التحليل الآلي من ديناميك كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; إشارات في تسلسلات الصور

Summary

هنا يتجلى منطقة جديدة من بروتوكول تحليل الفائدة على أساس الفرز الحذف أفضل تناسب المخصصة لمناطق إشارة إيجابية خلال فترة زمنية ثنائي الأبعاد تسلسلات الصور الفاصل. هذه الخوارزمية قد تمكن المحققون على تحليل شامل الفسيولوجية كا ^{2 +} إشارات مع الحد الأدنى من إدخال المستخدم والتحيز.

Abstract

يتم دراسة الخلايا كا ^{2 +} إشارات عادة مع الأصباغ الفلورية كا ^{2 +} المؤشر وتقنيات الفحص المجهري. ومع ذلك، والتحليل الكمي من كا ^{2 +} بيانات التصوير هو مضيعة للوقت وتخضع للانحياز. وقد تم تنفيذ الآلية خوارزميات تحليل الإشارات يعتمد على المنطقة ذات الاهتمام (ROI) الكشف عن قياسات سطر واحد الابعاد المسح الضوئي، ولكن ليس هناك خوارزمية الحالي الذي يجمع بين تحديد الأمثل وتحليل رويس في تسلسلات الصور ثنائية الأبعاد. هنا يتم وصف خوارزمية لسرعة اقتناء وتحليل رويس في تسلسلات الصور. فإنه يستخدم الحذف يصلح لإشارات الضجيج تصفيتها من أجل تحديد العائد على الاستثمار الأمثل التنسيب، ويحسب كا ^{2 +} المعلمات إشارة من السعة والمدة وانتشار المكاني. تم تنفيذ هذه الخوارزمية باعتباره المساعد متاحة بحرية لليماغيج (NIH) والبرمجيات. جنبا إلى جنب مع البرامج النصية تحليل مكتوب لمفتوحة المصدر برامج معالجة الإحصائية R،ويوفر هذا النهج خط أنابيب ذات قدرة عالية لأداء التحليل الإحصائي السريع للناتج التجريبية. كما يقترح الباحثون أن استخدام هذا البروتوكول التحليل سوف يؤدي إلى توصيف أكثر اكتمالا وغير منحازة من الفسيولوجية كا ^{2 +} إشارات.

Introduction

كا ^{2 +} هو رسول الثاني في كل مكان مما يشير جزيء وعصاري خلوي كا ^{2 +} وينظم مستويات عالية. الكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +} إشارات معقدة وتشمل العابرين معزولة، التذبذبات، ونشر موجات ^1-4. ويعتقد أن السيطرة المكانية والزمانية من كا ^{2 +} لخصوصية تكمن وراء الفسيولوجية إشارة، وبالتالي فإن تحليل كا ^{2 +} أنماط إشارة هو من مصلحة كبيرة للمحققين في حقول متعددة ^5.

الأصباغ كا ^{2 +} المؤشر مثل فلوو-4-2 FURA وتستخدم عادة لقياس الكالسيوم داخل الخلايا ^{2 +} إشارات مع مضان المجهري ^5-12. عادة، يتم تقييم الزمانية كا ^{2 +} إشارات عن التغيرات التي تعتمد على الوقت في متوسط ​​مضان داخل منطقة المعرفة من قبل المستخدم، أو المنطقة ذات الاهتمام (ROI) ^{5،6،13 - 16.} حاليا، وتحليل العائد على الاستثمار دليل على حد سواء مضيعة للوقت والعمل فيتوتري لأنه يتطلب من المستخدمين لتحديد العديد من رويس وأداء العمليات الحسابية المتكررة ^17-19. قد تكون هذه التقنيات أيضا عرضة للخطأ المستخدم كبيرة، بما في ذلك إدخال وسائط إشارة مصطنعة والاستبعاد من انخفاض السعة أو إشارات منتشر ^18،20.

