Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Özet

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

Özet

Drosophila yapılan çalışmalar embriyo ve larva gibi hücre kaderi şartname ve organogenezis gibi gelişimsel süreçlerine önemli bilgi sağlar melanogaster. İmmünoboyama doku ve organların geliştirilmesi görselleştirme sağlar. Bununla birlikte, embriyojenez sonunda oluşturan bir koruyucu üst deri geç dönem embriyo ve larvalarına antikorların geçirmesini engeller. Immün önce diseksiyon düzenli Drosophila larva dokularının analiz etmek için kullanılır iken, küçük dokular bulmak ve izole etmek zor olabilir çünkü, bazı analizler için verimsiz kanıtlıyor. Sonikasyon larva Drosophila immünoboyamasıdır protokoller diseksiyon için bir alternatif sağlar. Geç evre embriyo ve larvaların çok sayıda hızlı, eşzamanlı işleme izin verir ve yerinde morfolojisi tutar. Formaldehit içinde tespit sonra, bir numune ultrasonik banyoda tutulur. Numune, daha sonra antigen-spesifik primer ant ile imüno tabi tutuluribodies ve floresan etiketli sekonder antikorlar floresan mikroskobu ile hedef hücre tiplerini ve spesifik proteinlerin görselleştirmek için. Sonikasyon işlemi sırasında numunenin üstüne, bir sonikasyon probu, hem de sonikasyon süresi ve yoğunluğu, uygun yerleştirilmesi kritik öneme sahiptir. Standart immünoboyama protokolleri Ek bir küçük değişiklikler, yüksek kaliteli lekeler için gerekli olabilir. Gürültü oranı düşük sinyalli antikorlar için, daha uzun inkubasyon süreleri tipik olarak gereklidir. Bu Sonication kolaylaştırdı protokol konseptinin bir kanıtı olarak, gelişim aşamaları bir dizi üç doku tiplerinin (testisler, yumurtalıklar, ve nöral dokular) arasında immunohistokimyasal göstermektedir.

Giriş

Drosophila embriyoları ve larvaları birçok organda ve dokuda gelişim süreçlerini incelemek için mükemmel bir model sunmaktadır. Tek tek hücrelerin Görüntüleme hücrelerinin geliştiği karmaşık ortamları tespit etmek için, bu çalışmalarda genellikle gereklidir. Dokusunun Görselleştirme imüno yoluyla gerçekleştirilebilir. Protokolleri 17 saat Yumurtlayarak (AEL) ^1-3 sonra embriyonik Drosophila dokular (1. safha ^(L1), 2. safha (L2) ve 3. ^instar (L3)) daha sonraki aşamalarında verimsizdir. Bu verimsizlik bu genişletilmiş gelişme döneminde ⁴ sırasında meydana dinamik süreçleri anlamamıza engel dayatır. Tissue diseksiyonu bu engeli ^5-7 aşmak için bir yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Ancak, diseksiyon verimsiz kanıtlayabilirim. Ekstraksiyon bulma veya embriyonik ve larva dokuları izole güçlüğü ile ipotekli olabilir. Bundan başka, hedef dokuların fiziksel giderilmesi, bunları kırılması ya da tamamen bunları elde etmek için başarısız olarak zarar görmesine neden olabilir.

Sonikasyon arası etkileşimleri bozmak ses dalgaları kullanan bir yöntemdir. Nöral hücre tipleri ⁶ geliştirmek immunostain amacıyla Drosophila larva kütikül bütünlüğünü bozmak için kullanılmıştır. Bu protokol geç evre embriyonik ve çapı ^8-10 50um kadar küçük olabilir larva organlarında, immunostain adapte edilmiştir. Bu çalışmaları sayesinde, erkek tohum çizgisi kök hücreleri (GSC) hücresi oluşum süreci sonunda aşamasında karakterize edilmiştir kök hücre gelişimini düzenleyen ve dif Drosophila embriyolar ^8-10 ve mekanizmaGeç evre embriyonik gonadlar ve larvaları ferentiation ^9-12 saptanamamıştır. Böylece, sonikasyon nedeniyle doku boyutu zor olabilir doku diseksiyonu etkili bir alternatif sağlar. Bundan başka, bütün organizmanın bağlamında hücreleri bırakarak ve in situ morfolojisinde muhafaza yerinde Drosophila dokuların imüno-boyanmasını sağlar. Burada, in situ / erken orta L3 dokular içinden geç embriyonik aşama floresanlığıdır immün için adım adım protokol açıklar. Drosophila gonadal ve sinir dokusunun analizi bu protokolün etkinliğini göstermek için Temsilcisi Sonuçlar gösterilir. Ayrıca, bu imüno protokol bir dış kütikül diğer organizmalardaki diğer Drosophila dokusunu ve dokularının analiz edilmesi için adapte edilebilir.

Protokol

Bir Toplama Cage 1. Hazırlık

1. CO ₂ genç, bereketli sinekler uyutmak. Bir kafese sineklere aktarın. Optimal verim elde 4 yaşı 2-7 gün arasında değişen 100-120 yetişkin sinekler kullanmak için: erkeklerin kadın 1 oranında. Sinekler uygun bir alışma dönemi Veren, ~ 24 saat tespiti için numune alınması öncesinde. 48 saat alışma dönemi - kafes bakire kadın ile kuruldu ise, erkeklere bir kullanımı 36 evlendirdi.
2. Kafesin açık ucunda, kafesin açıklığın üzerine merkezi maya hamur bir bozuk para büyüklüğünde damla ile önceden hazırlanmış bir elma suyu agar plaka yerleştirin. Sonra, bant ile sabitleyin. Elma suyu agar plaka ve Parafilm ile kafesi arasında kavşak mühür.
3. Baz olarak elma suyu agar plakası ile ikincil bir kap içinde kafes yerleştirin ve deney ile belirlendiği gibi sineklerin uygun bir zaman süresi için, belirli bir sıcaklıkta yeniden sağlar.
   Not: Örnek toplama kez wideğişir ll. Geç aşama embriyolar erken / L1 larvaları toplamak, örneğin, (17-24 saat), sinekler 25 ° C'de 17 saat boyunca önce numune yaşlanmaya karşı 25 ° C'de 7 saat boyunca elma sulu agar tabakları üzerinde yumurta bırakmaya izin verir. Benzer şekilde, orta-geç birinci değişim safhasındaki larva toplanması için (36-48 sa) sinekler 25 ° C'de 36 saat boyunca önce numune yaşlanmaya 25 ° C'de 12 saat boyunca yumurta bırakmaya izin verir.
4. Süre tamamlandıktan sonra sinek anestezi olmadan uzakta elma suyu agar plaka damla böylece, bir masanın üzerine kafes dokunun. Çabuk maya hamur bir damla içeren bir taze, kullanılmış bir plaka değiştirin. Bant ve parafilm ile taze bir tabak Güvenli ve üs olarak elma suyu agar plaka ile kafesi saklayın.
5. Dikkatlice bir metal spatula ile kullanılan plaka maya damla çıkarın. Deneysel gerekirse Yer kullanılan elma suyu plaka üzerinde kapak ve yaş embriyolar koydu izin verir.
   Not: numuneler, yaşlanma, levhalar 25 ° C'de muhafaza edilebilir, daha yüksek sıcaklıklar Experimenta olmadıkçaLly gerekli. Yukarıda açıklanan koleksiyonu için embriyolar yaş için nasıl örnekler (1.3 adım için nota bakınız). Yaşlanmayı örnek önce maya hamur çıkarılması mayaya tarama ve altında agar kesiliyor larvaları önlemek için yapılır. Kalan elma suyu agar ve maya yapıştırma kalıntı larva büyümesi için besin sağlar. Maya hamur direkt olarak belirtilen embriyolar maya hamur çıkarılması ile kaybolur da, bu kayıp boyama verimini azaltır numunede maya ve agar tortu tercih edilir. Bir maya macun kaldırmak için seçmek, maya, bir boya fırçası ile karıştırılmış Fosfat Tamponu, Triton X-100 (PBTx) ile sıvılaştırılmış ve daha sonra önce tespit üzere bir hücre filtresinden ile numuneden uzaklaştırılabilir.

