늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

요약

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

초록

초파리에서 수행 연구는 배아 및 유충은 세포의 운명 사양 및 기관 형성 등의 발생 과정에 중요한 통찰력을 제공 melanogaster. 면역 염색은 조직 및 기관의 개발 시각화한다. 그러나 배아의 끝 부분에 형성하는 보호 표피 늦게 단계의 배아 및 유충에 항체의 투과를 방지 할 수 있습니다. 면역 염색 전에 절개 정기적 초파리 유충의 조직을 분석하는 데 사용되는 반면 작은 조직 찾아서 분리하기 어려울 수 있기 때문에, 그것은 어떤 분석 비효율적 증명한다. 초음파는 애벌레 초파리 면역 염색 프로토콜의 해부에 대한 대안을 제공합니다. 늦은 단계의 배아 및 유충의 대량의 빠른 동시 처리 가능하며 현장 형태로 유지한다. 포름 알데히드에 고정 후, 샘플을 초음파 처리한다. 샘플은 다음 항원 특정 기본 개미와 면역 염색을 실시ibodies 및 형광 표지 이차 항체는 형광 현미경을 통해 표적 세포 유형 및 특정 단백질을 가시화한다. 초음파 처리의 과정에서, 상기 시료에 초음파 프로브뿐만 아니라, 초음파의 강도와 지속 시간의 적절한 배치가 중요하다. 표준 면역 프로토콜로 부가적인 약간의 수정은 고품질의 얼룩을 위해 필요할 수있다. 잡음비 낮은 신호에 대한 항체, 긴 배양 시간은 통상적으로 필요하다. 이 초음파 - 촉진 프로토콜에 대한 개념의 증거로서, 우리는 발달 단계의 범위에서 세 가지 조직 유형 (고환, 난소 및 신경 조직)의 면역 염색을 보여줍니다.

서문

초파리의 배아 및 유충은 많은 기관과 조직의 발달 과정을 연구 할 수있는 좋은 모델을 제공합니다. 개별 세포의 세포 이미징을 개발하는 복잡한 환경을 확인하기 위하여, 이들 연구에서 종종 필요하다. 조직에서 세포의 면역 염색을 통해 시각화 달성 될 수있다. 프로토콜 17 시간 달걀 누워 (AEL) ^1-3 후 배아 초파리 조직 <존재하는 면역 염색 잘 설명했다. 효과적인 항체의 투과를 방지하는 배아의 단부를 향해 그러나 보호 표피 형태. 따라서, 이러한 면역 염색 프로토콜은 늦게 단계의 배아에서 조직의 분석과 애벌레 개발 ^{(1 차} 령 (L1), 2 ^차 령 (L2), 및 3 ^차 령 (L3))의 후속 단계에서 비효율적이다. 이 비 효율성이 확장 개발 기간 ⁴ 중 발생하는 동적 프로세스에 대한 우리의 이해에 장벽을 부과한다. 담배 마는UE 절제술이 장벽 ^5-7을 우회 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. 그러나, 해부 비효율적 증명할 수 있습니다. 추출은 위치 또는 배아와 애벌레 조직을 분리하는 어려움에 의해 방해를 할 수있다. 또한, 표적 조직의 물리적 제거를 파열 또는 그 전체를 추출하기 위해 실패에 의해 손상 될 수 있습니다.

초음파는 분자간 상호 작용을 방해 음파를 이용하는 방법입니다. 이는 신경 세포 유형 ^6을 개발하기 위해 발현 사이 초파리 유충 표피의 무결성을 파괴하는데 사용되어왔다. 이 프로토콜은 늦게 단계 배아 직경 ^{8 ~ 10} 년으로 50μm 작게 할 수있다 애벌레 생식선을 발현 사이하도록하고있다. 이러한 연구를 통해, 수컷 생식선 줄기 세포 (GSC) 틈새 형성 과정이 말기에있어서 한 줄기 세포 발달과 DIF 조절 초파리 배아 ^8-10 및 메커니즘후기 배아 생식선 및 유충의 ferentiation ^9-12을 밝혀왔다. 따라서, 초음파로 인해 조직의 크기가 어려울 수 있습니다 조직 절개에 대한 효율적인 대안을 제공합니다. 또한, 전체 유기체의 컨텍스트 내에서 셀을 떠나 시츄 형태로 유지 시츄 초파리 조직의 면역 염색을 가능하게한다. 여기에, 우리는 현장에서 초 / 중반 L3 조직을 통해 늦게 단계 배아의 형광 면역 염색에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 초파리 생식선 및 신경 조직의 분석은이 프로토콜의 효능을 입증하기 위해 대표 결과에 나타낸다. 또한,이 면역 프로토콜은 외부 표피와 기타 다른 초파리 생물 조직뿐만 아니라 조직을 분석하도록 구성 될 수있다.

