでください）​​。
  9. 残留したMEFを含む上清を取り出して、単一細胞を解離し、ヒトES細胞培地5mlでコロニーを再懸濁し、二度沈降手順を繰り返します。
  10. 細胞継代のための6ウェルプレートに（1良く凍結バイアルあたりの集密）またはプレート凍結保存のための媒体（またはCryoStore CS10凍結培地）を凍結1X HPSCの小さな塊、店にミディアム、粉薬HPSCコロニーを削除します。

3プロトコル2：NCMにHPSCコロニーをフィーダからの変換

  1. 一度D-PBSでHPSCペレットをすすぎ、10分間1XをAccutase 1mlでペレットをインキュベートし、単一細胞解離を保証するために、顕微鏡下で酵素反応を調べる。
  2. 穏やかに5分間、室温で200×gの遠心分離、続いて10μMのY-27632を含有mTeSR1培地5ml中で細胞を再懸濁することにより酵素反応を停止さ（細胞の損傷の原因となる過剰な遠心力を使用しないでください）​​。
  3. ペレットにmTeSR1培地5mlを追加し、単一細胞としてペレットを再懸濁し、フィルターは40ミクロ​​ンセルストレーナー（残留細胞凝集体を除去するために）を通して細胞を解離した。
  4. 1ウェルにシード1.3-2×10 6 hPSCsは2.5％のhESC修飾マトリゲルでコーティングした6ウェルプレートの（1.4から2.1×10 5細胞/ cm 2）を 、2.5ミリリットルまでmTeSR1培地を追加し、10μMを含む培地中のY-27632（初期24時間単細胞メッキを容易にするため）。代わりに、単一セルのメッキを向上させるために、10μMのY-27632を交換するには、以下の小さな分子を利用さ1μmのY 39983（I阻害ROCK）、1μMのphenylbenzodioxane（ROCK II阻害剤）、1μMのthiazovivin（小説ROCK阻害剤を） 、および2μMのJAK阻害剤1。
  5. （24時間以内）の次の日に薬物を含まないmTeSR1培地で培地を交換して、余分な1から細胞を解離ウェル、および単一細胞播種効率を決定するために細胞数をカウントし（注：およそ、この段階で達成することができる単一細胞プレーティング効率の50〜90％で）。
  6. 細胞がmTeSR1培地3mlで数日間、単一セルに形成された単層として成長することができます。毎日培地交換。
  7. 経験的に継代のスケジュールを決定する細胞密度に依存してNCMに適合される。細胞増殖は、細胞間の境界線が消失した後3日目または4日目にコンフルエンスに達し、又は4時間の時点で通路。をAccutase 1mlの細胞を解離、細胞継代のために1〜3個の分割比（6ウェルプレートの3ウェルに播種した細胞、すなわち 、1コンフルエントウェル）を使用し、5継代によって適応NCMを安定化させる。
  8. 細胞凍結
    1. 1凍結バイアル用（〜5-6×10 6細胞）とともに1集密を利用：10分をAccutaseの1ミリリットルとよく1コンフルエントから細胞を解離する。
    2. 希薄W上記のようにmTeSR1媒体遠心細胞のi番目の5ミリリットル。
    3. mTeSR1培地500μl中にペレットを再懸濁した後、徐々に凍結保存バイアル中で（20μMのY-27632を含む）2X HPSC凍結培地500μlを加える。代わりに、10μMのY-27632または2のどちらか100μMのJAK阻害剤1の存在下での2100μMのJAK阻害剤1または1x CryoStor CS10培地を含む1X HPSC凍結培地中で細胞を再懸濁。
    4. 氷冷低温容器（isopranol底で満たされた）に凍結バイアルを置き、すぐに-80℃の冷凍庫に冷凍容器を移す。
    5. 長期間の凍結保存のために（翌日の）液体窒素タンクに℃の冷凍庫から-80細胞を移す。
  9. 細胞融解
    1. 6ウェルプレートの1だけでなく、メッキ用の凍結保存バイアルを利用する。
    2. 10分間37℃の水浴で2分間、同じ水浴中で解凍細胞において前加温mTeSR1培地滴下10μMのY-27632を含む予め温めmTeSR1培地5mlにセルを追加し、上記のように遠心します。
    3. 静かに、10μMのY-27632を含むmTeSR1培地2mlで細胞ペレットを再懸濁し、ゆっくりと（注：空気の泡を発生しないよう）十分にマトリゲルでプレコートに細胞を移す。
    4. 毎日培地交換し、HPSCの成長が3日または4でコンフルエントに達することを期待しています。

4プロトコル3：NCM文化にマトリゲル上HPSCコロニーを変換する

  1. 冷蔵庫からマトリゲルコートプレートを外し、10から30分間組織培養フードにプレートを置き、プレートの各ウェルから培地を除去し、各ウェルに予め温めmTeSR1培地2mlを加える。
  2. 転送は、上記のマトリゲル板にフィーダー文化（基本プロトコールのステップ2.10）からHPSC塊を粉砕した。各ウェルの2.5ミリリットル最終容量までmTeSR1媒体を追加します。
  3. 3から4日間、毎日培地を交換コロニーは百分の80から90までのコンフルエンスに到達するまでだ。
  4. 細胞継代のために：二回D-PBSですすぎコロニーを15〜20分間、37℃で2 mg / mlのディスパーゼ1mlで細胞を処理し、塊として沈殿し、継代細胞。
  5. NCM培養のため：3.1 3.9には、議定書2に記載された手順を繰り返します。

5プロトコル4：上hPSCsのNCM文化LN-521

  1. 使用する日の前に、4℃で、組換えLN-521溶液を解凍し、最終濃度を（のCa 2 + / Mg 2 +を含有） を 1×D-PBSで解凍し、ラミニン希釈することによりラミニンコーティング溶液（LCS）を作る10μg/ mlの。
  2. （：ドライアウト塗装工程の間は避けてください）​​6ウェルプレートに1にLCSの1ミリリットルを追加します。
  3. 蒸発を防ぐため、冷蔵庫（4℃）のO / N（：1週間以内にプレートを使用してください）​​で、プレートを格納するためのパラフィルムでコーティングされたプレートをシール。
  4. 静かにすることなく、パスツールピペットでLCSを削除コー​​ティングされた表面をuching、よく1にmTeSR1培地2mlを加える。
  5. 25分間37℃の水浴中で（D-PBSを含む）すべての培養液を温める。
  6. HPSCコロニーはNCMに変換
    1. 議定書2に記載されているようにして、Accutaseを持つ単一の細胞に細胞凝集を解離する。
    2. シード1.3-2×10 ROCK阻害剤の存在なしに1よくLN-521でコーティングされた（1.4から2.1×10 5細胞/ cm 2）に6 hPSCs。
    3. 3から4日間、毎日培地を交換。
    4. 1〜3個の分割比を使用して次の細胞継代のために3日目または4にして、Accutase 1ml中の細胞を解離する。

6プロトコル5：NCM文化プラスミドDNAトランスフェクションのために

  1. 4のプロトコル2で説明したように、NCMの文化にHPSCコロニーを適応させる。
  2. プレートを10μMY-2763の存在下でのmTeSR1培地において5細胞/ウェル7.5×10 6の細胞密度で12ウェルプレート中hPSCs解離2。
  3. 細胞をプレーティングした後4-8時間の間に薬物を含まないmTeSR1培地でmTeSR1培地を交換してください。
  4. 各トランスフェクションのために、（ 例えば 、pmaxGFP）発現プラスミド2.5μgのを希釈し、125μlののOpti-MEMのそれぞれに別々のエッペンドルフチューブ中のリポフェクタミン2000の5μlの血清培地を削減。
  5. 5分後、希釈された試薬を混合し、（トランスフェクション複合体を形成する）を室温で20分間インキュベートする。
  6. 1ミリリットルmTeSR1培地中の各ウェルを含むhPSCsに250μlのトランスフェクション複合体を追加し、24時間、CO 2インキュベーター内で37℃で細胞を培養する。
  7. 実際のトランスフェクション効率の計算のために、ランダムに蛍光顕微鏡と写真の下にトランスフェクション効率を調べます。

7プロトコル6：NCM文化マイクロRNAのトランスフェクションのために

  1. 6ウェル当たりをAccutaseを1mlを添加してNCM条件下で、2日目に、半コンフルエントhPSCsを解離ウェルプレート。
  2. 5分間200×gでの酵素反応と遠心分離機を希釈するmTeSR1培地10mlを追加します。
  3. mTeSR1培地で細胞ペレットを再懸濁し、10μMのY-27632を含有mTeSR1培地中で12ウェルプレート中ウェル当たり7.5×10 5細胞の密度で細胞を播種し、細胞を4時間インキュベートさせて取り付ける。
  4. Y27632フリーmTeSR1培地で培地を交換してください。
  5. 市販のマイクロRNA（ 例えば 、DY547で標識された非標的miRIDIAN miRNAのトランスフェクションコントロール）を使用します。提供される試薬を用いて、0〜160 nmの範囲の濃度を滴定し、メーカーの指示に従ってください。
  6. トランスフェクション後24時間で、顕微鏡下で生きている細胞のDY547蛍光を撮像してHPSC株では各濃度のトランスフェクション効率を最適化します。
  7. すべての画像化された細胞の上DY547陽性細胞の割合に基づいてトランスフェクション効率を計算します。
レンチウイルスベクターの形質導入のためのNCM文化：。> 8議定7 TLE "

  1. 繰り返します議定書6の7.4に7.1を繰り返します。
  2. TUは単位を変換の総数を表すのに対し、MOIは、ウェル内感染の所望の多重度を等しく、TU =（MOIがCNのX）/ VT（MOIまたは：次の式を使用します。形質導入のために使用されるウイルス粒子の量を算出TU /細胞）、CN、各ウェル中の細胞数を指定し、VTは、ストックのウイルス力価（TU / ml）を示す。例えば、SMART-shRNAベクターのための在庫のウイルス力価（1mlあたりの単位を変換する）、1×10 9 TU / mlに等しいことを考えると、7.5×10 5形質導入の際にウェル当たり細胞および20の予想されるMOIは：15を使用し各ウェルのための株式のウイルス粒子液（注意：この条件は、一過性のレンチウイルス誘導のために推奨されます）。
  3. 30分間のポリブレン10 mg / mlのとmTeSR1媒体の前のウォーム300μL。
  4. に株式ウイルス粒子の15μLを追加予め温めmTeSR1媒体はポリブレンを含む、ゆっくりと溶液を混合。
  5. ウイルス粒子を含む予め温め培地300μlの細胞培養培地を交換してください。
  6. 4時間のインキュベーションの後、形質導入効率を決定するためにturboGFP蛍光（shRNA発現用のメーカー）を調べる。
  7. 細胞はturboGFPを発現し始めるときだけでなく変換に追加のmTeSR1培地300μlを加える。
  8. 12〜16時間インキュベートした後、ターボGFP発現を見直す。
  9. 72時間内にこれらの形質導入細胞で所望のフォローアップ実験を行う。

結果

NCM文化の一般的なスキーマ

図1に、ROCK阻害剤Y-27632の存在下での高密度単一細胞めっき後hPSCsの動的な変化を示す典型的なNCM培養スキーマを表します。これらの形態学的変化は、細胞のクラスター形成をプレーティングし、細胞縮合、続いて指数関数的な細胞増殖（ 図1A）の後に細胞間接続を含む。代表的な実験は、1日目に、10μMのY...

ディスカッション

従来の（フィーダまたは細胞外マトリックス上の細胞の）コロニー型の文化やフィーダー6のない集合体としてhPSCsの懸濁培養：in vitroでの培養hPSCsには、2つの主要な方法があります。コロニー型とサスペンションの両方培養法の制限は累積異質と継承エピジェネティックな変化があります。 NCM培養物は、単一細胞継代及び高密度細胞播種の両方に基づいて、HPSC成長6,18?...

開示事項

The authors declare that they have no competing financial interests.

謝辞

This work was supported by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health (NIH) at the National Institute of Neurological Disorders and Stroke. We would like to thank Dr. Ronald D. McKay for his discussion and comments on this project.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Countess automated cell counterInvitrogen Inc.C10227Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray SystemFaxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL Model RX-650X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL 6-well platesBecton Dickinson Labware353046Polystyrene plates
DMEMInvitrogen Inc.11965–092For MEF medium
Mitomycin CRoche107409Mitotic inhibitor
TrypsinInvitrogen Inc.25300-054For MEF dissociation
DMEM/F12Invitrogen Inc.11330–032For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Invitrogen Inc.31985-062For hPSC transfection
Heat-inactivated FBSInvitrogen Inc.16000–044Component of MEF medium
Knockout Serum ReplacementInvitrogen Inc.10828–028KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SalineInvitrogen Inc.14190-144D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acidsInvitrogen11140–050NEAA, component of hPSC medium
L-GlutamineInvitrogen 25030–081Component of hPSC medium
mTeSR1 & SupplementsStemCell Technologies5850Animal protein-free
TeSR2 & SupplementsStemCell Technologies5860Xeno-free medium
β-mercaptoethanolSigma M7522Component of hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC		American Type Culture Collection (ATCC) SCRC-1040For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified MatrigelBD Bioscience354277For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521BioLaminaLN521-02Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic)R&D Systems, MN223-FBGrowth factor in hPSC medium
CryoStor CS10StemCell Technologies7930
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-1041X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor IEMD4 Biosciences420099An inhibitor of Janus kinase
Y-27632EMD4 Biosciences688000ROCK inhibitor
Y-27632Stemgent04-0012ROCK inhibitor
Y-39983Stemgent04-0029ROCK I inhibitor
PhenylbenzodioxaneStemgent04-0030ROCK II inhibitor
ThiazovivinStemgent04-0017A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell StrainerBD Bioscience35234040 µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °CThermo Scientific C6516F-1“Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000Invitrogen Inc.11668-027Transfection reagents
DharmaFECT DuoThermo ScientificT-2010-02Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection ControlThermo ScientificIP-004500-01-05Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs 
SMART-shRNAThermo Scientific To be determinedLentiviral vector
pmaxGFPamaxa Inc (Lonza)Included in every transfection kitExpression plasmid for transfection control
Oct-4Santa Cruz Biotechnologysc-5279Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1Santa Cruz Biotechnologysc-21702Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4Santa Cruz Biotechnologysc-21704Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60Santa Cruz Biotechnologysc-21705 Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81Santa Cruz Biotechnologysc-21706Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51)Santa Cruz Biotechnologysc-8020Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoproteinSanta Cruz Biotechnologysc-8399AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19)Santa Cruz Biotechnologysc-9187FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1)Thermo ScientificMS-295-P0Mouse IgG1
DesminThermo ScientificRB-9014-P1Rabbit IgG
Anti-NANOGReproCELL Inc, JapanRCAB0004P-FPolyclonal antibody 
Rat anti-GFAPZymed13-0300Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3)Cedarlane Laboratories Ltd.CL2513AMouse IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4)DakoCytomation IncIR611/IS611Mouse IgG2a
NestinChemicon InternationalMAB5326Rabbit polyclonal antibody
TUBB3Convance IncMMS-435PTuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12)Cell Signaling Technologies3113Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution)Electron Microscopy Sciences15710PFA, fixative, diluted in D-PBS

参考文献

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167 (2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

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