הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

Summary

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Abstract

מחקרים שבוצעו בתסיסנית עוברים וזחלים מספקים תובנה חיונית לתהליכים התפתחותיים כגון מפרט גורל התא וorganogenesis. Immunostaining מאפשר ההדמיה של פיתוח רקמות ואיברים. עם זאת, לציפורן הגנה שיוצרת בסופו של עובר מונעת חלחול של נוגדנים לעוברי בשלב מאוחר וזחלים. בעוד לנתיחה לפני immunostaining משמשת באופן קבוע לנתח רקמות זחל דרוזופילה, זה מוכיח לא יעיל עבור חלק ניתוחים בגלל רקמות קטנות עשויות להיות קשות לאתר ולבודד. Sonication מספק חלופה לנתיחה בפרוטוקולי immunostaining דרוזופילה זחל. זה מאפשר עיבוד מהיר, בו זמני של מספר הגדול של עוברים בשלב מאוחר וזחלים ושומר במורפולוגיה באתר. לאחר הקיבוע בפורמלין, מדגם sonicated. לדוגמא נתונה אז immunostaining עם נמלה העיקרית אנטיגן ספציפיibodies ונוגדנים משני שכותרתו fluorescently לדמיין סוגי תאי היעד וחלבונים ספציפיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. במהלך התהליך של sonication, מיקום נכון של בדיקה sonicating מעל המדגם, כמו גם את המשך ועוצמת sonication, הוא קריטי. שינויים קלים additonal לפרוטוקולי immunostaining סטנדרטיים עשויים להידרש לכתמים באיכות גבוהות. לנוגדנים עם אות נמוכה יחס רעש, פעמים דגירה ארוכות יותר הן בדרך כלל צורך בכך. כהוכחה של קונספט לפרוטוקול הקל sonication זה, אנו מראים immunostains של שלושה סוגי רקמות (אשכים, השחלות, ורקמות עצביות) בטווח של שלבי התפתחות.

Introduction

עוברי דרוזופילה וזחלים מספקים מודל מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים באיברים ורקמות רבים. הדמיה של תאים בודדים היא לעתים קרובות יש צורך במחקרים אלה על מנת לוודא הסביבות המורכבות שבו תאים לפתח. ויזואליזציה של תאים ברקמות יכולה להיות מושג באמצעות immunostaining. ובכן תיאר immunostaining פרוטוקולים קיימים לרקמות עוברי דרוזופילה <17 שעות לאחר הטלת ביצים (AEL) ^1-3. עם זאת, צורות מגן ציפורן לקראת הסוף של עובר, מניעת חלחול נוגדן יעיל. לפיכך, פרוטוקולי immunostaining אלה אינם יעילים בניתוח של רקמות בעוברים בשלב מאוחר ובשלבים מאוחרים יותר של התפתחות זחל (instar 1 ^st (L1), instar 2 ^nd (L2), ו3 instar ^rd (L3)). חוסר יעילות זה מטיל מחסום להבנה של תהליכים דינמיים המתרחשים בתקופה התפתחותית מורחבת זה ^4. Tissנתיחת ue היא טכניקה מועסק נרחב לעקוף מכשול זה ^5-7. עם זאת, לנתיחה יכולה להוכיח לא יעילה. חילוץ ניתן לשעבוד על ידי קושי באיתור או בידוד עוברי ורקמות זחל. יתר על כן, ההסרה הפיסית של רקמות היעד עלולה לגרום נזק על ידי פקיעתם או בכך שלא לחלץ אותם בשלמותם.

Sonication הוא שיטה שמעסיקה גלי קול להפריע אינטראקציות מולקולאריים. זה כבר נעשה שימוש כדי לשבש את שלמות ציפורן זחל תסיסנית כדי immunostain פיתוח סוגי תאים עצביים ^6. פרוטוקול זה הותאם לimmunostain עוברי בשלב מאוחר ובלוטות מין זחל, אשר יכול להיות קטנה כמו 50μm בקוטר ^8-10. באמצעות מחקרים כאלה, התהליך של תאי גזע בתאי מין היווצרות נישה גברית (GSC) התאפיין בשלב מאוחר עוברי דרוזופילה ^8-10 ומנגנוני ויסות התפתחות תאי גזע וDIFferentiation בבלוטות מין עוברי בשלב מאוחר וזחלים כבר הובהר ^9-12. לפיכך, sonication מספק אלטרנטיבה יעילה לנתיחת רקמות שעלולות להיות קשה בגלל גודל של רקמה. יתר על כן, היא מאפשרת immunostaining של רקמות דרוזופילה באתר, עוזב תאים בהקשר של הגוף כולו ושמירה במורפולוגיה באתר. כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לimmunostaining הקרינה של עוברי בשלב מאוחר עד תחילת / רקמות אמצע-L3 באתר. ניתוח של רקמת אשכים ועצביים דרוזופילה מוצג בנציג התוצאות כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול זה. יתר על כן, פרוטוקול immunostaining זה עשוי להיות מותאם לנתח רקמות אחרות דרוזופילה, כמו גם רקמות באורגניזמים אחרים עם עור מת חיצוני.

Protocol

.1 הכנת קייג אוסף

1. הרדימי זבובים צעירים, פורה עם CO _2. העבר את הזבובים מורדמים לכלוב. כדי להשיג תשואה אופטימלית, להשתמש 100-120 זבובים בוגרים נעים בין 2-7 ימים של גיל ב4: 1 יחס של נקבות לזכרים. לאפשר זבובי תקופת הסתגלות מתאימה, ~ 24 שעות לפני קבלת מדגם לקיבעון. אם הכלוב הוקם עם נקבות בתולי הזדווגו לגברים, שימוש 36 - תקופת הסתגלות שעה 48.
2. בקצה הפתוח של הכלוב, להציב צלחת אגר מיץ תפוחים מוכן מראש עם ירידה בגודל מטבע של שמרים להדביק במרכז על הפתיחה של הכלוב. ואז, בטוח עם קלטת. לאטום את הצומת בין הצלחת אגר מיץ תפוחים והכלוב עם Parafilm.
3. מניחים את הכלוב במכל המשני עם צלחת אגר מיץ תפוחים כבסיס ולאפשר הזבובים להתרבות בטמפרטורה מוגדרת לתקופה מתאימה של זמן, כפי שנקבעו על ידי הניסוי.
   wi פעמים אוסף לדוגמא: הערהיהיה להשתנות. לדוגמא, בעת האיסוף עובר שלב מאוחר / מוקדם זחלי L1 (17 - 24 hr), לאפשר זבובים להטיל ביצים על צלחות אגר מיץ תפוחים במשך 7 שעות ב25 מעלות לפני ההזדקנות של מדגם ל17 שעה 25 מעלות צלזיוס. באופן דומה, לאוסף של זחלי אמצע סוף המאה הראשונים instar (36 - 48 hr) לאפשר זבובים להטיל ביצים במשך שעה 12 25 מעלות צלזיוס לפני ההזדקנות של מדגם ל36 שעה 25 מעלות צלזיוס.
4. לאחר תקופת הזמן היא מלאה, הקש על הכלוב על שולחן, כדי שזבובים לרדת מהצלחת אגר מיץ תפוחים ללא הרדמה. במהירות להחליף את הצלחת בשימוש עם אחד טרי המכיל טיפה של שמרים להדביק. אבטח את הצלחת הטרי עם קלטת וparafilm ולאחסן את הכלוב עם צלחת אגר מיץ תפוחים כבסיס.
5. מוציא בזהירות את טיפת שמרים מהצלחת המשומשת עם מרית מתכת. מכסה מניח על צלחת מיץ תפוחים משמש ומאפשר הניח עוברים לגיל אם בניסוי נחוץ.
   שים לב: בעוד הזדקנות דגימות, צלחות עשויות להיות מאוחסנות ב25 ° C אלא אם כן טמפרטורות גבוהות יותר הן experimentally הנדרש. דוגמאות של איך מזדקן עובר לגבייה שתוארה לעיל (ראה הערה לצעד 1.3). ההסרה של שמרים להדביק לפני לדגום הזדקנות מבוצעת כדי למנוע זחלים מזוחל לתוך השמרים והפירוק אגר מתחת. שאריות אגר מיץ תפוחים ושמרי ממרח שנותרו לספק חומרים מזינים לצמיחת זחל. בעוד עוברים הניחו ישירות בשמרים להדביק הולכים לאיבוד דרך הסרת שמרים להדביק, הפסד זה עדיף על שמרים ושאריות אגר במדגם שיכול להפחית את יעילות כתמים. צריך אחד לבחור שלא להסיר את השמרים להדביק, שמרים יכולים להיות מעובה עם פוספט הצפת טריטון X-100 (PBTx), מעורבב עם מברשת צבע, ולאחר מכן הוסרו מהמדגם עם מסננת תא לפני הקיבוע.

2 קיבוע

1. ברגע שהעוברים הניחו על הצלחת אגר מיץ התפוחים הזדקנו עד לנקודת הזמן הרצויה, להשתמש במכחול קטן רטוב עם פוספט הצפת טריטון X-100 פתרון (PBTx) כדי להסיר בזהירות מדגם מהצלחת דואר.
   הערה: זחלים מבוגרים ניידים ויכולים לזחול על החלק הפנימי של המכסה. מדגם זה עשוי להיות שנאסף באופן דומה על ידי ההסרה עם מכחול.
2. נגב את המדגם עמוס המכחול נגד הרכס הפונה הפנימי של מסננת תא. לאחר מכן, יש לשטוף את הקירות של המסננת ומכחול עם בקבוק להשפריץ מכיל פתרון PBTx. מניחים כיסוי צלחת פטרי מתחת למסננת כדי ללכוד את פתרון PBTx.
3. , אחרי הכל המדגם הועבר למסננת לשפוך מספיק PBTx לתוך המסננת כדי להעלות את המדגם מהרשת. לאחר מכן, הרם את המסננת ושופך את תכולת צלחת פטרי לתוך מיכל פסולת נוזלי.
4. 2.3 שלוש פעמים חזר על שלב כדי להסיר שמרים ולעוף פסולת שייתכן שהועברה יחד עם המדגם.
5. יוצקים מספיק אקונומיקה 50% (NaOCl) / מים (DDH ₂ O) פתרון למסננת כדי להעלות את זחלי הרשת. לאפשר זחלים לשבת בפתרון למשך 5 דקות. לאחר מכן, הרם את המסננת ולשפוך את tהוא התוכן של צלחת פטרי במכל פסולת נוזלית.
   הערה: Bleach נדרש רק בדגימות עוברית בגילים 0-22 שעה כדי להסיר את קרום כוריוני. היישום של אקונומיקה לדגימות מבוגרות יכול להיות מושמט, אך הכללתה היא לא מזיקה. אם המחדל הוא רצוי, להחליף את אקונומיקה בשלב זה עם PBTx. יש להשתמש באקונומיקה מדולל בתוך 24 שעות של הכנת פתרון.
6. לשטוף מדגם במסננת עם PBTx על ידי שפיכה מספיק PBTx לתוך המסננת כדי להעלות את המדגם מהרשת. לאפשר מדגם לשבת בפתרון במשך 3 דקות. לאחר מכן, הרם את המסננת ושופך את תכולת צלחת פטרי לתוך מיכל פסולת נוזלי.
7. חזור על שלב 2.6 חמש פעמים.
8. להספיג תחתית יבשה מסננת תא, ולאחר מכן להעביר מדגם לתוך בקבוקון המכיל נצנץ 1.75 מ"ל של תמיסת PEMS באמצעות מכחול.
9. עובד במנדף מאוורר, להוסיף 250 μl של פורמלדהיד 37% ו -8 מ"ל של heptane כיתה מגיב לבקבוקון הנצנץ.
   הערה: פורמלדהיד וheptane הם מסוכנים. למטרות בטיחות, תמשיך לעבוד במנדף מאוורר וללבוש כפפות מתאימות לצעדים 2.9-3.3.
10. לאפשר הבקבוקון ללחוץ ב200 סל"ד או מהירות בינונית דומה ל20 דקות.
11. הוסף 10 מ"ל של מתנול לבקבוקון נצנץ מבלי להסיר את השלב מימיים הקודם ולאפשר את הבקבוקון ללנער במרץ ב500 סל"ד דקות 1.
    הערה: מתנול הוא מסוכן. תמשיך לעבוד במנדף מאוורר וללבוש כפפות מתאימות.
12. הסר בקבוקון מייקר ומייד יוצק תוכן לתוך מסננת תא מעל מיכל פסולת נוזלי בשכונה. הוספת מתנול נוסף לבקבוקון ולרוץ דרך מסננת התא כנדרשת כדי להבטיח את כל המדגם הוסר.
    הערה: מסננות סלולארי עשויות לגרום באיטיות. כדי לתקן את זה, לגעת רקמות מעבדה לתחתית מסננת התא כדי לצייר את הפתרון דרך המסננת במהירות רבה יותר. מתנול, פורמלין, וheptane צריך להיותמאוחסן במיכלים פסולת מתאימים עד לסילוק נאות בהתאם להנחיות מוסדיות.
13. תחתית יבש של מסננת תא באמצעות רקמות במעבדה, ולאחר מכן להשתמש במכחול להעביר מדגם שנתפס במסננת לצינור 1.5 מ"ל מכיל microcentrifuge 0.5 מ"ל של מתנול.
    הערה: אם בקבוקוני נצנץ מרובים נמצאים בשימוש, בצעו את השלבים 2.12 ו2.13 אחד בקבוקון בכל פעם כדי למנוע מדגם מהתייבשות על מסננות תא.
14. לאחר המדגם נוסף לצינור microcentrifuge, להסיר מתנול עם טפטפת. מדגם להבטיח יש התיישב לחלק התחתון של הצינור.
15. יש לשטוף את המדגם בצינור microcentrifuge על ידי הוספה כ 0.5 מ"ל של מתנול לצינור. חכה למדגם להתיישב ולאחר מכן להסיר מתנול עם טפטפת.
16. חזור על שלב 15 שלוש פעמים.
17. הוסף 0.5 מ"ל של מתנול לצינור, ולאחר מכן לאחסן ב-20 ° C במקפיא לשימוש מאוחר יותר.

.3 Rehydration והכנת לדוגמא עבור Immunostaining

1. הסר מתנול מצינור microcentrifuge עם טפטפת, שעזב את המדגם בצינור. פסולת חנות מתנול למכל הפסולת המתאימה עד מועד הסילוק נאות.
   הערה: כדי לשפר את יעילות sonication, להשתמש לא יותר מ 3 מ"מ של מדגם התיישב בחלק התחתון של צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. מדגם עודף עשוי להיות מועבר לצינור נפרד עם טפטפת לפני תחילת הצעד להחזרת הנוזלים מעל. חיתוך קצה פיפטה בסכין גילוח נקי יכול לשמש כדי למנוע סתימה של קצה פיפטה.
2. הוספת 1.0 מ"ל של מתנול פתרון 50% / פוספט הצפת Tween (PBTw) לצינור והרוק במשך 3 דקות.
3. הסר פתרון מתנול למכל הפסולת המתאים ולשטוף עם 1.0 מיקרוליטר של PBTw פעמיים. לאחר כל שטיפה, לאפשר המדגם להתיישב לפני הציור את PBTw עם טפטפת.
4. הוספת 1.0 מ"ל של שור הסרום אלבומין / פוספט שנאגרו Tween (BBTw) לערבב לבקבוקון והרוק. לאחר 3 דקות על כיסא נדנדה, לאפשר sample להתיישב ולהסיר BBTw עם פיפטה.
5. חזור על שלב 3.4 שתי פעמים מקפידים להסיר כמה שיותר BBTw ככל האפשר מבלי לאבד דגימה לאחר השטיפה האחרונה.
6. הוסף 0.5 מ"ל של BBTw לצינור ומניח את הצינור על קרח.

.4 Sonication של דוגמא

1. הגדר את sonicator 10% משרעת המרבית ולייעד זמן ריצה של sonication הקבוע 2 שניות.
   הערה: הגדרות אלה הן ספציפיות לsonicator מצויינים בחומרים וציוד בלוח ועשויה לדרוש אופטימיזציה לsonicators שונה.
2. לפני sonication של מדגם, לנקות את חללית sonicator על ידי הצבת את הקצה החללית לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל מלא sonicator מים ולרוץ ללא יונים כדי לנקות את הבדיקה. בדיקה sonicator יבש עם רקמה במעבדה אחרי הריצה.
3. להטביע את הבדיקה לתוך הצינור המכיל microcentrifuge מדגם, כך שהוא נמצא בעמדת 3 עד 4 כ מ"מ מעל המדגם ולהתחיל sonication.
4. הסר את mצינור icrocentrifuge ולמקם אותו על קרח לפחות 30 שניות כדי לפזר חום מsonication ולאפשר מדגם להתיישב בחלק התחתון של צינור microcentrifuge.
5. חזור על שלבים 4.3 ו4.4 לפי צורך בהתבסס על גיל של מדגם בטיפול.
   הערה: לקבלת sonication אופטימלי נפח דגימה, עוברים צעירים מן 17 שעה אינו דורש sonication, אבל אלה בין 17 ו24 שעה (שלב 17 / מוקדם-L1) דורש שתי sonications. זחלים בין 24 - 36 (מוקדם / אמצע L1), 36 - 48 (מאוחר-L1 האמצע /), 48 - 60 (מוקדם / אמצע L2), 60-72 (אמצע / סוף-L2), 72-84 ( מוקדם-L3), 84-96 (מוקדם / אמצע L3), 96-108 שעה (אמצע / סוף-L3) דורשים 5, 9, 11, 13, 15, 18, ו22 sonications בהתאמה. ראה דיון לפרטים נוספים בפעמי sonication.
6. לשטוף עם 1.0 מ"ל BBTw פעמיים. לאחר כל שטיפה לאפשר המדגם להתיישב לפני הציור את BBTw עם טפטפת.
7. הוספת 1.0 מ"ל של BBTw לבקבוקון והרוק. לאחר 3 דקות על הנדנדה, לאפשר המדגם להתיישב ולהסיר BBTw עם פיפטה.
8. חזור על שלב 4.7 שתי פעמים.

.5 Immunostaining

1. לחסום מדגם ידי הוספת 5% בסרום נורמלי מדולל בBBTw ​​לצינור microcentrifuge. תסיר את החסימה לאחר הנדנדה עבור שעה 1.
   הערה: השתמש בסרום נורמלי מהמין שבו הנוגדנים משני נוצרים.
2. לדלל נוגדנים ראשוניים לנכס את העבודה ריכוז בפתרון 5% / BBTw סרום נורמלי.
3. מדגם רוק בO פתרון נוגדן הראשוני / N ב 4 מעלות צלזיוס או לפחות 3 שעות ב RT (כ 22 ° C.
   הערה: פעמים דגירה נוגדן וטמפרטורות עשויות להשתנות. O / N דגירה על 4 מעלות צלזיוס או 3 שעות ב RT הוא בדרך כלל מספיק. עם זאת, תקופת דגירה של יומיים עשויה לשפר את איכות צביעה, במיוחד עם דגימות מבוגרות או כאשר נוגדנים ראשוניים נמוך זיקה משמשים. incubations יותר מבוצע בדרך כלל על 4 מעלות צלזיוס. שיקולים דומים צריכים להיעשות בעת שימוש בנוגדנים משני (ראה 5.10).
4. לאפשר מדגם להתיישב לחלק תחתון של צינור microfuge. לצייר את נוגדנים ראשוניים עם פיפטה. להציל את הנוגדנים לשימוש חוזר אם תרצה בכך.
5. לשטוף עם 1.0 מ"ל של BBTw פעמיים. לאחר כל שטיפה לאפשר מדגם להתיישב לפני הציור את BBTw עם טפטפת.
6. הוספת 1.0 מ"ל של BBTw לבקבוקון והרוק. לאחר 3 דקות על הנדנדה, לאפשר מדגם להתיישב ולהסיר BBTw עם פיפטה.
7. חזור על שלב 5.6 חמש פעמים.
8. מדגם בלוק על ידי הוספת 5% בסרום נורמלי פתרון / BBTw לצינור microcentrifuge. תסיר את החסימה לאחר הנדנדה ל30 דקות לשעה 1.
   הערה: צעד חסימה נוסף זו אינה הכרחית, אבל עשויה לשפר את איכות צביעה לנוגדנים ספציפיים.
9. לדלל נוגדנים משני לנכס את העבודה ריכוז בפתרון 5% / BBTw סרום נורמלי.
10. לעטוף צינור microcentrifuge בנייר אלומיניום כדי להפחית את הדהיה כתוצאה מחשיפה לאור. מדגם רוק בפתרון נוגדנים משני במשך 12 עד 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס או לפחות 3 שעות ב RT (כ 22 C °.
11. לאפשר מדגם להתיישב לתחתית צינור microfuge. לצייר את נוגדנים משני עם פיפטה.
12. לשטוף עם 1.0 מ"ל של PBTw פעמיים. לאחר כל שטיפה לאפשר מדגם להתיישב לפני הציור את PBTw עם טפטפת.
13. הוספת 1.0 מ"ל של PBTw לבקבוקון והרוק. אחרי 5 דקות על הנדנדה, לאפשר המדגם להתיישב ולהסיר PBTw עם פיפטה.
14. חזור על שלב 5.13 שלוש פעמים.
15. אופציונאלי: הוסף DAPI מדולל 1: 1,000 בPBTw. מדגם רוק עטוף בנייר אלומיניום למשך 3 דקות; לאחר מכן להסיר את פתרון DAPI עם טפטפת. יש לשטוף חמש פעמים עם 1.0 מ"ל של PBTw, המאפשר דגימה להתיישב לפני הסרת PBTw עם פיפטה.
16. הוספת 80 - 100 μl של 1,4-diazabicyclo [2.2.2] אוקטן פתרון (DABCO) לצינור microcentrifuge ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: סוכן אנטי לדעוך מבוסס גליצרול נוסף עשוי להיות תחליף ל.

.6 ניתוח

1. לפני ההרכבה מדגם על גבי שקופיות, להוסיף תוספת 5 - 10 μl של DABCO / p-phenylenediamine (PPD) antifade פתרון לצינור microcentrifuge.
   הערה: לדוגמא ניתן להוסיף לשקופיות ללא נתיחה. לדוגמא הוסיף לשקופית נפח משתנה עם גודל להחליק לכסות. כאשר pipetting מדגם על שקופית, קצה פיפטה עלול להתנתק באמצעות סכין גילוח כדי למנוע גז מדגם. זה בדרך כלל שימושי בשורה המדגם בשורות לניתוח קל. התוספת של PPD כסוכן antifade נוסף לא ייתכן שתידרש, אבל יכולה למנוע photobleaching אם דגימות נשמרות לטווח ארוך.
2. מניח בעדינות כיסוי הזכוכית להחליק על מדגם. ואז, להחליק את המכסה מאובטח במקום באמצעות לק.
3. צפה ברכוב מדגם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

כדי להדגים את היעילות של immunostaining מבוסס sonication בניתוח עוברי בשלב מאוחר וברקמות זחל באתר, עוברי wild-type וזחלים עובדו לimmunostaining של אשכים, השחלות, ורקמה עצבית. דגימות הם צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal ותוצאות נציג מוצגות (איור 1 ואיור 2). תוצאות עולות כי הפרוטוקו...

Discussion

פרוטוקול זה מספק שיטה להצלחת immunostain למקד דרוזופילה עוברית ורקמות זחל באתר, ובכך מבטל את הצורך בנתיחה. לפי פרוטוקולים לפני מכתים עוברים המוקדמים ^1,2,3, קרום כוריוני מוסר באמצעות אקונומיקה 50% (NaOCl). דגימות קבועות בפורמלין ומתנול. בגלל ציפורן הזחל גורמת מדגם...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)			For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)			For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10%			For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS			0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes			For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol		CAS 67-56-1	Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS: 281-57-9	To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution			1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates			To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10%			To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste			~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa			1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
mouse anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Goat anti-rabbit Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Goat anti-mouse Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Goat anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.		Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 μm cellulose nitrate membrane filter