Analisi automatizzata del Dynamic Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in sequenze di immagini

Riepilogo

Qui una regione romanzo di interesse protocollo di analisi basato su ordinamento ellissi best-fit assegnati a regioni di segnale positivo nel tempo bidimensionale sequenze di immagini decadenza è dimostrata. Questo algoritmo può consentire ai ricercatori di analizzare globalmente segnali fisiologici Ca ^{2 +} con l'input minimo da parte dell'utente e pregiudizi.

Abstract

Intracellulare di Ca ^{2 +} segnali sono comunemente studiate con coloranti fluorescenti Ca ^{2 +} indicatore e le tecniche di microscopia. Tuttavia, l'analisi quantitativa di Ca ^{2 +} dati di imaging è in termini di tempo e soggetto a bias. Automatizzati algoritmi di analisi del segnale in base alla regione di interesse (ROI) rilevazione sono state implementate per scansione misurazioni linea unidimensionale, ma non esiste alcun algoritmo corrente che integra identificazione ottimizzata e analisi di ROI in sequenze di immagini bidimensionali. Qui un algoritmo per acquisizione rapida e analisi di ROI in sequenze di immagini è descritto. Utilizza ellissi adattano ai segnali filtrati rumore per determinare il posizionamento ottimale ROI, e calcola i parametri del segnale Ca ^{2 +} di ampiezza, durata e distribuzione spaziale. Questo algoritmo è stato implementato come plugin liberamente disponibile per ImageJ (NIH) software. Insieme con gli script di analisi scritti per l'open source software di elaborazione statistica R,questo approccio fornisce una pipeline ad alta capacità per l'esecuzione di analisi statistiche rapida della produzione sperimentale. Gli autori suggeriscono che l'uso di questo protocollo di analisi porterà ad una caratterizzazione più completa e imparziale di fisiologica Ca ^{2 +} segnalazione.

Introduzione

Ca ^{2 +} è un secondo messaggero onnipresente molecola di segnalazione e Ca ^{2 +} citosolico livelli sono altamente regolamentati. Intracellulare di Ca ^{2 +} segnali sono complesse e includono transitori isolate, oscillazioni e moltiplicazione onde ^1-4. Controllo spaziale e temporale di Ca ^{2 +} è pensato per essere alla base fisiologica specificità del segnale, e quindi l'analisi di Ca ^{2 +} modelli di segnale è di notevole interesse per gli investigatori in più campi ^5.

Coloranti Ca ^{2 +} indicatore come Fluo-4 e Fura-2 sono comunemente impiegati per misurare ^{Ca2 +} intracellulare segnali con fluorescenza microscopia ^5-12. Tipicamente, temporali Ca ^{2 +} segnali vengono valutati come cambia il tempo-dipendenti medio di fluorescenza all'interno di un'area definita dall'utente, o regione di interesse (ROI) ^{5,6,13 - 16.} Attualmente, analisi del ROI manuale sia in termini di tempo e di lavoro intensiva perché richiede agli utenti di identificare molti ROI ed eseguire calcoli ripetitivi ^{17 - 19.} Queste tecniche possono essere soggette a notevoli errori degli utenti, compresa l'introduzione di modalità di segnali artificiali e l'esclusione di segnali diffusi ^18,20 bassa ampiezza o.

Algoritmi di rilevamento ROI automatizzati sono stati precedentemente implementato utilizzando una varietà di approcci statistici per determinare il posizionamento ottimale ROI, ma sono stati generalmente limitata all'analisi della scansione linea o pseudo-line immagini di scansione, che limita l'analisi ad una sola dimensione spaziale nel tempo ^{17, 19-22.} Inoltre, molti algoritmi esistenti non sono sufficienti per comprendere la diversità di Ca ^{2 +} eventi di rilascio che vanno da periodici, transitori localizzati di onde che si propagano ^23,24. Valutazione complessiva delle fisiologiche Ca ^{2 +} segnali è spesso ulteriormente complicata dalla presenza di una significativa artif immagineatto che confonde il segnale alla discriminazione rumore in molti sistemi sperimentali.

In precedenza, una soluzione algoritmo di rilevamento ROI automatizzato per Ca ^{2 +} segnale di rilevamento transitorio, implementato come plugin per il software NIH ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), è stato sviluppato e convalidato ^25,26. Questo algoritmo, chiamato LC_Pro, è stato progettato per identificare e analizzare ROI comprende Ca ^{2 +} transitori di segnale bidimensionali time lapse sequenze di immagini. Qui un protocollo sperimentale e dimostrazione pratica rappresentativo di una applicazione dell'algoritmo in porcino coronarico endotelio è fornito, con postprocessing aggiuntiva utilizzando l'open source software di elaborazione statistica R per generare output grafico utilizzabile.