프로토콜

컬렉션 케이지의 1 준비

1. CO ₂ 젊은, 비옥 한 파리를 마취. 케이지에 마취 파리를 전송합니다. 최적의 수율을 얻을 수 사에 나이 2~7일에 이르기까지 100-120 성인 파리를 사용하려면 다음과 남성에 대한 여성의 한 비율입니다. 파리에게 적절한 순응 기간을 허용 ~ 24 시간 고정을 위해 샘플을 획득하기 전에. 48 시간 순응 기간 - 케이지가 처녀 여성으로 설정 한 경우 남성에 사용 36를 결합.
2. 케이지의 개방 단부에서 케이지의 구멍에 중심에 효모 페이스트의 한푼 크기의 방울 미리 준비된 사과 주스 한천 플레이트를 배치합니다. 그런 다음, 테이프로 고정합니다. 사과 주스 한천 플레이트와 파라 필름와 케이지의 접합부를 밀봉.
3. 염기로서 사과 쥬스 한천 플레이트와 보조 용기에 케이스를 놓고 실험에 의해 결정된 바와 같이 파리 적절한 기간에 대해 정의 된 온도에서 재현 할 수있다.
   참고 : 시료 채취 시간 위스콘신다를 것이다. 후기 배아 / 초기 L1 유충 수집 할 때 예를 들어, (17-24 시간)를, 파리는 25 ° C에서 17 시간 동안 사전 샘플의 노화에 25 ℃에서 7 시간 동안 사과 주스 한천 접시에 알을 낳기 위해 수 있습니다. 마찬가지로, 중반 후반 첫번째 령 애벌레의 컬렉션 (36-48 시간) 파리 25 ° C에서 36 시간 동안 사전 샘플의 노화에 25 ° C에서 12 시간 동안 알을 낳기 위해 수 있습니다.
4. 기간이 완료되면 파리 마취없이 떨어져 사과 주스 한천 플레이트에서 드롭 있도록 테이블에 새장을 누릅니다. 신속 효모 페이스트의 방울을 함유 한 신선한 플레이트로 사용을 대체. 테이프와 파라 필름으로 신선한 판을 고정베이스로 사과 주스 한천 플레이트와 케이지를 저장합니다.
5. 조심스럽게 금속 주걱 사용 된 플레이트에서 효모 강하를 제거합니다. 실험적으로 필요한 경우 장소 사용되는 사과 주스 접시에 뚜껑 나이에 배아를 마련 할 수 있습니다.
   참고 : 샘플을 노화 동안 판은 25 ° C에서 저장 될 수있다 높은 온도가 experimenta가 아니라면에서야이 필요합니다. 상기 기술 한 바와 같다 수집을위한 배아를 나이하는 방법의 예 (단계 1.3 참고 사항을 참조하십시오). 노화를 샘플링하기 전에 효모 페이스트의 제거는 효모에 크롤 링 아래 한천을 깨는에서 유충을 방지하기 위해 수행된다. 나머지 사과 주스 한천과 효모 붙여 넣기 잔류 애벌레 성장을위한 영양분을 제공합니다. 효모 페이스트에 직접 배치 배아 효모 페이스트 제거를 통해 손실되는 반면,이 손실은 염색 효율을 줄일 수있는 샘플 효모 및 한천 잔류하는 것이 바람직하다. 하나는 효모 페이스트를 제거하지 않도록 선택한 경우, 효모는 페인트 브러시와 혼합, 인산염 버퍼 트리톤 X-100 (PBTx)와 액화 한 후 이전에 고정에 셀 스트레이너를 사용하여 샘​​플에서 제거 할 수 있습니다.

2 고정

1. 사과 주스 한천 플레이트에 배치 배아가 원하는 시점에 세되면, 조심스럽게 일에서 샘플을 제거 인산 버퍼 트리톤 X-100 (PBTx) 용액에 적신 작은 붓을 사용하여전자 판.
   참고 : 이전 애벌레 이동하고 뚜껑의 안쪽에 크롤링 할 수 있습니다. 이 샘플은 페인트 브러시와 제거에 의해 유사하게 수집 할 수있다.
2. 셀 스트레이너의 내부를 향하는 능선에 대한 샘플을 함유 한 페인트 브러시를 닦아주십시오. 그런 다음, 스트레이너의 벽과 PBTx 솔루션을 포함하는 물총 병 붓을 씻어. PBTx 솔루션을 캡처 여과기 아래에 배양 접시 덮개를 놓습니다.
3. 모든 샘플은 여과기로 전송 된 후, 메쉬 오프 샘플 인상 여과기로 충분히 PBTx을 붓는다. 그리고, 스트레이너를 올려 액체 폐기물 컨테이너로 페트리 접시의 내용을 붓는다.
4. 단계를 반복 2.3 세 번 효모를 제거하고 샘플과 함께 전송 된 수 있습니다 폐기물을 비행.
5. 메쉬를 유충을 제기하기에 충분한 50 % 표백제 여과기에 (의 NaOCl) / 물 (DDH ₂ O) 용액을 붓는다. 유충은 5 분 동안 용액에 앉아 할 수 있습니다. 그런 다음, 스트레이너를 들어 올려 t을 부어그는 액체 폐기물 용기에서 배양 접시의 내용을 표시합니다.
   참고 : - 융모막 막을 제거하기 위해 22 시간 표백제는 0 세 배아 샘플이 필요합니다. 이전 샘플 표백제 애플리케이션은 생략 할 수 있지만, 그것의 포함은 유해하지 않다. 누락이 필요한 경우, PBTx이 단계에서 표백제를 대체. 희석 표백제 용액 준비 24 시간 이내에 사용하시기 바랍니다.
6. 메시 오프 샘플을 높이기 위해 스트레이너에 충분한 PBTx을 부어 PBTx와 여과기에 샘플을 씻으십시오. 샘플 3 분 동안 용액에 앉아 할 수 있습니다. 그리고, 스트레이너를 올려 액체 폐기물 컨테이너로 페트리 접시의 내용을 붓는다.
7. 반복 단계 2.6 다섯 번.
8. 셀 스트레이너 건조의 바닥 DAB 후 붓을 사용 PEMS 용액 1.75 ㎖에 함유하는 섬광 바이알로 샘플을 전송.
9. 환기 흄 후드에서 작업, 37 %의 포름 알데히드 250 μL와 섬광 유리 병에 시약 등급 헵탄의 8 ML을 추가합니다.
   참고 : 포름 알데히드 및​​ 헵탄이 위험합니다. 3.3 - 안전을 위해 통풍이 잘되는 흄 후드 작동 및 단계 2.9에 적합한 장갑을 착용하는 것을 계속한다.
10. 유리 병은 200 rpm으로 20 분 동안 비슷한 적당한 속도로 흔들 수 있습니다.
11. 이전의 성상을 제거하지 않고 섬광 유리 병에 메탄올 10 mL를 넣고 유리 병은 1 분 동안 500 rpm으로 흔들어 할 수 있습니다.
    참고 : 메탄올은 위험합니다. 환기 흄 후드에서 작업하고 적절한 장갑을 착용 계속합니다.
12. 후드에서 액체 폐기물 용기 위에 셀 스트레이너에 내용을 부어 바로 통에서 유리 병을 제거하고. 바이알에 여분의 메탄올을 첨가하고 모든 샘플이 제거되었는지 확인하기 위해 필요한 셀 스트레이너를 통해 실행.
    참고 : 셀 스트레이너 천천히 방전 될 수 있습니다. 이를 해결하기 위해,보다 빠르게 여과기를 통해 용액을 그리기 위해 셀 스트레이너의 바닥 실험실 조직을 터치. 메탄올, 포름 알데히드, 헵탄이 있어야한다제도적 지침에 따라 적절한 폐기 될 때까지 적절한 폐기 용기에 보관.
13. 실험실 조직을 사용하여 셀 스트레이너의 마른 바닥, 메탄올 0.5 ㎖에 들어있는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 스트레이너에서 캡처 샘플을 전송하기 위해 붓을 사용합니다.
    참고 : 여러 섬광 유리 병을 사용하는 경우 단계를 완료 2.12 한 번에 2.13 한 병 셀 스트레이너에 건조에서 샘플을 방지 할 수 있습니다.
14. 샘플이 microcentrifuge 관에 추가되면, 피펫과 메탄올을 제거합니다. 확인 샘플 튜브의 바닥에 침전되었다.
15. 튜브의 메탄올 0.5 ㎖에 첨가하여 microcentrifuge 관에 샘플을 헹군다. 다음 정착 피펫 메탄올을 제거하는 샘플 기다립니다.
16. 단계를 반복하여 15 세 번.
17. 에서 관에 메탄올 0.5 ML을 추가 한 다음 저장 -20 나중에 사용하기 위해 C 냉동고 °.

3 재수 및 면역 염색을위한 시료의 준비

1. 튜브 샘플을 떠나, 피펫 microcentrifuge 관에서 메탄올을 제거합니다. 적절한 폐기 때까지 적절한 폐기 용기에 보관 메탄올 폐기물.
   , 초음파 처리 효율을 향상시키기 위해 시료의 더 이상 3mm가 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브의 바닥에 침전 없음 사용 참고. 과잉 시료 위 재수 화 공정을 시작하기 전에 피펫 분리 튜브로 이송 될 수있다. 깨끗한 면도날과 피펫 팁을 절삭하는 피펫 팁의 막힘을 방지하기 위해 사용될 수있다.
2. 3 분 동안 튜브와 바위에 50 % 메탄올 / 인산 버퍼 트윈 (PBTw) 솔루션의 1.0 ML을 추가합니다.
3. 적절한 폐기물 용기에 메탄올 용액을 제거하고 두 번 PBTw의 1.0 μl를 씻어. 각 린스 후, 샘플 피펫 PBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다.
4. 소 혈청 알부민 / 인산염 완충 트윈 (BBTw)의 1.0 ML을 추가 바이알과 바위에 섞는다. 로커에 3 분 후, SAMP를 허용르 정착과 피펫 BBTw를 제거합니다.
5. 단계를 반복 마지막 세척 후 샘플을 잃지 않고 가능한 한 많은 BBTw을 제거 돌보는 3.4 두 번.
6. 튜브에 BBTw의 0.5 mL를 넣고 얼음에 튜브를 배치합니다.

샘플의 4 초음파 처리

1. 10 % 최대 진폭에 초음파기를 2 초 일정 초음파의 실행 시간을 지정합니다.
   참고 :이 설정은 재료 및 장비 표에 표시된 초음파기에 고유 한 다른 sonicators에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.
2. 이전 시료의 초음파로, 프로브를 청소하는 탈 이온수 및 실행 초음파기 가득 50 ML 원뿔 튜브에 프로브 팁을 배치하여 초음파기 프로브를 청소합니다. 실행 한 후 실험실 조직과 드라이 초음파기 프로브.
3. 이 시료 위에 약 3-4mm 배치되도록 샘플을 함유하는 마이크로 원심 튜브에 프로브를 담그고 초음파 처리를 시작한다.
4. m을 제거icrocentrifuge 튜브 초음파로부터 열을 소산 샘플 microcentrifuge 관의 하단에 정착 할 수 있도록 적어도 30 초 동안 얼음에 배치하고.
5. 반복 4.3 및 처리되는 샘플의 연령에 따라 필요에 따라 4.4 단계를 반복합니다.
   참고 : 최적의 초음파 샘플 볼륨의 경우, 초음파를 필요로하지 않는 미만 17 시간 배아, 그러나 그 시간 17 사이의 24 (/ 17 단계 초기 L1)이이 sonications이 필요합니다. 애벌레 사이 24-36 (초 / 중반-L1), 36-48 (중 /-L1 후반) 48-60 (초 / 중반 L2), 60-72 (중 / 후반 L2), 72-84 ( )-L3 초, 84-96 (초 / 중반 L3), 96-108 (중 / 후반 L3) 시간이 필요 5, 9, 11, 13, 각각 15, 18, 22 sonications. 초음파 시간에 더 정교에 대한 설명을 참조하십시오.
6. BBTw 두 번 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 BBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다.
7. 유리 병 바위에 BBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에 3 분 후, 샘플 정착 피펫 BBTw를 제거 할 수 있습니다.
8. 단계를 반복 4.7 두 번.

(5) 면역 염색

1. microcentrifuge 관에 BBTw에 희석 5 % 정상 혈청을 추가하여 샘플을 차단합니다. 1 시간 동안 락을 한 후 블록을 제거합니다.
   참고 : 보조 항체가 생성되는 종에서 정상 혈청을 사용합니다.
2. 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액에 농도를 적절한 작업하는 차 항체를 희석.
3. 4 ° C에서 또는 (약 22 ° C 실온에서 적어도 3 시간 동안 차 항체 솔루션 O 락 샘플 / N.
   주 : 항체 배양 시간 및 온도는 다를 수 있습니다. O / RT에서 N 4 ° C에서 배양 또는 3 시간은 일반적으로 충분합니다. 그러나,이 일의 잠복기는 특히 오래된 샘플 또는 낮은 친화력 차 항체를 사용하는과, 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다. 긴 인큐베이션은 일반적으로 4 ° C에서 수행됩니다. 이차 항체 (5.10 참조)을 사용하면 유사한 고려가 이루어져야합니다.
4. 샘플에 정착 할 수 있도록 허용미세 원심 분리 튜브의 바닥. 피펫 차 항체를 그립니다. 원하는 경우 재사용에 대한 항체를 저장합니다.
5. 두 번 BBTw의 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 BBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다.
6. 유리 병 바위에 BBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에 3 분 후, 샘플 정착 피펫 BBTw를 제거 할 수 있습니다.
7. 반복 단계 5.6 다섯 번.
8. microcentrifuge 관에 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액을 첨가함으로써 차단 샘플. 1 시간 30 분 동안 흔들 후 블록을 제거합니다.
   이러한 추가적인 차단 단계가 필요하지 않고, 특정 항체 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다.
9. 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액에 농도를 작동하는 적절한 보조 항체를 희석.
10. 빛 노출로 인해 변색 줄이기 위해 알루미늄 호일에 microcentrifuge 관을 감 쌉니다. 4 ° C에서 12 시간 48 2 차 항체 용액 또는 RT (약 22 ° C에서 적어도 3 시간 동안 바위 샘플.
11. 샘플 미세 원심 분리 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 피펫 차 항체를 그립니다.
12. 두 번 PBTw의 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 PBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다.
13. 유리 병 바위에 PBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에서 5 분 후, 샘플 정착 피펫 PBTw를 제거 할 수 있습니다.
14. 단계를 반복 5.13 세 번.
15. 옵션 : 1,000 PBTw에 : DAPI 1 희석 추가합니다. 록 샘플은 3 분 동안 알루미늄 호일에 싸서; 다음 피펫 DAPI 솔루션을 제거합니다. 샘플 피펫 PBTw를 제거하기 전에 정착 할 수 있도록 PBTw의 1.0 mL를 다섯 번 씻어.
16. -20 ° C에서 microcentrifuge 관 및 저장소에 1,4 - 디아 자비 시클로 [2.2.2] 옥탄 (DABCO) 용액 100 ㎕ - 80를 추가합니다.
    주의 : 다른 글리세롤 계 안티 - 페이드 에이전트가 대신 할 수있다.

(6) 분석

1. DABCO / P-페닐의 10 μL - 슬라이드에 샘플을 설치하기 전에 여분의 5를 추가ylenediamine (PPD) microcentrifuge 관에 antifade 솔루션입니다.
   참고 : 샘플 절개없이 슬라이드에 추가 할 수 있습니다. 슬라이드에 추가 샘플 볼륨을 커버 슬립의 크기에 따라 달라집니다. 슬라이드 상에 샘플을 피펫 때 피펫 팁은 시료 전단 않도록 면도날을 이용하여 차단 될 수있다. 그것은 쉬운 분석을위한 행 샘플을 정렬하는 것이 유용하다. 추가 antifade 제로 PPD의 첨가는 필요하지 않을 수 있지만, 샘플 장기 photobleaching에 저장되어있는 경우를 방지 할 수있다.
2. 부드럽게 샘플을 통해 유리 커버 슬립을 배치합니다. 그런 장소에 보안 커버 슬립은 매니큐어를 사용.
3. 보기는 형광 현미경을 이용하여 시료를 탑재.

결과

마지막 단계의 배아와 현장에서 애벌레 조직의 분석 초음파 기반의 면역 염색의 효능을 입증하기 위해, 야생 형 배아 및 유충은 고환, 난소의 면역 및 신경 조직을 위해 처리 하였다. 샘플은 공 초점 현미경을 통해 몇 군데 있었다 대표적인 결과는 (그림 1과 그림 2)를 나타낸다. 결과는 설명 프로토콜은 초파리 개발의 늦은 배아 초기 통해 / 중간 L3 단계에서 형태 적 특징?...

토론

이 프로토콜은 성공적 따라서 박리를위한 필요성을 제거 반응계에서 초파리 배아와 유충 표적 조직 발현 사이하는 방법을 제공한다. 초기 배아에게 ^1,2,3 염색을 위해 사전 프로토콜에 따라, 융모막 멤브레인은 50 % 표백제 (NaOCl을)를 사용하여 제거한다. 샘플은 포름 알데히드와 메탄올에 고정되어 있습니다. 애벌레 표피가 떠있는 오래된 샘플을 발생하기 때문에, 전체 샘플은 애벌?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)			For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)			For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10%			For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS			0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes			For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol		CAS 67-56-1	Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS: 281-57-9	To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution			1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates			To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10%			To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste			~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa			1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
mouse anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Goat anti-rabbit Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Goat anti-mouse Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Goat anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.		Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 μm cellulose nitrate membrane filter