وقد سبق أن نفذت خوارزميات الكشف الآلي العائد على الاستثمار باستخدام مجموعة متنوعة من النهج الإحصائية لتحديد العائد على الاستثمار الأمثل التنسيب، لكنها عموما اقتصرت على تحليل مسح سطر أو الزائفة خط مسح الصور، مما يحد من التحليل إلى البعد المكاني واحدة في الوقت المناسب ^{17، 19-22.} بالإضافة إلى ذلك، العديد من الخوارزميات الموجودة ليست كافية لتشمل تنوع كا ^{2 +} الأحداث الإفراج التي تتراوح من الدوري، العابرين المترجمة إلى نشر موجات ^23،24. وغالبا ما تتعقد تقييم شامل للالفسيولوجية كا ^{2 +} إشارات إضافية من خلال وجود صورة كبيرة artifالتصرف الذي يفند إشارة إلى التمييز الضوضاء في كثير من النظم التجريبية.

سابقا، للكشف عن العائد على الاستثمار خوارزمية الحل الآلي لكا ^{2 +} إشارة الكشف عابرة، كما تنفذ البرنامج المساعد لبرنامج NIH يماغيج (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا، MD)، تم تطويره والتحقق من صحتها ^25،26. وقد تم تصميم هذه الخوارزمية، ودعا LC_Pro، لتحديد وتحليل رويس يشمل كا ^{2 +} العابرين في إشارة ثنائية الأبعاد الوقت الفاصل بين متواليات الصورة. هنا يتم توفير بروتوكول التجريبية العملية ومظاهرة ممثل تطبيق الخوارزمية في الخنازير الشريان التاجي البطانة، مع تحليل نتائج إضافية باستخدام مفتوحة المصدر برامج معالجة الإحصائية R لتوليد الناتج رسومية قابلة للاستخدام.

Protocol

1. تشريح السفن والتصوير

1. الحصاد الأنسجة من الخنازير الأحداث المحلية كما هو موضح في مارتنز وآخرون ^27. وضع تحصد البطينين الأيمن الخنازير في polydimethylsiloxane (PDMS) طبق تشريح الجزء السفلي تحتوي على HEPES مخزنة محلول ملحي الفسيولوجية (PSS).
   1. مع المعونة من stereomicroscope، تشريح وإزالة جزء من الأمامي الأيسر النازل الشريان التاجي (~ 8 مم طول، و 0.5 مم) من الأنسجة المحيطة باستخدام ملقط ومقص الربيع عن طريق إزالة جزء من السفينة المحيطة طبقات أنسجة القلب. ملاحظة: الحرص على عدم ثقب جدار الوعاء الدموي.
   2. وضع كتلة PDMS (1 × 0.5 × 0.5 سم) في طبق تشريح، واستخدام إبرة ليعلقون عليه إلى أسفل. قطع قطرها سلك التنغستن حوالي 40 ميكرون الى اثني عشر قطاعات ~ 0.3 سم طول، وتشكيل micropins، ووضع هذه في الطبق. باستخدام ملقط، وتأمين واحدة من نهاية الجزء السفينة إلى كتلة مع micropiن.
   3. إدراج بعناية مقص الربيع صغير في تجويف السفينة، وقطع طولي أسفل جانب واحد من السفينة لفتحه تماما. توجيه جزء السفينة فتحت مع البطانة المباراة.
   4. استخدام micropins المتبقية لتأمين حدود قطاع سفينة فتح لمنع مثل هذه أن السفينة تشكل مستطيل مسطح. ملاحظة: يجب أن تكون عازمة قمم Micropin إلى 90 درجة وإدراجها حتى الاحمرار مع سطح الكتلة. ينبغي توخي الحذر لتمتد إعداد السفينة دون إرهاق؛ عرض النهائي ينبغي ~ 1.5X عرض المتمدد البدء.
   5. إعداد وحدة تخزين صغيرة (~ 1 مل) من فلوو-4 الحل AM التحميل عن طريق خلط فلوو-4 AM (10 ميكرومتر) الذائبة في DMSO مع بلورونيك (0.03٪) في HEPES مخزنة PSS (تحتوي في ملي: 134 كلوريد الصوديوم، 6 بوكل ، 1 MgCl، 10 HEPES، 10 الجلوكوز)، وإدراج كتلة بأكملها في حل التحميل لحوالي 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
   6. بعد التحميل، وغسل كتلة في HEPES مخزنةPSS لمدة 5-10 دقيقة.
   7. جبل كتلة 50-100 ميكرون على الفواصل سميكة في غرفة أسفل ساترة تحتوي على HEPES مخزنة PSS. ملاحظة: دبابيس معدنية يمكن أن تستخدم الفواصل وضمان تواجه قطاع السفينة إلى أسفل وعدم لمس الفواصل.
   8. وضع الغرفة على مرحلة مجهر مقلوب مجهزة للتصوير متحد البؤر، والتركيز على طبقة الخلايا البطانية.
   9. تسلسل التقاط صورة مرور الوقت مضان النسبي القاعدية ل~ 3 دقائق في 20X التكبير ومعدل الإطار ل~ 8 إطارات في الثانية باستخدام صورة متحد البؤر البرمجيات aquisition التسلسل.
   10. بعد ~ 3 دقائق من تسجيل مضان القاعدية، استبدال HEPES مخزنة حل PSS مع نفس الحجم (~ 1 مل) من مادة P (100 م) المذاب في HEPES مخزنة جهاز الأمن الوقائي، وسجل لالإضافيون 3 دقائق.

2. التحليل الآلي

1. تقديم تسلسل الصور (ق) من النشاط الكالسيوم الفلورسنت من برنامج الحصول متحد البؤر إلى 8 بت، زrayscale '. TIF' شكل ملفات مع عدم وجود المعلومات على نطاق و.
2. يماغيج مفتوحة، انقر فوق 'فتح' في القائمة ملف، وحدد تسلسل الصور المناسبة في نافذة المستكشف لعرض تسلسل الصور (ق) في ImageJ.
3. تحديد العائد على الاستثمار يبلغ قطرها المناسب باستخدام أداة مستطيلة العائد على الاستثمار لتقدير حدود العلوي والسفلي من انتشار المكاني للنشاط ضمن تسلسل الصور (ق). ملاحظة: قطر مستطيل متوسط ​​هو اختيار مناسب لقطر العائد على الاستثمار.
4. إنشاء مجلد جديد على القرص الصلب لجهاز الكمبيوتر، وإضافة تسلسل الصور (ق) إلى الدليل المجلد.
5. في ImageJ، انقر فوق نافذة 'الإضافات'، ثم انقر 'LC_Pro' لبدء التحليل.
6. أدخل القيمة قطر العائد على الاستثمار وتحديد قيمة العتبة تصفية (إما 0.05 أو 0.01).
7. انقر على 'العلاج من تعاطي المخدرات' مربع الاختيار وأدخل القيم نقطة زمنية على الفور قبل وبعد وأضيف المخدرات (بالثواني).
8. انقر 'موافق'، وأدخل الدليل تسلسل الصور في إطار ملف اكسبلورر.

3. إخراج الرسومية

1. تحميل النسخة 3.0.2 من R http://www.r-project.org/ .
2. فتح إصدار 32 بت من ر.
3. انقر على زر "ملف"، ثم "النصي فتح 'وحدد' traceplot.R 'R النصي لتوليد التقارير الرسومية التجريبية.
4. تثبيت معايرة، وgplots الحزم عن طريق تحديد "حزم"، "تثبيت حزم"، واختيار حزم appropirate.
5. انقر 'ملف'، ثم 'تغيير الدليل' الأوامر، واستخدام نافذة المستكشف لتحديد الدليل الذي يتوافق مع الإخراج تحليل LC_Pro.
6. انقر على إطار البرنامج النصي ثم 'تشغيل جميع' الأوامر لتشغيل البرنامج النصي.

النتائج

خوارزمية مخصصة، LC_Pro، تم وضعها وتنفيذها من أجل إجراء تحليل الآلي للكا ^{2 +} ديناميات على تسلسلات الصور متحد البؤر. كما هو مبين في الشكل 1، ويستخدم خوارزمية وحدات معالجة متتابعة أن A) كشف وتعقب المواقع الديناميكية كا ^{2 +} تغيير أعلاه إحصائية (ع <0.01) الضو?...

Discussion

سوف فك معقدة كا ^{2 +} إشارات على المستوى الخلوي وتتطلب نهجا متعددة الخلايا التجريبية والتحليلية الصارمة. هنا، يوصف هذا النهج في الوقت الذي تتعرض حل تسلسلات الصور متحد البؤر كا ^{2 +} مضان تعتمد على تحليل الآلية التي تحدد والكمي كا ^{2 +} إشارات ذات الصلة إحصائي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
Stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
Forceps	Fine Science Tools	#11223-20
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
Metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
Cover-glass bottom chamber			Custom designed
Spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing