-سهلت صوتنة المناعي تلطيخ المرحلة الجنينية في وقت متأخر من اليرقات و<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة<em&gt; في الموقع</em

Summary

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

الدراسات التي أجريت في الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة واليرقات توفر البصيرة الحاسمة في العمليات التنموية مثل مواصفات مصير الخلايا وتوالد الأعضاء. المناعية يسمح التصور تطوير الأنسجة والأعضاء. ومع ذلك، بشرة الواقية التي تشكل في نهاية مرحلة التطور الجنيني يمنع تخلل الأجسام المضادة في أواخر مرحلة الأجنة واليرقات. بينما تشريح قبل المناعية يستخدم بانتظام لتحليل أنسجة اليرقات ذبابة الفاكهة، فإنه يثبت عدم كفاءة بعض التحليلات لأن الأنسجة الصغيرة قد يكون من الصعب تحديد وعزل. يوفر صوتنة بديلا للتشريح اليرقات في بروتوكولات المناعية ذبابة الفاكهة. أنه يسمح للسريع، وتجهيز وقت واحد من عدد كبير من الأجنة في مرحلة متأخرة واليرقات ويحافظ على التشكل في الموقعي. بعد التثبيت في الفورمالديهايد، وsonicated عينة. ثم يتم إخضاع العينة لالمناعية مع مستضد معين نملة الأساسيibodies والأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى لتصور أنواع الخلايا المستهدفة وبروتينات معينة عبر مضان المجهري. خلال عملية صوتنة، تحديد المكان المناسب لتحقيق sonicating فوق العينة، فضلا عن مدة وشدة صوتنة، أمر بالغ الأهمية. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات طفيفة الاضافيه المناعية بروتوكولات قياسية للبقع عالية الجودة. عن الأجسام المضادة مع إشارة إلى انخفاض نسبة الضوضاء، مرات حضانة أطول ضرورية عادة. كدليل على مفهوم لهذا البروتوكول، سهلت صوتنة، وتبين لنا immunostains من ثلاثة أنواع الأنسجة (الخصيتين والمبيض، والأنسجة العصبية) في مجموعة من المراحل التنموية.

Introduction

ذبابة الفاكهة الأجنة واليرقات توفر نموذجا ممتازا لدراسة العمليات التنموية في كثير من الأعضاء والأنسجة. التصوير من الخلايا الفردية غالبا ما يكون ضروريا في هذه الدراسات من أجل التأكد من البيئات المعقدة التي تتطور الخلايا. التصور من الخلايا في الأنسجة ويمكن تحقيق ذلك من خلال المناعية. موصوفة وصفا جيدا المناعية وجود بروتوكولات لذبابة الفاكهة الأنسجة الجنينية <17 ساعة بعد وضع البيض (أيل ليماسول) ^1-3. ومع ذلك، فإن أشكال بشرة وقائية في نهاية مرحلة التطور الجنيني، ومنع تخلل فعالية الأجسام المضادة. وبالتالي، هذه البروتوكولات المناعية غير فعالة في تحليل أنسجة الأجنة في المراحل المتأخرة وفي مراحل لاحقة من نمو اليرقات (1 ^ش الطور (L1)، 2 الطور ^الثاني (L2)، و 3 الطور ^الثالث (L3)). هذا عدم الكفاءة تفرض عائقا أمام فهمنا للعمليات الحيوية التي تحدث خلال هذه الفترة التنموية طويلة ^4. TISSرق تشريح هي تقنية تستخدم على نطاق واسع للتحايل على هذا الحاجز ^5-7. ومع ذلك، يمكن تشريح يثبت غير فعالة. يمكن استخراج المرهونة من قبل صعوبة في تحديد أو عزل الجنينية والأنسجة اليرقات. وعلاوة على ذلك، وإزالة المادية من الأنسجة المستهدفة قد يسبب الضرر الناجم عن تمزق لهم أو بعدم استخراجها في مجملها.

صوتنة هو الطريقة التي توظف الموجات الصوتية لزعزعة التفاعلات بين الجزيئات. وقد تم استخدامه لتعطيل سلامة بشرة اليرقات ذبابة الفاكهة من أجل immunostain تطوير أنواع الخلايا العصبية ^6. وقد تم تكييف هذا البروتوكول لimmunostain أواخر المرحلة الجنينية والغدد التناسلية اليرقات، التي يمكن أن تكون صغيرة مثل 50μm في قطر ^8-10. من خلال هذه الدراسات، وقد اتسمت عملية الخلايا الجذعية الجرثومية (GSC) تشكيل مكانة الذكور في مرحلة متأخرة أجنة ذبابة الفاكهة ^8-10 وآليات تنظيم وتطوير الخلايا الجذعية المتنوعةتم توضيح ferentiation في مرحلة متأخرة الغدد التناسلية الجنينية واليرقات ^9-12. وبالتالي، يوفر صوتنة بديل فعال لتشريح الأنسجة التي قد تكون صعبة بسبب حجم الأنسجة. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن المناعية الأنسجة ذبابة الفاكهة في الموقع، وترك الخلايا داخل سياق كائن كامل والحفاظ على التشكل في الموقعي. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة لالمناعية مضان من أواخر المرحلة الجنينية في وقت مبكر من خلال / الأنسجة منتصف L3 في الموقع. ويظهر تحليل ذبابة الفاكهة الغدد التناسلية والعصبية في الأنسجة ممثل النتائج لإثبات فعالية هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها هذا البروتوكول المناعية لتحليل الأنسجة ذبابة الفاكهة الأخرى وكذلك في أنسجة الكائنات الحية الأخرى ذات بشرة الخارجي.

Protocol

1. إعداد قفص مجموعة

1. تخدير الشباب، والذباب خصبة مع CO _2. نقل الذباب تخدير إلى القفص. للحصول على العائد الأمثل، استخدم 100-120 الذباب الكبار تتراوح بين 2-7 أيام من العمر في 4: 1 نسبة الإناث إلى الذكور. السماح الذباب فترة التأقلم المناسبة، ~ 24 ساعة قبل الحصول على عينة لتثبيت. إذا تم تعيين قفص مع الإناث البكر لتزاوج الذكور، استخدام 36 - فترة التأقلم 48 ساعة.
2. في نهاية مفتوحة من القفص، وضع معدة سلفا عصير التفاح لوحة أجار مع انخفاض سنتات الحجم من معجون الخميرة في وسط خلال افتتاح القفص. ثم، مع تأمين الشريط. اغلاق تقاطع بين لوحة أجار عصير التفاح والقفص مع parafilm.
3. وضع القفص في وعاء مع عصير التفاح الثانوية وحة أجار كقاعدة والسماح للذباب إعادة عند درجة حرارة محددة لفترة زمنية مناسبة على النحو الذي يحدده التجربة.
   ملاحظة: مرات جمع العينات وايسوف تختلف. على سبيل المثال، عندما جمع أواخر مرحلة الأجنة / L1 اليرقات المبكرة (17 - 24 ساعة)، والسماح الذباب لتضع بيضها على لوحات أجار عصير التفاح لمدة 7 ساعة عند 25 درجة مئوية قبل الشيخوخة من العينة لمدة 17 ساعة عند 25 درجة مئوية. وبالمثل، لمجموعة من منتصف أواخر أول يرقات العمر (36 - 48 ساعة) تسمح الذباب لتضع بيضها لمدة 12 ساعة عند 25 درجة مئوية قبل الشيخوخة من العينة لمدة 36 ساعة عند 25 درجة مئوية.
4. مرة واحدة في فترة زمنية كاملة، اضغط على قفص على طاولة بحيث تنخفض الذباب بعيدا عن لوحة أجار عصير التفاح بدون تخدير. بسرعة استبدال لوحة استخدامها مع واحد الطازجة التي تحتوي على قطرة من معجون الخميرة. تأمين لوحة جديدة مع الشريط وparafilm وتخزين قفص مع عصير التفاح لوحة أجار كقاعدة.
5. إزالة بعناية قطرة من لوحة الخميرة المستخدمة مع ملعقة معدنية. مكان غطاء على استخدام عصير التفاح لوحة وضعت الأجنة تسمح للسن إذا لزم الأمر تجريبيا.
   ملاحظة: على الرغم من الشيخوخة العينات، قد يتم تخزين لوحات عند 25 درجة مئوية ما لم ارتفاع درجات الحرارة هي experimentaLLY المطلوبة. أمثلة على كيفية العمر الأجنة لجمع والمذكورة أعلاه (انظر الملاحظة للخطوة 1.3). تتم إزالة عجينة الخميرة قبل عينة الشيخوخة لمنع اليرقات من الزحف إلى الخميرة وكسر آغار تحتها. ما تبقى من أجار عصير التفاح ومعجون الخميرة بقايا توفر المغذيات اللازمة للنمو اليرقات. بينما فقدت الأجنة وضعت مباشرة في عجينة الخميرة من خلال إزالة عجينة الخميرة، وهذه الخسارة هي أفضل من الخميرة وبقايا أجار في العينة التي يمكن أن تقلل كفاءة تلطيخ. ينبغي للمرء أن يختار عدم إزالة عجينة الخميرة، قد يكون المسال الخميرة مع الفوسفات العازلة تريتون X-100 (PBTx)، ويخلط مع فرشاة الطلاء، ومن ثم إزالتها من العينة مع مصفاة الخلية قبل التثبيت.

2. التثبيت

1. مرة واحدة الأجنة وضعت على طبق عصير التفاح أجار والذين تتراوح أعمارهم بين لنقطة الوقت المطلوب، واستخدام الفرشاة المبللة صغيرة مع الفوسفات العازلة تريتون X-100 (PBTx) حل لإزالة بعناية عينة من اللوحة الإلكترونية.
   ملاحظة: أقدم يرقات متحركة، ويمكن الزحف على الجهة الداخلية من الغطاء. يمكن جمع هذه العينة مماثل مع إزالة الفرشاة.
2. مسح عينة الفرشاة المحملة ضد التلال التي تواجه المناطق الداخلية من مصفاة الخلية. ثم، وشطف جدران مصفاة والفرشاة مع زجاجة بخ تحتوي على حل PBTx. وضع غطاء طبق بتري تحت مصفاة لالتقاط حل PBTx.
3. بعد أن تم نقل كل عينة إلى مصفاة، صب بما فيه الكفاية PBTx في مصفاة لرفع عينة من شبكة. ثم، رفع مصفاة وتصب محتويات طبق بتري في حاوية النفايات السائلة.
4. كرر الخطوة 2.3 ثلاث مرات لإزالة الخميرة وذبابة النفايات التي قد تم نقلها جنبا إلى جنب مع العينة.
5. صب يكفي 50٪ التبييض (NaOCl) / الماء ([ده ₂ O) حل في مصفاة لجمع اليرقات من على شبكة. تسمح اليرقات على الجلوس في حل لمدة 5 دقائق. ثم، رفع مصفاة واسكب رانه محتويات طبق بتري في حاوية النفايات السائلة.
   مطلوب التبييض فقط في عينات الجنينية الذين تتراوح أعمارهم بين 0-22 ساعة من أجل إزالة الغشاء المشيمي: مذكرة. يمكن حذف تطبيق التبييض لعينات القديمة، ولكن إدراجه ليس ضارا. إذا كان المطلوب إغفال أو استبدال التبييض في هذه الخطوة مع PBTx. ينبغي استخدام التبييض المخفف خلال 24 ساعة من إعداد الحل.
6. غسل العينة في مصفاة مع PBTx بسكب ما يكفي PBTx في مصفاة لرفع عينة من شبكة. تسمح عينة للجلوس في محلول لمدة 3 دقائق. ثم، رفع مصفاة وتصب محتويات طبق بتري في حاوية النفايات السائلة.
7. كرر الخطوة 2.6 خمس مرات.
8. ربت أسفل مصفاة الخلية الجافة، ثم نقل العينة إلى قارورة التلألؤ تحتوي على 1.75 مل من محلول PEMS باستخدام الفرشاة.
9. العمل في غطاء الدخان التهوية، إضافة 250 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ و 8 مل من هيبتان الصف كاشف للقارورة التلألؤ.
   ملاحظة: الفورمالديهايد وهيبتان والخطرة. لأغراض السلامة، ومواصلة العمل في غطاء الدخان التهوية وارتداء القفازات المناسبة لخطوات 2،9-3،3.
10. تسمح القارورة إلى هزة في 200 دورة في الدقيقة أو بسرعة معتدلة مماثلة لمدة 20 دقيقة.
11. إضافة 10 مل من الميثانول إلى قارورة التلألؤ دون إزالة المرحلة المائية السابقة والسماح القارورة إلى هزة بقوة في 500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: الميثانول هو الخطرة. مواصلة العمل في غطاء الدخان التهوية وارتداء القفازات المناسبة.
12. إزالة قارورة من شاكر وعلى الفور صب محتويات في مصفاة الخلية أكثر من حاوية النفايات السائلة في غطاء محرك السيارة. إضافة الميثانول اضافية لالقارورة وتعمل من خلال مصفاة الخلية اللازمة لضمان تمت إزالة كل عينة.
    ملاحظة: مصافى الخلية قد تستنزف ببطء. لتصحيح هذا، لمس الأنسجة المختبر إلى أسفل مصفاة الخلية من أجل استخلاص الحل من خلال مصفاة بسرعة أكبر. والميثانول، وينبغي أن يكون الفورمالديهايد، وهيبتانتخزينها في حاويات النفايات المناسبة حتى التخلص السليم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
13. أسفل الجافة من مصفاة الخلية باستخدام مختبر الأنسجة، ثم استخدام الفرشاة لنقل عينة المأسورة في مصفاة لأنبوب 1.5 مل microcentrifuge تحتوي 0.5 مل من الميثانول.
    ملاحظة: إذا قارورة التلألؤ متعددة قيد الاستخدام، أكمل الخطوات 2.12 و 2.13 قارورة واحدة في وقت واحد لمنع عينة من الجفاف على مصافى الخلية.
14. مرة واحدة تم إضافة العينة إلى أنبوب microcentrifuge، إزالة الميثانول مع ماصة. استقر ضمان العينة إلى أسفل الأنبوب.
15. شطف العينة في أنبوب microcentrifuge بإضافة حوالي 0.5 مل من الميثانول إلى الأنبوب. الانتظار لعينة لتسوية ثم إزالة الميثانول مع ماصة.
16. كرر الخطوة 15 ثلاث مرات.
17. إضافة 0.5 مل من الميثانول إلى أنبوب، ومن ثم تخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

3. الإماهة وإعداد نموذج للالمناعية

1. إزالة الميثانول من أنبوب microcentrifuge مع ماصة، وترك العينة في أنبوب. الميثانول مخزن النفايات إلى حاوية النفايات المناسبة حتى وقت التخلص السليم.
   ملاحظة: لتعزيز كفاءة صوتنة، استخدم ما لا يزيد عن 3 ملم من عينة استقرت في أسفل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. يجوز نقل عينة الزائدة إلى أنبوب منفصل مع ماصة قبل البدء في خطوة الإماهة أعلاه. قطع غيض ماصة مع شفرة حلاقة نظيفة يمكن استخدامها لمنع انسداد طرف ماصة.
2. إضافة 1.0 مل من 50٪ الميثانول / الفوسفات العازلة توين (PBTw) حل للأنبوب والصخور لمدة 3 دقائق.
3. إزالة حل الميثانول إلى حاوية النفايات المناسبة وشطف مع 1.0 ميكرولتر من PBTw مرتين. بعد كل شطف، والسماح للعينة ليستقر قبل الرسم قبالة PBTw مع ماصة.
4. إضافة 1.0 مل من مصل بقري الزلال / الفوسفات مخزنة توين (BBTw) مزيج إلى القارورة والصخور. بعد 3 دقائق على الكرسي الهزاز، والسماح للعصيدةلو لتسوية وإزالة BBTw مع ماصة.
5. كرر الخطوة 3.4 مرتين مع الحرص على إزالة BBTw قدر الإمكان دون أن تفقد العينة بعد غسل الماضي.
6. إضافة 0.5 مل من BBTw إلى الأنبوب ووضع أنبوب على الجليد.

4. صوتنة من عينة

1. تعيين sonicator إلى 10٪ كحد أقصى السعة وتعيين وقت التشغيل من 2 ثانية صوتنة المستمر.
   ملاحظة: هذه الإعدادات خاصة إلى sonicator مبين في الجدول المواد والمعدات وربما تتطلب الأمثل لsonicators مختلف.
2. قبل صوتنة من العينة، وتنظيف التحقيق sonicator عن طريق وضع تلميح التحقيق في أنبوب مخروطي 50 مل مليئة منزوع الأيونات الماء وتشغيل sonicator لتنظيف التحقيق. التحقيق sonicator الجاف مع مختبر الأنسجة بعد التشغيل.
3. غمر التحقيق في أنبوب microcentrifuge تحتوي العينة بحيث يتم وضعه ما يقرب من 3 إلى 4 مم فوق العينة وبدء صوتنة.
4. إزالة مأنبوب icrocentrifuge ووضعه على الجليد لمدة 30 ثانية على الأقل لتبديد الحرارة من صوتنة والسماح عينة ليستقر على مستوى الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge.
5. كرر الخطوات من 4.3 و 4.4 حسب الحاجة على أساس العمر من العينة التي يجري تجهيزها.
   ملاحظة: بالنسبة لحجم العينة الأمثل صوتنة والأجنة الذين تقل أعمارهم عن 17 ساعة لا تتطلب صوتنة، ولكن الذين تتراوح أعمارهم بين 17 و 24 ساعة (مرحلة 17 / أوائل-L1) تتطلب اثنين sonications. اليرقات بين 24 - 36 (أوائل / أواسط-L1)، 36 - 48 (منتصف / أواخر-L1)، 48-60 (أوائل / أواسط L2)، 60-72 (منتصف / أواخر-L2)، 72-84 ( في وقت مبكر-L3)، 84-96 (أوائل / أواسط L3)، 96-108 (منتصف / أواخر-L3) ساعة تتطلب 5، 9، 11، 13، 15، 18، و 22 sonications على التوالي. انظر المناقشة لمزيد من التفصيل في الأوقات صوتنة.
6. شطف مع 1.0 مل BBTw مرتين. بعد كل شطف سماح العينة ليستقر قبل الرسم قبالة BBTw مع ماصة.
7. إضافة 1.0 مل من BBTw إلى القارورة والصخور. بعد 3 دقائق على الروك، والسماح للعينة لتسوية وإزالة BBTw مع ماصة.
8. كرر الخطوة 4.7 مرتين.

5. المناعية

1. منع العينة بإضافة المصل العادي 5٪ المخفف في BBTw إلى أنبوب microcentrifuge. إزالة كتلة بعد هزاز لمدة 1 ساعة.
   ملاحظة: استخدام مصل طبيعي من الأنواع التي يتم إنشاء الأجسام المضادة الثانوية.
2. تمييع الأجسام المضادة الأولية المناسبة لتركيز العمل في 5٪ المصل العادي / BBTw الحل.
3. عينة الصخور في الابتدائي يا حل الأجسام المضادة / N عند 4 درجات مئوية أو على الأقل لمدة 3 ساعة على RT (حوالي 22 درجة مئوية.
   ملاحظة: قد تتغير مدة حضانة الأجسام المضادة ودرجات الحرارة. O / N الحضانة عند 4 درجات مئوية أو 3 ساعة على RT يكفي عادة. ومع ذلك، فإن فترة حضانة المرض لمدة يومين قد يؤدي إلى تعزيز جودة تلطيخ، وخاصة مع عينات القديمة أو عند استخدام الأجسام المضادة الأولية منخفضة تقارب. وعادة ما يتم تنفيذ حضانات أطول في 4 درجات مئوية. يجب أن يتم اعتبارات مماثلة عند استخدام الأجسام المضادة الثانوية (انظر 5.10).
4. السماح عينة لتستقر فيأسفل microfuge أنبوب. رسم من الأجسام المضادة الأولية مع ماصة. حفظ الأجسام المضادة لإعادة استخدامها إذا لزم الأمر.
5. شطف مع 1.0 مل من BBTw مرتين. بعد كل شطف تسمح عينة ليستقر قبل الرسم قبالة BBTw مع ماصة.
6. إضافة 1.0 مل من BBTw إلى القارورة والصخور. بعد 3 دقائق على الروك، تسمح عينة لتسوية وإزالة BBTw مع ماصة.
7. كرر الخطوة 5.6 خمس مرات.
8. عينة كتلة بإضافة 5٪ المصل العادي / BBTw حل للأنبوب microcentrifuge. إزالة كتلة بعد هزاز لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
   ملاحظة: لا يشترط هذه الخطوة حجب إضافية، لكن قد يحسن نوعية تلطيخ عن الأجسام المضادة المحددة.
9. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لتركيز العمل في 5٪ المصل العادي / BBTw الحل.
10. التفاف أنبوب microcentrifuge في رقائق الألومنيوم لتقليل يتلاشى بسبب التعرض للضوء. عينة الصخور في حل الضد الثانوية لمدة 12 إلى 48 ساعة في 4 درجات مئوية أو على الأقل لمدة 3 ساعة على RT (حوالي 22 درجة مئوية.
11. السماح عينة لتستقر في قاع microfuge أنبوب. رسم من الأجسام المضادة الثانوية مع ماصة.
12. شطف مع 1.0 مل من PBTw مرتين. بعد كل شطف تسمح عينة ليستقر قبل الرسم قبالة PBTw مع ماصة.
13. إضافة 1.0 مل من PBTw إلى القارورة والصخور. بعد 5 دقائق على الروك، والسماح للعينة لتسوية وإزالة PBTw مع ماصة.
14. كرر الخطوة 5.13 ثلاث مرات.
15. اختياري: إضافة دابي مخففة 1: 1،000 في PBTw. عينة الصخور ملفوفة في رقائق الألومنيوم لمدة 3 دقائق. ثم إزالة حل دابي مع ماصة. شطف خمس مرات مع 1.0 مل من PBTw، مما يسمح للعينة ليستقر قبل إزالة PBTw مع ماصة.
16. إضافة 80-100 ميكرولتر من 1،4-diazabicyclo [2.2.2] اوكتان (DABCO) حل لأنبوب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد تكون بديلا وكيل مكافحة تتلاشى آخر قائم على الجلسرين ل.

تحليل 6.

1. قبل تركيب العينة على الشرائح، إضافة اضافي 5-10 ميكرولتر من DABCO / ف كايسيylenediamine (PPD) antifade حل لأنبوب microcentrifuge.
   ملاحظة: يمكن إضافة عينة على الشرائح دون تشريح. حجم العينة تضاف إلى شريحة يختلف مع حجم غطاء زلة. عندما pipetting لالعينة على الشريحة، يمكن خفض غيض ماصة قبالة باستخدام شفرة حلاقة لمنع عينة القص. غالبا ما يكون من المفيد أن يبطن عينة تصل في الصفوف لتحليل سهلا. إضافة PPD وكيلا antifade إضافية قد لا تكون مطلوبة، ولكن يمكن منع photobleaching من إذا يتم تخزين العينات على المدى الطويل.
2. ضع بلطف الغطاء الزجاجي الانزلاق على العينة. ثم، آمن انزلاق الغطاء في مكانه تستخدم طلاء الأظافر.
3. عرض شنت العينة باستخدام المجهر مضان.

النتائج

للتدليل على فعالية المناعية القائم على صوتنة في تحليل المراحل المتأخرة الجنينية والأنسجة اليرقات في الموقع، تم تجهيز البرية من نوع الأجنة واليرقات لالمناعية من الخصية والمبيض، والأنسجة العصبية. تم تصوير عينات عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر وتظهر نتائج ممثل?...

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقة لذبابة الفاكهة بنجاح immunostain استهداف الجنينية والأنسجة اليرقات في الموقع، وبالتالي القضاء على الحاجة للتشريح. وفقا لبروتوكولات مسبقة لتلطيخ الأجنة المبكرة ^1،2،3، تتم إزالة الغشاء المشيمي باستخدام 50٪ التبييض (NaOCl). يتم إصلاحها...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)			For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)			For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10%			For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS			0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes			For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol		CAS 67-56-1	Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS: 281-57-9	To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution			1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates			To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10%			To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste			~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa			1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
mouse anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Goat anti-rabbit Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Goat anti-mouse Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Goat anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.		Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 μm cellulose nitrate membrane filter