Protocollo

1. Dissezione della nave e Imaging

1. Tessuto raccolto da suini giovanili nazionali, come descritto nella Martens et al ^27. Posizionare raccolte ventricoli destro suina in un polidimetilsilossano (PDMS) piatto dissezione fondo contenente HEPES tamponata soluzione fisiologica (PSS).
   1. Con l'ausilio di uno stereomicroscopio, sezionare e rimuovere un segmento discendente anteriore dell'arteria coronaria (~ lunghezza 8 mm, diametro 0,5 mm) dal tessuto circostante con pinze e forbici molla rimuovendo il segmento del vaso dalle circostanti strati di tessuto cardiaco. NOTA: Fare attenzione a non forare la parete del serbatoio.
   2. Collocare un blocco PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) nel piatto dissezione, e utilizzare un ago al pin al fondo. Tagliare un filo di tungsteno di circa 40 micron di diametro in dodici ~ segmenti di lunghezza 0,3 centimetri, formando micropins, e inserire questi nel piatto. Utilizzando pinze, fissare una estremità del segmento del vaso al blocco con un MICROPIn.
   3. Inserire con cautela piccole forbici primavera nel lume del vaso, e tagliare longitudinalmente su un lato della nave per aprirlo completamente. Orientare il segmento di vaso aperto con l'endotelio alto.
   4. Utilizzare i restanti micropins per fissare i confini del segmento del vaso aperto per bloccare tale che la nave si forma un rettangolo piatto. NOTA: piani MicroPin devono essere piegate a 90 ° e inseriti a filo con la superficie del blocco. Si deve prestare attenzione per allungare la preparazione natante senza pressioni eccessive; larghezza finale dovrebbe essere ~ 1.5X la larghezza di partenza non deformato.
   5. Preparare un piccolo volume (~ 1 ml) di Fluo-4 soluzione AM loading mescolando Fluo-4 AM (10 mM) disciolto in DMSO con Pluronic (0,03%) in un tamponata con HEPES PSS (contenente in mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10, 10 HEPES glucosio), e inserire l'intero blocco nella soluzione di carico per circa 40 minuti a temperatura ambiente al buio.
   6. Dopo il caricamento, lavare il blocco in HEPES bufferizzatiPSS per 5-10 min.
   7. Montare il blocco sul 50-100 micron distanziali di spessore in una camera inferiore coprioggetti contenente HEPES tamponata PSS. NOTA: perni metallici possono essere usati come distanziatori e garantiscono il segmento del vaso è rivolta verso il basso e non toccare i distanziali.
   8. Posizionare la camera sul palcoscenico di un microscopio invertito attrezzato per l'imaging confocale, e concentrarsi sul livello delle cellule endoteliali.
   9. Sequenze di immagini lasso di tempo la cattura di basale fluorescenza relativa per ~ 3 min a 20X di ingrandimento e un frame rate di ~ 8 fotogrammi al secondo con immagine confocale software sequenza di acquisizione.
   10. Dopo circa 3 minuti di registrazione fluorescenza basale, sostituire HEPES soluzione tamponata PSS con lo stesso volume (~ 1 ml) di sostanza P (100 pM) disciolto in tampone HEPES PSS, e record per un supplementare 3 min.

2. Analisi automatizzata

1. Render sequenza di immagini (s) di attività del calcio fluorescente da software di acquisizione confocale come 8 bit, g'. tif' files rayscale formato senza informazioni di scala.
2. Aperto ImageJ, clicca su 'aperto' nel menu File, e selezionare la sequenza di immagini appropriato nella finestra di Explorer per visualizzare la sequenza di immagini (s) in ImageJ.
3. Determinare un diametro ROI appropriato utilizzando lo strumento ROI rettangolare per stimare i limiti superiori e inferiori della distribuzione spaziale di attività all'interno della sequenza di immagini (s). NOTA: Il diametro rettangolare media è una scelta adatta per diametro ROI.
4. Creare una nuova cartella sul disco rigido del computer, e aggiungere la sequenza di immagini (s) nella directory della cartella.
5. In ImageJ, fare clic su finestra "plugins", quindi fare clic su 'LC_Pro' per avviare l'analisi.
6. Inserire il valore del diametro ROI e selezionare il valore di soglia del filtro (sia 0.05 o 0.01).
7. Fare clic sulla casella di controllo 'di trattamento della droga' e inserire i valori del punto di tempo immediatamente prima e dopo l'aggiunta del farmaco (in secondi).
8. Fare clic su 'ok', einserire la directory sequenza di immagini nella finestra di file explorer.

3. Uscita grafica

1. Scarica R versione 3.0.2 da http://www.r-project.org/ .
2. Aprire la versione a 32 bit di R.
3. Fare clic su "file", quindi 'script open' e selezionare script 'traceplot.R' R per la generazione di report grafici sperimentali.
4. Installare la calibrazione, e gplots pacchetti tramite la scelta "pacchetti", 'installare i pacchetti ", e selezionando i pacchetti giustificativo utile.
5. Fare clic su 'file', poi 'change directory' comando, e utilizzare la finestra di esplorazione per selezionare la directory che corrisponde all'uscita analisi LC_Pro.
6. Cliccate sulla finestra dello script e poi il 'eseguire tutti' comando per eseguire lo script.

Risultati

Un algoritmo personalizzato, LC_Pro, è stato sviluppato e realizzato al fine di effettuare l'analisi automatizzata di Ca ^{2 +} dinamiche su sequenze di immagini confocale. Come illustrato nella figura 1, l'algoritmo utilizza moduli di elaborazione sequenziale a) individuare e siti di traiettoria dinamica Ca ^{2 +} cambiare sopra statistico (p <0.01) rumore, B) definire le regioni di interesse (ROI) automaticamente ai centri sito attivo, e C) il calcolo dell'intensità me...

Discussione

Decodifica complessi Ca ^{2 +} segnali a livello cellulare e multicellulare richiederà approcci sperimentali e analitici rigorosi. Qui, un approccio è descritto in cui il tempo risolti sequenze di immagini confocale di Ca ^{2 +} fluorescenza dipendenti sono sottoposti ad una analisi automatizzata che identifica e quantifica statisticamente rilevanti Ca ^{2 +} segnali all'interno di campi di cellulari intatti nel caso specifico presentato, un segmento di arteria è stata isolata dal cuore di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
Stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
Forceps	Fine Science Tools	#11223-20
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
Metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
Cover-glass bottom chamber			Custom designed
Spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing