後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

要約

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

要約

キイロショウジョウバエの胚および幼虫において行われた研究は、このような細胞の運命仕様と器官形成などの発生過程に重要な洞察を提供する。免疫染色は、組織および器官の開発の可視化を可能にする。しかし、胚発生の最後に形成した保護キューティクルは後期胚および幼生への抗体の浸透を防ぐことができます。免疫染色の前に切開を定期的にショウジョウバエ幼虫の組織を分析するために使用される小さな組織を見つけて単離することは困難であるので、それはいくつかの分析のために非効率的な証明する。超音波処理は、幼虫ショウジョウバエの免疫染色プロトコルにおける解剖の代替手段を提供します。これは、後期胚および幼虫の大量の迅速、同時処理を可能にし、 その場で 、形態に維持します。ホルムアルデヒドで固定した後、試料を超音波処理する。次いで、試料を、抗原特異的な一次蟻で免疫染色が施されるibodiesおよび蛍光標識した二次抗体は、蛍光顕微鏡を介して標的細胞型および特定のタンパク質を可視化した。超音波処理の過程で、上記サンプル音波処理プローブ、ならびに超音波処理の持続時間および強度の適切な配置は重要である。標準免疫染色プロトコルへのadditonal小さな変更は、高品質の汚れのために必要とされ得る。対雑音比が低い信号を有する抗体については、より長いインキュベーション時間は、典型的には必要である。この超音波処理促進性プロトコルのためのコンセプトの証明として、発達段階の範囲で3の組織型（精巣、卵巣、および神経組織）の免疫染色を示している。

概要

ショウジョウバエの胚および幼虫は多くの器官および組織中の発達過程を研究するための優れたモデルを提供する。個別の細胞のイメージングは​​、細胞が発達する複雑な環境を確認するために、これらの研究においてしばしば必要である。組織中の細胞の可視化は、免疫染色により達成することができる。プロトコルは17時間産卵^（AEL）1-3の後、胚ショウジョウバエ組織 <のために存在する免疫染色よく記載。有効な抗体の浸透を防止胚発生の終了に向かったが、保護キューティクルフォーム、。したがって、これらの免疫染色のプロトコルは、後期胚における組織の分析においてと幼虫の発育（ ^第 1齢（L1）、2 ^番目の齢（L2）、及び^第3齢（L3））のその後の段階で非効率的である。この非効率性は、この拡張された発育期間⁴中に発生した動的プロセスの理解に対する障壁を課している。 TISSUE郭清はこの障壁^5-7を回避するために広く使用される技術である。しかし、解剖は非効率的な証明することができます。抽出は、胚および幼虫の組織を配置するか、単離することの難しさによって妨げてもよい。また、標的組織の物理的除去は、それらを破壊するか、またはその全体でそれらを抽出するために失敗することによって損傷を与える可能性がある。

超音波処理は、分子間相互作用を妨害するために音波を用いる方法である。これは、神経細胞型^6を開発する免疫染色するために、 ショウジョウバエの幼虫クチクラの完全性を破壊するために使用されている。このプロトコルは、直径^8〜10には50μmと小さくすることができ、後期胚および幼虫の生殖腺を、免疫染色するようになってきた。このような研究により、男性生殖細胞系列幹細胞（GSC）ニッチ形成のプロセスは、後期に特徴づけられた幹細胞の発生とのdifを調節するショウジョウバエ胚 ^8-10とメカニズム後期胚性生殖腺と幼虫ferentiationは^9-12解明されている。このように、超音波処理が原因組織サイズが難しいかもしれ組織切開への効率的な代替手段を提供します。さらに、生物全体のコンテキスト内のセルを残してその場の形態で維持し、 その場でショウジョウバエ組織の免疫染色を可能にします。ここでは、 その場での初期/中期のL3組織を後期胚の蛍光免疫染色のためのステップバイステップのプロトコルを記述します。 ショウジョウバエの生殖腺組織および神経組織の分析は、このプロトコルの有効性を実証する代表的な結果に示されている。さらに、この免疫染色プロトコルは、外側のキューティクルと他の生物において他のショウジョウバエ組織ならびに組織を分析するように適合され得る。

プロトコル

コレクションケージの調製

1. CO ₂で、若い、肥沃なハエを麻酔。ケージに麻酔をかけたハエを転送します。最適な収率を得る4で生後2-7日に至るまで、100〜120大人のハエを使用するには、次の男性に、女性の1の割合。許可前固定のための試料を得るに〜24時間、適切な順応期間を飛ぶ。 48時間順応期間 - ケージは処女雌で設定されている場合は、使用36、オスと交配。
2. ケージの開放端には、ケージの開口部に中央に酵母ペーストのダイムサイズのドロップで事前に準備されたリンゴジュース寒天プレートを配置。その後、テープで固定します。リンゴジュース寒天プレートとパラフィルムとケージとの間の接合部をシール。
3. ベースとしてリンゴジュース寒天プレートと第2の容器にケージを置き、ハエが、実験によって決定される適切な期間のために定義温度で再現することができます。
   注：サンプル収集時間のWI変化しちゃう。後期胚/早期のL1幼虫収集する際に、例えば、（17から24時間）、ハエは25℃で17時間前に、サンプルの老化に25℃で7時間、リンゴジュース寒天プレート上に卵を産むことができます。同様に、半ば後半最初の幼虫の収集のため（36から48時間）ハエが25℃で36時間前に、サンプルの老化に25℃で12時間、卵を産むことができます。
4. 期間が完了するとハエは麻酔なし離れリンゴジュース寒天プレートからドロップするように、テーブルの上にケージをタップします。すばやく酵母ペーストの低下を含む新鮮なものに用いられるプレートを交換してください。テープとパラフィルムで新しいプレートを固定し、ベースとしてリンゴジュース寒天プレートとケージを保管してください。
5. 慎重に金属スパチュラで使用されるプレートから酵母のドロップを削除します。使用リンゴジュースプレートに置き、蓋と実験的に必要であれば、年齢にレイド胚を可能にする。
   注：サンプルをエージングしながら、より高い温度は、エクスペリない限り、このプレートを25℃で保存することができるLLY必要です。上記に記載されているコレクションのための胚を熟成する方法の例として（ステップ1.3のための注を参照）。老化をサンプリングする前に酵母ペーストの除去は、酵母にクロールおよびその下の寒天を分割から幼虫を防止するために行われる。残りのリンゴジュース寒天及び酵母ペースト残基は幼虫の成長のための栄養素を提供する。酵母ペーストに直接敷設胚酵母ペーストの除去によって失われているが、この損失は、染色効率を低下させることができ、サンプル中の酵母および寒天残留することが好ましい。一つは、酵母ペーストを除去しないことを選択すべきは、酵母はペイントブラシと混合し、リン酸緩衝液のTriton X-100（PBTx）で液化し、その後、固定前に、細胞ストレーナーを試料から除去することができる。

2。固定

1. リンゴジュース寒天プレート上に置か胚は所望の時点に老化したら、慎重に目からサンプルを除去するためにリン酸緩衝液のTriton X-100（PBTx）水溶液で湿らせ、小さな絵筆を使う電子版。
   注：古い幼虫がモバイルであり、蓋の内側にクロールすることができる。このサンプルは、絵筆で除去することによって、同様に収集することができる。
2. セルストレーナーの内側に面した尾根に対してサンプルを含んだ絵筆を拭きます。その後、PBTx溶液を含む噴霧ボトルとストレーナーの壁や絵筆をすすぐ。 PBTxソリューションをキャプチャするために、ストレーナの下にペトリ皿のカバーを置きます。
3. すべてのサンプルは、ストレーナに転送された後に、メッシュからサンプルを調達するストレーナに十分なPBTxを注ぐ。そして、ストレーナを持ち上げ、廃液容器にペトリ皿の内容物を注ぐ。
4. 酵母を除去し、サンプルと一緒に転送されている可能性があり、廃棄物を飛ぶために繰り返して、ステップ2.3三回。
5. メッシュから幼虫を高めるために、ストレーナに十分な、50％の漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）/水（のddH ₂ O）水溶液を注ぐ。幼虫は5分間溶液に座ってできるようにします。その後、ストレーナを持ち上げ、tは注ぐ彼液体廃棄物容器内のペトリ皿の内容。
   注： - 絨毛膜を除去するために、22時間ブリーチのみ0歳胚のサンプルが必要である。古いサンプルへの漂白剤の塗布を省略することができるが、その含有は有害ではない。省略を希望する場合は、PBTxと、この工程で漂白剤を交換してください。希薄化後漂白剤は溶液調製の24時間以内に使用する必要があります。
6. メッシュからサンプルを調達するストレーナに十分なPBTxを注ぐことにより、PBTxとストレーナでサンプルを洗浄します。サンプルは3分間溶液に座ってできるようにします。そして、ストレーナを持ち上げ、廃液容器にペトリ皿の内容物を注ぐ。
7. 繰り返しステップ2.6の5倍。
8. デイブセルストレーナーの乾燥の下​​部には、絵筆を使ってPEMS液1.75 mlを含むシンチレーションバイアルにサンプルを移す。
9. 換気されたドラフト内で作業する、シンチレーションバイアルに37％ホルムアルデヒド250μlの試薬グレードのヘプタン8ミリリットルを追加します。
   注意：ホルムアルデヒドおよびヘプタンは危険です。 3.3 - 安全のため、換気されたドラフト内で作業し、ステップ2.9に適切な手袋を着用し続けています。
10. バイアルを20分間200回転または同様の適度なスピードで振るようにします。
11. 前の水相を除去することなく、シンチレーションバイアルに10mlのメタノールを加え、バイアルを1分間500rpmで激しく振りすることができます。
    注意：メタノールは危険です。換気されたドラフト内で作業し、適切な手袋を着用し続けます。
12. シェーカーからバイアルを取り出し、すぐにフード内の液体廃棄物容器の上にセルストレーナーに内容を注ぐ。バイアルに余分なメタノールを追加し、すべてのサンプルが削除されていることを確認するために、必要に応じてセルストレーナーを介して実行。
    注：セルストレーナーがゆっくりと排出することができる。これを解決するには、より迅速にストレーナーを通して溶液を引くために、セルストレーナーの底に実験室の組織をタッチします。メタノール、ホルムアルデヒド、およびヘプタンであるべき施設のガイドラインに従って適切に廃棄するまで、適切な廃棄物容器に格納されている。
13. 実験室の組織を用いて細胞ストレーナーの乾燥底部は、次いでメタノール0.5 mlを含む1.5mlのマイクロチューブにストレーナに取り込まれたサンプルを転送するために絵筆を使用しています。
    セルストレーナー上での乾燥からサンプルを防ぐために、一度に2.12と2.13 1バイアル複数のシンチレーションバイアルが使用されている場合は、手順：注意してください。
14. 試料が微量遠心管に添加された後、ピペットを用いて、メタノールを除去。サンプルは、チューブの底に沈殿していることを確認してください。
15. 試験管にメタノール約0.5ミリリットルを添加することにより微量遠心管中に試料をすすぐ。その後落ち着くピペットでメタノールを除去するためのサンプルのを待ちます。
16. 繰り返しステップ15三回。
17. 試験管にメタノールを0.5ミリリットルを追加し、後で使用するために℃の冷凍庫-20℃で保存する。

3。再水和および免疫染色用サンプルの調製

1. チューブ内のサンプルを残して、ピペットを用いてマイクロチューブからメタノールを除去します。適正処理するまで、適切な廃棄容器に保管メタノール廃棄物。
   、超音波処理効率を向上させるために、試料のせいぜい3ミリメートルを1.5 mlマイクロチューブの底に沈降していない使用します。注意して​​ください。過剰のサンプルは、上記の再水和ステップを始める前に、ピペットを用いて別のチューブに移すことができる。清浄なカミソリの刃でピペットの先端をカットするピペットチップの目詰まりを防止するために使用することができる。
2. 3分間、チューブやロックに50％メタノール/リン酸緩衝液のTween（PBTw）溶液1.0mlを追加します。
3. 適切な廃棄容器にメタノール水溶液を取り出し、二回PBTwの1.0μlを洗い流してください。各リンス後、サンプルをピペットでPBTwをオフに描画する前に解決することができます。
4. バイアルと岩に混ぜウシ血清アルブミン/リン酸緩衝トゥイーン（BBTw）の1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上の3分後、SAMPを許可ルを沈降し、ピペットでBBTwを削除します。
5. 繰り返しステップ3.4最後の洗浄後のサンプルを失うことなく、可能な限り多くのBBTwを削除するように注意しながら2回。
6. チューブにBBTwの0.5ミリリットルを加え、チューブを氷上に置きます。

サンプルの4。超音波処理

1. 10％最大振幅の超音波処理装置を設定し、2秒定数の超音波処理の実行時間を指定します。
   注：これらの設定は、材料および装置の表に示されている超音波処理装置に固有であり、異なる超音波処理の最適化が必要な場合があります。
2. サンプルの超音波処理に先立って、50ミリリットルにプローブを洗浄するために、脱イオン水および実行ソニケーターで満たされたコニカルチューブをプローブ先端を配置することによって、超音波処理器プローブを清掃してください。走行後、実験室組織とドライ超音波処理器プローブ。
3. それが位置するように、約3〜4ミリメートルのサンプルの上に試料を含有するマイクロチューブにプローブを浸し、超音波処理を開始します。
4. Mを削除するicrocentrifuge管および超音波処理からの熱を放散し、試料を微量遠心チューブの底に沈降させるために、少なくとも30秒間、氷上に置く。
5. 処理されているサンプルの年齢に基づいて、必要に応じて繰り返します4.3と4.4を繰り返します。
   注：最適な超音波処理のサンプル·ボリュームの場合、より若い17時間を胚は超音波処理を必要としませんが、17および24時間（ステージ17 /早-L1）との間のものが2超音波処理を必要とします。 36（初期/中期L1）、36 - - 48（中期/後期-L1）、48から60（初期/中期L2）、60から72（中期​​/後期-L2）、72から84（24との間の幼虫早期L3）、84から96（初期/中期L3）、96 - ）108（中期/後期-L3時間はそれぞれ5、9、11、13、15、18、22超音波処理を必要とする。超音波処理時間へのさらなる詳細のための議論を参照してください。
6. BBTw回1.0ミリリットルで洗浄すること。各すすいだ後、サンプルがピペットでBBTwをオフに描画する前に解決することができます。
7. バイアルと岩にBBTwの1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上の3分後、サンプルをピペットでBBTwを解決して削除することができます。
8. 繰り返しステップ4.7の2倍。

5。免疫染色

1. マイクロ遠心チューブにBBTwで希釈した5％正常血清を添加することにより、サンプルをブロックします。 1時間ロッキング後のブロックを削除します。
   注：二次抗体が生成される種から正常血清を使用してください。
2. 5％正常血清/ BBTw溶液中での作業濃度を適切な一次抗体を希釈します。
3. 4℃で、または（約22°C、室温で少なくとも3時間、一次抗体溶液をOで岩石試料/ N。
   注：抗体インキュベーション時間および温度は変更になる場合があります。 O / NをRTで4℃でのインキュベーション、または3時間、典型的には十分である。しかし、2日間のインキュベーション期間は、特に古いサンプルまたは低親和性の一次抗体を使用すると、染色の品質を向上させることができる。より長いインキュベーションは、典型的には4℃で行われる。二次抗体を使用した場合、同様の考察は（5.10を参照）を行う必要があります。
4. サンプルはに沈むことを許可マイクロチューブの底。ピペットを用いて一次抗体をオフに描画します。必要に応じて再利用するための抗体を保存します。
5. 二回BBTwの1.0ミリリットルで洗浄すること。各すすいだ後、サンプルがピペットでBBTwをオフに描画する前に解決することができます。
6. バイアルと岩にBBTwの1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上の3分後、サンプルをピペットでBBTwを解決して削除することができます。
7. 繰り返しステップ5.6の5倍。
8. マイクロ遠心チューブに5％正常血清/ BBTw溶液を添加することによって、ブロックのサンプル。 1時間に30分間ロッキング後のブロックを削除します。
   注：この追加のブロッキング工程は必須ではありませんが、特異的な抗体の染色品質を向上させることができる。
9. 5％正常血清/ BBTw溶液中での作業濃度を適切な二次抗体を希釈する。
10. 露光に起因する退色低減するためにアルミホイルでマイクロチューブを包みます。 4℃で12時間〜48用の二次抗体溶液中またはRT（約22℃で少なくとも3時間岩石試料。
11. サンプルはマイクロチューブの底に沈殿することを許可する。ピペットを用いて二次抗体をオフに描画します。
12. 二回PBTwの1.0ミリリットルで洗浄すること。各すすいだ後、サンプルがピペットでPBTwをオフに描画する前に解決することができます。
13. バイアルと岩にPBTwの1.0ミリリットルを追加します。ロッカー上で5分後、サンプルをピペットでPBTwを解決して削除することができます。
14. 繰り返しステップ5.13三回。
15. オプション：PBTw 1,000：DAPIは1に希釈し追加します。岩石試料は、3分間のアルミホイルに包まれ;その後ピペットでDAPI溶液を取り除く。サンプルはピペットでPBTwを削除する前に沈降させ、PBTwの1.0ミリリットルで5回洗浄します。
16. -20℃でのマイクロ遠心チューブとストアに1,4 - ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン（DABCO）溶液100μl - 80を追加する。
    注：別のグリセロールベースの​​アンチフェード剤は、置換されていてもよい。

6。分析

1. DABCO / P-フェン10μlの - スライド上にサンプルをマウントする前に、余分な5を追加メチレンジアミン（PPD）マイクロチューブに退色防止ソリューションを提供します。
   注：サンプルは、切開せずにスライドに添加することができる。スライドに添加された試料体積は、カバースリップの大きさによって変化する。スライド上にサンプルをピペッティングすると、ピペットチップは、試料の剪断を防止するために、カミソリの刃を用いて切断することができる。それは簡単な分析のために列にサンプルを並べることが有用であることが多い。付加的な退色防止剤としてPPDの添加は必要とされないかもしれないが、サンプルは長期間保存した場合、光退色を防止することができる。
2. 静かにサンプル上のカバーガラスを配置します。マニキュアを使用して適切な位置で、安全なカバースリップ。
3. ビューは、蛍光顕微鏡を使用してサンプルをマウントした。

結果

その場での後期胚および幼虫の組織の分析において超音波処理ベースの免疫染色の有効性を実証するために、野生型の胚および幼虫は精巣、卵巣、および神経組織の免疫染色のために処理した。サンプルは、共焦点顕微鏡を介して画像化した代表的な結果は、（ 図1及び図2）が示されている。結果は、記述されたプロトコルは、 ショウジョウバエの開?...

ディスカッション

このプロトコルは、成功したので、解剖の必要性を排除し、 その場でターゲットショウジョウバエ胚および幼虫組織を免疫染色する方法を提供する。初期胚の^1,2,3を染色するための従来のプロトコルに従って、絨毛膜は、50％の漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム）を用いて除去される。サンプルは、ホルムアルデヒドおよびメタノール中で固定されている。幼虫のクチクラ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)			For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)			For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10%			For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS			0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes			For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol		CAS 67-56-1	Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS: 281-57-9	To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution			1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates			To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10%			To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste			~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa			1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
mouse anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Goat anti-rabbit Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Goat anti-mouse Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Goat anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.		Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 μm cellulose nitrate membrane filter