Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Résumé

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Résumé

Les études réalisées chez Drosophila melanogaster embryons et des larves donnent un aperçu essentiel dans les processus de développement tels que la spécification du destin cellulaire et l'organogenèse. Immunomarquage permet la visualisation de tissus et organes en développement. Cependant, une cuticule protectrice qui se forme à la fin de l'embryogenèse empêche la pénétration des anticorps dans des embryons à un stade avancé et des larves. Bien que la dissection avant immunomarquage est régulièrement utilisé pour analyser les tissus des larves de drosophile, il s'avère inefficace pour certaines analyses parce que les petits tissus peuvent être difficiles à localiser et isoler. Le traitement par ultrasons offre une alternative à la dissection dans les protocoles de larves de drosophile immunomarquage. Il permet d'obtenir rapidement un traitement simultané d'un grand nombre d'embryons à un stade avancé et des larves et maintient la morphologie situ. Après fixation dans le formol, un échantillon est soumis à une sonication. L'échantillon est ensuite soumis à une coloration immunologique spécifique de l'antigène avec ant primaireet ibodies Anticorps secondaires marqués par fluorescence pour visualiser types de cellules cibles spécifiques et des protéines par microscopie de fluorescence. Au cours du processus de sonication, une mise en place correcte de la sonde de sonication ci-dessus de l'échantillon, ainsi que la durée et l'intensité de la sonification, est critique. Modifications mineures supplementaires aux protocoles d'immunomarquage standard peuvent être nécessaires pour les taches de haute qualité. Pour les anticorps ayant un faible rapport signal à bruit, de plus longs temps d'incubation sont typiquement nécessaires. Comme une preuve de concept pour ce protocole de traitement par ultrasons facilitée, nous montrons immunomarquages ​​de trois types de tissus (testicules, ovaires, et des tissus neuronaux) à une série de stades de développement.

Introduction

Embryons de drosophile et les larves fournissent un excellent modèle pour étudier les processus de développement dans de nombreux organes et tissus. L'imagerie de cellules individuelles est souvent nécessaire dans ces études afin de déterminer les milieux complexes dans lesquelles les cellules se développent. La visualisation des cellules dans les tissus peut être réalisée par coloration immunologique. Bien décrits immunomarquage protocoles existent pour les tissus embryonnaires de drosophile <17 h après la ponte (AEL) ^1-3. Cependant, une protection formes de la cuticule vers la fin de l'embryogenèse, empêchant la pénétration d'anticorps efficace. Ainsi, ces protocoles immunocoloration sont inefficaces dans l'analyse des tissus d'embryons à un stade avancé et dans les étapes ultérieures du développement larvaire ^(1er stade (L1), 2 ^ème stade (L2), et 3 ^e stade (L3)). Cette inefficacité impose un obstacle à notre compréhension des processus dynamiques qui se produisent pendant cette période de développement prolongée ^4. Tissue dissection est une technique largement utilisée pour contourner cette barrière ^5-7. Cependant, la dissection peut se révéler inefficace. L'extraction peut être encombré par la difficulté à trouver ou à isoler l'embryon et les tissus des larves. En outre, l'élimination physique des tissus cibles peut causer des dommages par les rompre ou en omettant de les extraire dans leur intégralité.

La sonication est une méthode qui utilise des ondes sonores pour perturber les interactions intermoléculaires. Elle a été utilisée pour perturber l'intégrité de la cuticule des larves de Drosophila immunocoloration pour développer des types cellulaires neuronaux ^6. Ce protocole a été adapté pour immunocoloration embryonnaire à un stade avancé et les gonades des larves, qui peuvent être aussi petites que 50 microns de diamètre ^8-10. Grâce à ces études, le processus de cellules souches de la lignée germinale (CGC) formation masculine de niche a été caractérisé à un stade avancé embryons de drosophile ^8-10 et les mécanismes régulant le développement des cellules souches et difdifféren- à un stade avancé gonades embryonnaires et les larves ont été élucidée ^9-12. Ainsi, la sonication fournit une alternative efficace à la dissection de tissu qui peut être difficile en raison de la taille des tissus. En outre, il permet l'immunomarquage des tissus de Drosophila in situ, ce qui laisse les cellules dans le cadre de l'ensemble de l'organisme et le maintien de la morphologie in situ. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour la fluorescence immunomarquage de l'embryon à un stade avancé grâce à début / mi-L3 tissus in situ. Analyse de la drosophile gonadique et le tissu nerveux est représenté dans les résultats représentatifs pour démontrer l'efficacité de ce protocole. De plus, ce protocole d'immunocoloration peut être adapté pour analyser d'autres tissus de Drosophila ainsi que des tissus chez d'autres organismes par une cuticule externe.

Protocole

1: Préparation d'une cage de collecte

1. Anesthésier les jeunes, les mouches fertiles avec du CO _2. Transfert mouches anesthésiés dans une cage. Pour obtenir un rendement optimal, utilisez 100-120 mouches adultes allant de 2-7 jours d'âge à un ratio de 4: 1 femmes-hommes. Laisser vol une période d'acclimatation appropriée, ~ 24 heures avant d'obtenir l'échantillon pour la fixation. Si la cage a été mis en place avec des femelles vierges accouplées à des mâles, une utilisation de 36 - période d'acclimatation de 48 h.
2. Sur l'extrémité ouverte de la cage, placer une plaque de gélose de jus de pommes préalablement préparée avec une goutte de taille dime de la pâte de levure dans le centre au-dessus de l'ouverture de la cage. Ensuite, fixez avec du ruban adhésif. Sceller la jonction entre la plaque de gélose de jus de pomme et la cage avec du parafilm.
3. Placer la cage dans un récipient secondaire avec le jus de pomme plaque de gélose en tant que base et permettent de reproduire les mouches à une température définie pendant une période appropriée de temps tel que déterminé par l'expérience.
   Remarque: Les temps de prélèvement d'échantillons will varier. Par exemple, lors de la collecte des embryons à un stade avancé / larves L1 précoce (17 - 24 h), permettre à mouches pondent leurs œufs sur des plaques de gélose de jus de pomme pendant 7 heures à 25 ° C avant le vieillissement de l'échantillon pendant 17 heures à 25 ° C. De même, pour une collection de mi-fin du premier stade larvaire (36-48 h) permettent mouches pondent des œufs pendant 12 heures à 25 ° C avant le vieillissement de l'échantillon pendant 36 heures à 25 ° C.
4. Une fois la période terminée, appuyez sur la cage sur une table afin que les mouches tombent loin de la plaque de gélose de jus de pomme sans anesthésie. Remplacer rapidement la plaque utilisée par une nouvelle contenant une goutte de pâte de levure. Fixez la nouvelle plaque avec du ruban adhésif et du parafilm et stocker la cage avec du jus de pomme plaque de gélose comme base.
5. Retirez délicatement la chute de la levure de la plaque utilisée avec une spatule métallique. Placer le couvercle sur la plaque utilisée pomme de jus et permettent mis embryons à l'âge si nécessaire expérimentalement.
   Remarque: Si le vieillissement des échantillons, des plaques peuvent être conservés à 25 ° C, sauf si des températures plus élevées sont experimentally requis. Des exemples de la façon d'embryons pour la collecte sont décrites ci-dessus l'âge (voir la note pour l'étape 1.3). Retrait de la pâte de levure avant vieillissement échantillon est effectuée à empêcher les larves de ramper dans la levure et de briser l'agar-dessous. L'agar de jus de pomme et pâte de levure résidu restant à fournir des nutriments pour la croissance des larves. Lorsque des embryons fixés directement à la pâte de levure sont perdus à travers le retrait de la pâte de levure, cette perte est préférable de levure et de la gélose résidu de l'échantillon qui peut réduire l'efficacité de coloration. Faut-il choisir de ne pas retirer la pâte de levure, levure peut être liquéfié avec un tampon phosphate de Triton X-100 (PbTx), mélangé avec un pinceau, puis retiré de l'échantillon avec un tamis cellulaire avant la fixation.

2 Fixation

1. Une fois les embryons fixés sur la plaque de gélose jus de pomme ont vieilli au point de temps souhaité, utiliser un petit pinceau humidifié avec un tampon phosphate de Triton X-100 (PbTx) solution pour éliminer soigneusement échantillon de eplaque de e.
   Remarque: Les larves plus âgées sont mobiles et peuvent ramper sur l'intérieur du couvercle. Cet échantillon peut être prélevé de façon similaire par élimination avec un pinceau.
2. Essuyer le pinceau de l'échantillon chargé contre l'arête intérieure face d'un tamis cellulaire. Ensuite, rincer les parois de la crépine et le pinceau avec un vaporisateur contenant une solution PbTx. Placez un couvercle de boîte de Pétri sous le filtre pour capturer la solution PbTx.
3. Après tout l'échantillon a été transféré à la passoire, verser suffisamment PbTx dans la crépine d'augmenter l'échantillon de la maille. Ensuite, soulevez le filtre et verser le contenu de la boîte de Pétri dans un conteneur de déchets liquides.
4. Répétez l'étape 2.3 de trois fois pour éliminer les levures et volent déchets qui peuvent avoir été transférés avec l'échantillon.
5. Verser suffisamment d'eau de Javel à 50% (NaOCl) / eau (le trou DDH ₂ O) solution dans le filtre à élever les larves au large de la maille. Laisser les larves de s'asseoir dans une solution pendant 5 min. Ensuite, soulevez le filtre et versez til contenu de la boîte de Pétri dans un récipient à déchets.
   Remarque: Bleach est nécessaire uniquement dans les échantillons embryonnaires âgés de 0 à 22 heures afin de retirer la membrane chorionique. L'application d'eau de javel à des échantillons plus âgés peut être omis, mais son inclusion n'est pas préjudiciable. Si omission est souhaitée, remplacer l'eau de Javel dans cette étape avec PbTx. L'eau de Javel diluée doit être utilisée dans les 24 heures de préparation de la solution.
6. Laver l'échantillon dans la passoire avec PbTx en versant assez PbTx dans la passoire pour recueillir l'échantillon large de la maille. Laisser l'échantillon reposer dans la solution pendant 3 min. Ensuite, soulevez le filtre et verser le contenu de la boîte de Pétri dans un conteneur de déchets liquides.
7. Répétez l'étape 2.6 cinq fois.
8. Tamponner le fond de la crépine de la cellule sèche, puis transférer l'échantillon dans un flacon à scintillation contenant 1,75 ml de solution à l'aide d'un pinceau PEMS.
9. Travailler dans une hotte ventilée, ajouter 250 ul de formaldehyde à 37% et 8 ml d'heptane de qualité réactif dans le flacon de scintillation.
   Remarque: le formaldéhyde et l'heptane sont dangereux. Pour des raisons de sécurité, continuera à travailler dans une hotte ventilée et porter des gants appropriés pour les étapes 2.9 à 3.3.
10. Amener le flacon à agiter à 200 tours par minute ou une vitesse modérée similaire pour 20 min.
11. Ajouter 10 ml de methanol à scintillation fiole sans enlever la phase aqueuse précédente et permettre à la fiole à secouer vigoureusement à 500 rpm pendant 1 min.
    Remarque: Le méthanol est dangereux. Continuer à travailler dans une hotte ventilée et porter des gants appropriés.
12. Retirer le flacon de secoueur et immédiatement verser le contenu dans un tamis cellulaire sur un récipient à déchets dans la hotte. Ajouter méthanol supplémentaire pour le flacon et courir à travers la crépine si nécessaire cellulaire pour s'assurer que tout échantillon a été supprimé.
    Remarque: filtres cellulaires peuvent s'écouler lentement. Pour y remédier, un toucher de tissu de laboratoire à la partie inférieure de la crépine de la cellule afin d'aspirer la solution à travers le filtre plus rapidement. Le méthanol, le formaldéhyde, l'heptane et doit êtreentreposés dans des contenants de déchets appropriés jusqu'à ce que l'élimination appropriée conformément aux directives institutionnelles.
13. Fond sec de filtre cellulaire en utilisant un tissu de laboratoire, puis utilisez un pinceau pour transférer l'échantillon capturé dans la passoire à un tube de 1,5 ml contenant 0,5 ml de méthanol.
    Remarque: Si plusieurs flacons de scintillation sont en cours d'utilisation, suivez les étapes 2.12 et 2.13 un flacon à la fois pour éviter échantillon de séchage sur tamis cellulaires.
14. Une fois que l'échantillon a été ajouté au tube à centrifuger, éliminer le methanol avec une pipette. Assurer échantillon a déposé au fond du tube.
15. Rincer l'échantillon dans le tube à centrifuger en ajoutant environ 0,5 ml de methanol à tube. Attendez échantillon à régler puis retirez du méthanol avec une pipette.
16. Répétez l'étape 15 trois fois.
17. Ajouter 0,5 ml de methanol pour le tube, et ensuite stocker dans un congélateur à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.

3. réhydratation et Préparation de l'échantillon pour Immunocoloration

1. Retirer le methanol du microtube avec une pipette, en laissant l'échantillon dans le tube. Magasin méthanol déchets dans le conteneur de déchets approprié jusqu'à ce que le temps de mise au rebut.
   Remarque: Pour améliorer l'efficacité du traitement par ultrasons, n'utilisent pas plus de 3 mm de l'échantillon sont installés au fond du tube de 1,5 ml. L'excès de l'échantillon peut être transféré dans un tube séparé avec une pipette avant de commencer l'étape de réhydratation ci-dessus. Coupe de la pointe de pipette avec une lame de rasoir stérile peut être utilisé pour éviter le colmatage de la pointe de pipette.
2. Ajouter 1,0 ml d'un mélange méthanol / tampon phosphate Tween (PBTw) solution à 50% dans le tube et le rock pendant 3 min.
3. Enlever la solution de méthanol dans le conteneur des déchets et rincer avec 1,0 pi de PBTw deux fois. Après chaque rinçage, laisser l'échantillon se déposer avant le soutirage PBTw avec une pipette.
4. Ajouter 1,0 ml de sérum-albumine bovine / tampon phosphate Tween (BBTw) mélanger le flacon et le rock. Après 3 min sur une bascule, permettre à la sample pour régler et retirer le BBTw avec pipette.
5. Répétez l'étape 3.4 deux fois en prenant soin d'enlever autant que possible BBTw sans perdre échantillon après le dernier lavage.
6. Ajouter 0,5 ml de BBTw au tube et placer le tube sur de la glace.

4 La sonication de l'échantillon

1. Réglez le dispositif de traitement ultrasonique à 10% d'amplitude maximale et désigner un temps de fonctionnement de 2 sec sonication constante.
   Remarque: Ces paramètres sont spécifiques à l'appareil à ultrasons indiqué dans les matériaux et les ustensiles de table et peuvent nécessiter l'optimisation pour différentes sonicateurs.
2. Avant de sonication de l'échantillon, nettoyer la sonde de sonication en plaçant la pointe de la sonde dans un tube conique de 50 ml remplie de déminéralisée sonique eau et course à nettoyer la sonde. Sonde de sonication à sec avec un tissu de laboratoire après course.
3. Plonger la sonde dans le tube à centrifuger contenant l'échantillon afin qu'il soit positionné environ 3 à 4 mm au-dessus de l'échantillon et commencer à ultrasons.
4. Retirez le mTube icrocentrifuge et le placer sur de la glace pendant au moins 30 secondes pour dissiper la chaleur à partir de sonication et permettre à l'échantillon se déposent au fond du tube à centrifuger.
5. Répétez les étapes 4.3 et 4.4 selon les besoins en fonction de l'âge de l'échantillon en cours de traitement.
   Remarque: Pour un volume d'échantillon de sonication optimale, les embryons de moins de 17 heures ne nécessitent pas de traitement par ultrasons, mais celles entre 17 et 24 heures (stade 17 / début-L1) nécessitent deux sonications. Les larves entre 24 à 36 (début / mi-L1), 36-48 (mi / fin-L1), 48 - 60 (début / mi-L2) 60 - 72 (mi / fin-L2), 72-84 ( début-L3), 84-96 (début / mi-L3), 96-108 (mi / fin-L3) h nécessitent 5, 9, 11, 13, 15, 18, et 22 sonications respectivement. Voir discussion pour de plus amples précisions sur les temps de sonication.
6. Rincer BBTw deux fois avec 1,0 ml. Après chaque rinçage laisser l'échantillon à régler avant de tirer hors BBTw avec une pipette.
7. Ajouter 1,0 ml de BBTw dans le flacon et le rock. Après 3 min sur la bascule, laisser l'échantillon se régler et retirer le BBTw avec pipette.
8. Répétez l'étape 4.7 deux fois.

5. Immunocoloration

1. Bloquer échantillon par addition de 5% de sérum dilué dans BBTw normale au tube à centrifuger. Retirer le bloc après bascule pendant 1 heure.
   Remarque: Utilisez un sérum normal de l'espèce dans laquelle les anticorps secondaires sont générés.
2. Diluer anticorps primaires de s'approprier la concentration de travail dans 5% solution normale de sérum / BBTw.
3. Roche échantillon en solution d'anticorps primaire O / N à 4 ° C ou pendant au moins 3 heures à température ambiante (22 ° C environ.
   Remarque: Les durées et les températures d'incubation d'anticorps peuvent varier. O / N incubation à 4 ° C et 3 heures à température ambiante est généralement suffisante. Cependant, une période d'incubation de deux jours, peut améliorer la qualité de la teinture, en particulier avec des échantillons plus âgés ou lorsque des anticorps primaires de faible affinité sont utilisés. Incubations plus longues sont généralement effectuées à 4 ° C. Des considérations similaires doivent être prises lors de l'utilisation des anticorps secondaires (voir 5.10).
4. Laisser l'échantillon de s'installer àfond du tube de centrifugeuse. Prélever des anticorps primaires avec pipette. Enregistrer anticorps pour la réutilisation, si désiré.
5. Rincer deux fois avec 1,0 ml de BBTw. Après chaque rinçage permet échantillon de régler avant de tirer hors BBTw avec une pipette.
6. Ajouter 1,0 ml de BBTw dans le flacon et le rock. Après 3 min sur la bascule, permet échantillon de régler et retirer BBTw avec pipette.
7. Répétez l'étape 5.6 cinq fois.
8. Bloc échantillon par addition d'une solution à 5% / BBTw de sérum normal de la microtube. Retirer le bloc après bascule pour 30 min à 1 h.
   Remarque: Cette étape de blocage supplémentaire n'est pas nécessaire, mais peut améliorer la qualité de la coloration d'anticorps spécifiques.
9. Diluer anticorps secondaires de s'approprier la concentration de travail dans 5% solution normale de sérum / BBTw.
10. Enveloppez microtube dans une feuille d'aluminium pour réduire la décoloration due à l'exposition de la lumière. Roche échantillon dans une solution d'anticorps secondaire pendant 12 à 48 heures à 4 ° C ou pendant au moins 3 heures à température ambiante (environ 22 ° C.
11. Laisser l'échantillon à déposer au fond du tube de centrifugeuse. Prélever Anticorps secondaires à la pipette.
12. Rincer deux fois avec 1,0 ml de PBTw. Après chaque rinçage permet échantillon de régler avant de tirer au large de la PBTw avec une pipette.
13. Ajouter 1,0 ml de PBTw dans le flacon et le rock. Après 5 min sur la bascule, laisser l'échantillon se régler et retirer le PBTw avec pipette.
14. Répétez l'étape 5.13 trois fois.
15. OPTION: Ajouter DAPI dilué 1: 1000 dans PBTw. échantillon de roche enveloppé dans une feuille d'aluminium pendant 3 min; puis retirez solution DAPI avec une pipette. Rincer cinq fois avec 1,0 ml de PBTw, permettant échantillon de régler avant de retirer PBTw avec pipette.
16. Ajouter 80 - 100 ul de 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO) solution pour microtube et conserver à -20 ° C.
    Note: Un autre agent anti-décoloration à base de glycérol peut être remplacé par.

Analyse 6.

1. Avant de montage d'échantillons sur des lames, ajouter un supplémentaire 5 - 10 pi de DABCO / p-phenylenediamine (PPD) antifade solution pour microtube.
   Remarque: l'échantillon peut être ajouté à des diapositives sans dissection. ajouter le volume à une lame de l'échantillon varie avec la taille de housse. Lorsque pipetage échantillon sur la glissière, la pointe de la pipette peut être coupé avec une lame de rasoir pour éviter échantillon cisaillement. Il est souvent utile d'aligner l'échantillon en rangées pour faciliter l'analyse. L'ajout de PPD en tant qu'agent de antifade supplémentaire ne peut être tenu, mais peut empêcher photoblanchiment si les échantillons sont stockés à long terme.
2. Placez délicatement couvercle en verre glissement sur échantillon. Ensuite, lamelle fixer en place à l'aide de vernis à ongles.
3. Voir monté échantillon en utilisant la microscopie de fluorescence.

Résultats

Pour démontrer l'efficacité de l'immunomarquage base ultrasons dans l'analyse de l'embryon à un stade avancé et les tissus des larves in situ, les embryons de type sauvage et des larves ont été traitées pour immunomarquage des testicules, des ovaires, et le tissu neural. Les échantillons ont été imagées par microscopie à foyer commun et les résultats représentatifs sont présentés (figure 1 et figure 2). Les résultats montrent que le protocole d?...

Discussion

Ce protocole fournit un procédé pour cibler avec succès immunocoloration embryonnaire de Drosophila et tissus larvaires in situ, ce qui élimine la nécessité d'une dissection. Selon les protocoles antérieurs pour la coloration des embryons précoces ^1,2,3, la membrane chorionique est éliminé en utilisant 50% de javel (NaOCl). Les échantillons sont fixés dans du formol et du méthanol. Parce que la cuticule des larves provoque échantillon âgé de flotter, la totalité de l'...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)			For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)			For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10%			For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS			0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes			For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol		CAS 67-56-1	Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS: 281-57-9	To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution			1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates			To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10%			To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste			~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa			1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
mouse anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Goat anti-rabbit Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Goat anti-mouse Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Goat anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.		Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 μm cellulose nitrate membrane filter