2. Sabitleme

1. Elma suyu ağan plakası üzerine döşenmiş embriyolar Arzu edilen zaman noktasında yaş arası sonra, dikkatli bir şekilde th örneği almak için Fosfat Tamponu, Triton X-100 (PBTx) bir eriyiği ile ıslatılır, küçük bir fırça kullanıne plakası.
   Not: Eski larva hareketlidir ve kapağın iç kısmına tarayabilir. Bu örnek, bir fırça ile uzaklaştırılarak elde edilmiş benzer şekilde elde edilebilir.
2. Bir hücre süzgeç iç bakan sırt karşı örnek yüklü fırça silin. Ardından, süzgeç duvarları ve PBTx çözüm içeren bir bücür şişe fırça durulayın. PBTx çözümü yakalamak için süzgeç altında bir petri kapağı yerleştirin.
3. Tüm numune filtresine transfer edilmesinden sonra, örgü kapalı numune yükseltmek için yeterli miktarda süzgeçten PBTx dökün. Daha sonra, süzgeç kaldırın ve bir sıvı atık kabına petri dökünüz.
4. Tekrarlayın Adım 2.3 üç kez maya kaldırmak ve numune ile birlikte aktarılmış olabilir atık uçmak.
5. Örgü larvalarını yükseltmek için yeterli% 50 çamaşır suyu içine süzgeçten (NaOCI) / su (GKD ₂ O) çözeltisi dökün. Larvaları 5 dakika boyunca solüsyon içinde bekletin. Ardından, süzgeç kaldırın ve t dökmeko bir sıvı atık kabına petri içerikleri.
   Not: - koryonik membran kaldırmak amacıyla 22 sa Bleach sadece 0 yaş embriyonik örnekleri gereklidir. Büyük örnekler için çamaşır suyu uygulaması atlanabilir, ancak dahil zararlı değildir. Ihmal isteniyorsa, PBTx, bu aşamada ağartıcı değiştirin. Seyreltilmiş ağartıcı çözelti hazırlama, 24 saat içinde kullanılmalıdır.
6. Örgü kapalı örneği yükseltmek için süzgeç içine yeterince PBTx dökerek PBTx ile süzgeç örnek yıkayın. Örnek 3 dakika boyunca solüsyon içinde bekletin. Daha sonra, süzgeç kaldırın ve bir sıvı atık kabına petri dökünüz.
7. Tekrarlayın Adım 2.6 beş kez.
8. Hücre süzgecinden kuru alt Dab, daha sonra bir fırça ile PEMS çözeltisinin 1.75 ml'sini ihtiva eden bir parıltı şişesine içine örnek aktarmak.
9. Bir havalandırılan bir duman başlığı içinde çalışan% 37 formaldehit ve 250 ul sintilasyon şişesine reaktif dereceli heptan 8 ml ekleyin.
   Not: Formaldehit ve heptan tehlikelidir. 3.3 - Güvenlik amaçları için, bir havalandırmalı davlumbaz çalışmak ve adımlar 2.9 uygun eldiven giymeye devam.
10. Şişe 200 rpm'de ve 20 dakika için de benzer bir orta hızda çalkalanır izin verin.
11. Önceki sulu fazın çıkarmadan sintilasyon şişesine 10 ml metanol eklenir ve şişe 1 dakika boyunca 500 rpm'de sallamak kuvvetli bir şekilde izin verir.
    Not: Metanol tehlikelidir. Havalandırılan bir davlumbaz çalışmak ve uygun eldiven giymeye devam.
12. Kaputu bir sıvı atık kabına üzerinde bir hücre süzgeç içine içeriğini dökün hemen sallantýyý şişe çıkarın ve. Şişeye ilave metanol ekleyin ve bütün numune kaldırıldı temin etmek için önemli bir hücre süzgecinden çalıştırın.
    Not: Hücre süzgeçler yavaş boşalabilir. Bu sorunu çözmek için, daha hızlı bir şekilde süzgecinden çözelti çekmek için bir hücre süzgecinden altına laboratuar doku dokunun. Metanol, formaldehit, ve heptan 'dır olmalıdırkurumsal kurallarına göre uygun bertaraf kadar uygun bir atık kaplarda saklanır.
13. Laboratuar doku kullanılarak hücre süzgecinden kuru alt metanol ve daha sonra 0.5 ml ihtiva eden 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süzgecinden yakalanan örnek aktarmak için bir fırça kullanılır.
    Not: Birden fazla ışıma flakon kullanımda ise, tam adımlar 2.12 ve bir seferde 2.13 bir şişe hücre süzgeçler üzerinde kurumasını örnek önlemek için.
14. Örnek mikrosantrifüj tüpüne eklenmiştir sonra, bir pipetle, metanolün çıkması. Emin örnek tüpün dibine yerleşmiştir.
15. Tüpe metanol yaklaşık 0,5 ml ilave etmek suretiyle mikrosantrifüj tüpü içinde örnek durulayın. Bundan sonra da dinlendirilir, bir pipet ile metanolün çıkması için numune bekleyin.
16. Adım 15 tekrar üç kez.
17. Bir tüpe metanol içinde 0.5 ml ilave edilir, ve daha sonra kaydetmek daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C sıcaklıkta dondurucuya.

3. Rehidrasyon ve immün için Numune Hazırlama

1. Tüp içinde örnek bırakarak bir pipet ile mikrosantrifüj tüpü ve metanol çıkarın. Uygun bertaraf zamanına kadar uygun bir atık konteynerine Mağaza metanol atık.
   , Sonikasyon verimliliğini artırmak için numunenin en fazla 3 mm, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü altındaki yerleşmiş kullanın: edin. Aşırı numunesi yukarıda adım rehidrasyon başlamadan önce bir pipet ile ayrı bir tüpe aktarılır. Temiz bir jilet ile pipet kesme pipet tıkanmasını önlemek için de kullanılabilir.
2. 3 dakika boyunca tüp ve kaya için% 50 metanol / Fosfat Tampon Tween, (PBTw) çözeltisi 1.0 ml ilave edilir.
3. Uygun atık kabına metanol çözüm çıkarın ve iki kez PBTw 1.0 ul ile yıkayın. Her durulama sonra, numune, bir pipet ile ortadan kaldırılmasından önce PBTw oturmasına izin verin.
4. Sığır Serumu Albümini / Fosfat Tamponlu Tween (BBTw) 1,0 ml ilave edilir ve şişe kaya karıştırın. Bir rocker 3 dakika sonra, SAMP sağlarle yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için.
5. Tekrarlayın Adım Son yıkamadan sonra, numune kaybetmeden mümkün olduğu kadar BBTw kaldırmak için dikkat 3.4 iki kere verilir.
6. Tüpe BBTw 0.5 ml ilave edilir ve buz üzerinde tüp yerleştirin.

Örnek 4. Sonikasyon

1. 10% maksimum genlik için sonikator ayarlayın ve 2 sn sabit sonikasyonun bir çalışma süresini tayin.
   Not: Bu ayarlar Malzeme ve Ekipmanları Tablo belirtilen sonikatöre özgü ve farklı sonicators için optimizasyon gerektirebilir.
2. Önceki örnek, sonikasyon işlemine, prob temizlemek için deiyonize su ve çalıştırma sonikatör ile dolu bir 50 ml'lik konik bir tüp içine prob ucunu yerleştirerek sonikatör probu temizleyin. Koşudan sonra laboratuvar dokusu ile kuru Sonikatör prob.
3. Bu numune üzerinde yaklaşık 3-4 mm konumlandığı şekilde numuneyi içeren mikrosantrifüj tüpü içine daldırın ve sonikasyon probu başlar.
4. M çıkarınicrocentrifuge boru sonikasyon ısı dağılımı ve örnek mikrosantrifüj tüp dibinde biriken izin vermek için en az 30 saniye boyunca buz üzerine yerleştirin ve.
5. Tekrar 4.3 ve işlenen numune yaşına göre gerektiğinde 4.4 adımları.
   Not: Optimum Sonication örnek hacmi için, Sonikasyon gerekmez daha genç 17 saat embriyolar, ancak bu saat 17 ila 24 (/ 17 aşama, erken-L1) iki sonikasyon gerektirir. Larva arası 24-36 (erken / orta-L1), 36-48, (orta /-L1 geç) 48 - 60 (erken / orta-L2), 60-72 (orta / geç-L2), 72-84 ( )-L3 erken, 84-96 (erken / orta-L3), 96-108 (orta / geç-L3) hr gerektiren 5, 9, 11, 13, sırasıyla 15, 18 ve 22 sonikasyon. Sonication kez daha hazırlanması için tartışma bakın.
6. BBTw iki kez 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile BBTw kapalı çizim önce yerleşmek için izin.
7. Flakon ve kaya BBTw 1.0 ml ekleyin. Rocker 3 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için izin verir.
8. Tekrarlayın Adım 4.7 iki kez.

5. immün

1. Mikrosantrifüj tüpüne BBTw içinde seyreltilmiş,% 5, normal serumu ilave ederek örnek bloke eder. 1 saat boyunca sallanan sonra bloğunu çıkarın.
   Not: İkincil antikorlar uretıldığı türleri normal serum kullanın.
2. % 5 normal serumu / BBTw konsantrasyonu çözelti içinde çalışan mülk birincil antikorlar seyreltilir.
3. 4 ° C'de ya da (yaklaşık 22 ° C oda sıcaklığında en azından 3 saat için primer antikor çözeltisi O kaya örnek / K.
   Not: Antikor inkübasyon süreleri ve sıcaklıklar değişebilir. O / N, oda sıcaklığında, 4 ° C'de inkübasyon ya da 3 saat tipik olarak yeterlidir. Bununla birlikte, iki günlük bir inkübasyon süresi, daha eski numune ya da düşük affiniteli primer antikorlar ile kullanıldığında, boyama kalitesini artırabilir. Daha uzun bekletme tipik olarak 4 ° C'de gerçekleştirilir. Sekonder antikor (5.10) kullanıldığında benzer sonuçlar elde edilmektedir gerekir.
4. Örnek yerleşmek için izin vermikrofüj tüpün alt. Pipet ile primer antikorlar kapalı çizin. Arzu edildiği takdirde yeniden kullanım için antikorlar kaydedin.
5. Iki BBTw 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile BBTw kapalı çizim önce yerleşmek için izin.
6. Flakon ve kaya BBTw 1.0 ml ekleyin. Rocker 3 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için izin verir.
7. Tekrarlayın Adım 5.6 beş kez.
8. Mikrosantrifüj tüpüne% 5 normal serumu / BBTw çözeltisi eklenerek Blok örneği. 1 saat 30 dakika boyunca sallanan sonra blok çıkarın.
   Bu ilave bir bloke etme adım gerekli değildir, ancak özel antikorlar için boyama kalitesini iyileştirebilir: edin.
9. % 5 normal serumu / BBTw konsantrasyonu çözelti içinde çalışan mülk sekonder antikorlar seyreltilir.
10. Işığa maruz kalma nedeniyle solmasını azaltmak için bir alüminyum folyo içinde mikrosantrifüj tüpü sarın. 4 ° C'de 12 saat 48 için ikincil bir antikor ya da çözelti içinde, oda sıcaklığında (yaklaşık 22 ° C'de en az 3 saat boyunca Kaya örneği.
11. Örnek mikrofuge'de tüpünün dibine yerleşmek için izin ver. Pipet ile ikincil antikorlar kapalı çizin.
12. Iki PBTw 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile PBTw kapalı çizmeden önce yerleşmek için izin.
13. Flakon ve kaya PBTw 1.0 ml ekleyin. Kızağa üzerinde 5 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile PBTw kaldırmaktır.
14. Tekrarlayın Adım 5.13 üç kez.
15. İSTEĞE BAĞLI: 1,000 PBTw in: DAPI 1 seyreltilmiş ekleyin. Kaya örnek 3 dakika için alüminyum folyoya sarılmıştır; daha sonra bir pipet ile DAPI çözeltisi çıkarın. Örnek pipetle PBTw çıkarmadan önce çökmesine izin verdikten, PBTw 1.0 ml ile beş kez çalkalayın.
16. -20 ° C'de mikrosantrifüj tüpüne ve saklamak için 1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktan (DABCO) çözeltisi 100 ul - 80 ekleyin.
    Not: Başka bir gliserol tabanlı bir anti-solmaya madde için ikame edilebilir.

6. Analiz

1. DABKO / p-phen 10 ul - slaytlar üzerine numuneyi monte etmeden önce, ekstra 5 ekleylenediamine (PPD) mikrosantrifüj tüpüne antifade çözüm.
   Not: Örnek diseksiyonu olmadan slaytlar eklenebilir. Bir slayta eklenen Numune hacmi kapak kayma boyutuna göre değişir. Slayt üzerine örnek pipetlerken, pipet ucu numune kesme önlemek için bir jilet kullanarak kesilebilir. Bu kolay analiz için satırları örnek sıraya genellikle faydalıdır. Ilave madde olarak antifade DSD eklenmesi gerekli olmayabilir, ancak örnekler uzun süreli saklandığı takdirde, ışıkla önleyebilir.
2. Yavaşça numune üzerinde cam kapak kayma yerleştirin. Sonra, yerde güvenli kapak kayma oje kullanarak.
3. Görünüm floresan mikroskopi kullanılarak örnek monte edilmiş.

Sonuçlar

Geç evre embriyonik ve larva in situ dokularının analizi içinde sonikasyon bazlı imüno etkinliğini göstermek için, vahşi tip embriyoları ve larva testis, yumurtalık immün ve nöral doku için işlenmiştir. Numuneler konfokal mikroskobu ile görüntülendi ve temsili sonuçları (Şekil 1 ve Şekil 2) gösterilmiştir. Sonuçlar tarif edilen protokol Drosophila gelişiminin geç embriyonik erken aracılığıyla / orta L3 aşamalarında morfolojik özellik...

Tartışmalar

Bu protokol, böylece başarılı bir diseksiyon için olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, in situ Drosophila embriyonik ve larva hedef dokulara immunostain için bir yöntem sağlar. Erken embriyolar ^1,2,3 boyanması için önce protokoller gereğince, koryonik membran% 50 çamaşır suyu (NaOCl) kullanılarak kaldırılır. Numuneler formaldehit ve metanol giderilmiştir. Larva kütikül yüzer eski numune neden olduğu için, bütün numune daha sonra larva tutulmasını sağlamak için bir hücre...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)			For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)			For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10%			For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS			0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes			For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde			37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane		CAS 142-82-5	n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol		CAS 67-56-1	Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10%			For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)			To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS)	ackson ImmunoResearch Laboratories	005-000-121	To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)		CAS: 281-57-9	To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution			1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates			To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10%			To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste			~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI	Invitrogen	D3571	1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa			1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7G10	1:10
Mouse anti-1B1	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1	1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam			1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	Prospero MR1A	1:10
Rat anti-Elav	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	7EBA10	1:30
mouse anti-Repo	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	8D12	1:10
Goat anti-rabbit Alexa546	Invitrogen	A11010	1:500
Goat anti-mouse Alexa488	Invitrogen	A11029	1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633	Invitrogen	A21105	1:500
Goat anti-rat Alexa488	Invitrogen	A11006	1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages	Hand-made; Genesee Scientific Corporation	Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101	Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier	Branson	Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe	Branson	Model #: 102C (CE)	EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter	Nalgene	190-25-20	0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software	Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.		Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit	Nalgene	450-0020	0.2 μm cellulose nitrate membrane filter