Automated Análise de Ca dinâmico<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais em seqüências de imagens

Resumo

Aqui um romance região do protocolo de análise de juros com base na classificação elipses melhor ajuste atribuídos a regiões de sinal positivo dentro de sequências de imagens de lapso de tempo bidimensional é demonstrada. Este algoritmo pode permitir que os investigadores a analisar exaustivamente sinais fisiológicos Ca ^{+ 2} com entrada mínima do usuário e preconceito.

Resumo

Ca ^{2 +} intracelular sinais são vulgarmente estudada com corantes de Ca ^{2 +} indicadoras fluorescentes e as técnicas de microscopia. No entanto, a análise quantitativa de Ca ^{2 +} dados de imagem é demorado e sujeito a viés. Algoritmos de análise de sinal automatizado baseado na região de interesse (ROI) de detecção têm sido implementadas para medições de varredura de linha unidimensional, mas não há nenhum algoritmo atual que integra a identificação otimizado e análise de ROI em sequências de imagens bidimensionais. Aqui um algoritmo para rápida aquisição e análise de ROI em sequências de imagens é descrito. Ele utiliza elipses caber aos sinais filtrados de ruído, a fim de determinar a colocação ROI ideal, e calcula Ca ^{2 +} parâmetros do sinal de amplitude, duração e distribuição espacial. Este algoritmo foi implementado como um plug-in gratuito para software ImageJ (NIH). Juntamente com os scripts de análise escritos para o open source software de processamento estatístico R,Esta abordagem proporciona um gasoduto de alta capacidade para a realização de análise estatística rápida da produção experimental. Os autores sugerem que o uso deste protocolo de análise levará a uma caracterização mais completa e imparcial do fisiológica Ca ^{2 +} de sinalização.

Introdução

Ca ^{2 +} é um segundo mensageiro ubíquo molécula sinalizadora e citosólicas de ^{Ca2 +} níveis são altamente regulamentados. Ca ^{2 +} intracelular sinais são complexas e incluem transientes isoladas, oscilações, e as ondas de propagação ^1-4. Controle espacial e temporal da Ca ^{2 +} é pensado para ser a base especificidade sinal fisiológico e, portanto, a análise de Ca ^{2 +} padrões de sinal é de considerável interesse para os investigadores em vários campos ^5.

Corantes de Ca ^{2 +,} como indicador de Fluo-4 e de Fura-2 são normalmente utilizados para medir intracelulares de Ca ^{2 +} sinais com microscopia de fluorescência ^5-12. Normalmente, os temporais Ca ^{2 +} sinais são avaliados como alterações dependentes do tempo em média de fluorescência dentro de uma área definida pelo usuário, ou região de interesse (ROI) ^{5,6,13 - 16.} Atualmente, a análise de ROI manual é tanto demorado e trabalho emintensiva, porque requer que os usuários identifiquem muitos ROIs e realizar cálculos repetitivos ^{17 - 19.} Essas técnicas também podem ser sujeitos a considerável erro do usuário, incluindo a introdução de modos de sinal artificiais e exclusão de baixa amplitude ou sinais difusos ^18,20.

Algoritmos automatizados de detecção de ROI previamente implementada utilizando uma variedade de métodos estatísticos para determinar a colocação óptima de ROI, mas eles têm sido geralmente limitados à análise de varrimento de linha ou pseudo linha de imagens digitalizadas, que limita a análise a um único dimensão espacial no tempo ^{17, 19-22.} Além disso, muitos algoritmos existentes não são suficientes para abranger a diversidade de Ca ^{2 +} eventos de liberação, que vão desde, transientes localizadas periódicas às ondas que se propagam ^23,24. Avaliação abrangente dos fisiológicos de Ca ^{2 +} sinais muitas vezes é ainda mais complicada pela presença de Artif imagem significativaagir que confunde sinal de discriminação de ruído em muitos sistemas experimentais.

Anteriormente, um algoritmo de detecção de solução automatizada ROI para Ca ^{2 +} sinal de detecção transitória, implementado como um plugin para o software ImageJ NIH (National Institutes of Health, Bethesda, MD), foi desenvolvido e validado ^25,26. Este algoritmo, chamado LC_Pro, foi projetado para identificar e analisar ROIs abrangendo Ca ^{2 +} transientes de sinal em sequências de imagens de lapso de tempo bidimensionais. Aqui um protocolo experimental e demonstração prática representante de uma aplicação do algoritmo no endotélio das artérias coronárias de suínos é fornecido, com pós-processamento adicional, usando o open source software de processamento estatístico R para gerar a saída gráfica utilizável.

Protocolo

1. Dissection Vessel and Imaging

1. Tecido Colheita de suínos juvenis domésticos, conforme descrito no Martens et al ^27. Coloque ventrículos direito suínos colhidas em um polidimetilsiloxano (PDMS) prato dissecção inferior contendo tampão HEPES solução salina fisiológica (PSS).
   1. Com o auxílio de um microscópio estereoscópico, dissecar e remover um segmento da artéria coronária descendente anterior da artéria coronária (~ 8 milímetros de comprimento, 0,5 mm de diâmetro) de tecido circundante, utilizando um fórceps e tesouras mola através da remoção do segmento de vaso a partir das camadas de tecido cardíaco circundantes. NOTA: Tome cuidado para não perfurar a parede do vaso.
   2. Coloque um bloco PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) para o prato de dissecação, e usar uma agulha para fixá-lo para o fundo. Cortar um diâmetro de fio de tungstênio, aproximadamente, 40 mM em doze segmentos de comprimento ~ 0,3 centímetros, formando micropins, e colocá-las no prato. Usando fórceps, fixar uma extremidade do segmento do vaso para o bloco com uma micropin.
   3. Insira com cuidado tesoura pequena mola no lúmen do vaso e cortar longitudinalmente de um lado do navio para abri-lo completamente. Oriente o segmento navio abriu com o endotélio para cima.
   4. Use as micropins restantes para proteger as fronteiras do segmento de vaso aberto para bloquear tais que a embarcação forma um retângulo plano. NOTA: topos Micropin devem ser dobrados a 90 º e inserido até nivelada com a superfície do bloco. Cuidados devem ser tomados para esticar a preparação navio sem hostes; largura final deve ser ~ 1,5 x a largura não esticada partida.
   5. Prepara-se uma pequena quantidade (~ 1 ml) da solução de Fluo-4 AM carregamento por mistura de Fluo-4 AM (10 fiM) dissolvido em DMSO com plurico (0,03%) em um tampão HEPES PSS (contendo em mM: NaCl 134, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 glucose), e inserir o bloco inteiro na solução de carga para, aproximadamente, 40 minutos à temperatura ambiente no escuro.
   6. Após carga, lava-se a blocos de tampão HEPESPSS para 5-10 min.
   7. Monte o bloco para 50-100 ^ M espaçadores de espessura em uma câmara inferior lamela contendo tampão HEPES PSS. NOTA: pinos de metal podem ser utilizados como separadores e assegurar o segmento navio está voltada para baixo e não tocar os espaçadores.
   8. Coloque a câmara no palco de um microscópio invertido equipado para imagem confocal, e concentrar-se sobre a camada de células endoteliais.
   9. Sequências de imagens de lapso de tempo de captura de fluorescência relativa basal para ~ 3 min com ampliação de 20x e uma taxa de quadros de ~ 8 frames por segundo utilizando imagem confocal software seqüência de aquisição.
   10. Após cerca de 3 minutos de gravação de fluorescência basal, substituir solução tamponada HEPES PSS com o mesmo volume (~ 1 ml) da substância P (100 pM) dissolvido em tampão HEPES PSS, e uma ficha de autopropulsão 3 min.

2. Análise automatizada

1. Renderização seqüência (s) imagem da atividade fluorescente de cálcio a partir de software de aquisição confocal como de 8 bits, grayscale '. tif' arquivos de formato sem informação de escala.
2. Abrir ImageJ, clique em 'open' no menu arquivo e selecione a imagem seqüência apropriada na janela do Explorer para exibir a seqüência (s) imagem em ImageJ.
3. Determinar um diâmetro ROI apropriado usando a ferramenta ROI rectangular para estimar os limites superiores e inferiores da distribuição espacial da actividade dentro da sequência (s) da imagem. NOTA: O diâmetro médio retangular é uma escolha adequada para diâmetro ROI.
4. Crie uma nova pasta no disco rígido do computador, e adicione a seqüência (s) imagem para o diretório da pasta.
5. No ImageJ, clique em janela 'plugins' e clique em 'LC_Pro' para iniciar a análise.
6. Digite o valor do diâmetro ROI e selecione o valor limiar de filtro (ou 0,05 ou 0,01).
7. Clique na caixa de seleção "tratamento de drogas" e insira os valores de ponto de tempo imediatamente antes e depois que a droga foi adicionado (em segundos).
8. Clique em 'ok', edigite o diretório sequência de imagens para a janela do explorador de arquivos.

3. Saída gráfica

1. Baixe a versão 3.0.2 a partir de R http://www.r-project.org/ .
2. Abra a versão de R. 32 bits
3. Clique em "Arquivo" e depois "script aberto 'e selecione o script de R' traceplot.R 'para gerar relatórios experimentais gráficas.
4. Instale a calibrar e gplots pacotes, selecionando 'pacotes', 'instalar pacotes ", e selecionando os pacotes justificativo.
5. Clique em 'arquivo', depois 'altere o diretório' comando e usar a janela do explorer para selecionar o diretório que corresponde à saída de análise LC_Pro.
6. Clique na janela de script e, em seguida, o "executar todos" comando para executar o script.

Resultados

Um algoritmo de costume, LC_Pro, foi desenvolvido e implementado, a fim de realizar a análise automatizada de Ca ^{2 +} dinâmicas em sequências de imagem confocal. Como representado na Figura 1, o algoritmo utiliza módulos de processamento sequenciais que A) detectar e locais de pista de dinâmica de Ca ^{2 +} mudar acima estatística (p <0,01) o ruído, B) definir as regiões de interesse (ROI) automaticamente em centros de sítio activo, e C) calcular intensidades médias de flu...

Discussão

Decodificando complexos Ca ^{2 +} sinais a nível celular e multicelular exigirá abordagens experimentais e analíticos rigorosos. Aqui, é descrito um método em que a sequência de tempo de imagem confocal resolvidos de Ca ^{2 +} dependente de fluorescência são submetidas a uma análise automatizado que identifica e quantifica a Ca ^{2 +} sinais estatisticamente relevantes dentro de campos celulares intactos no caso concreto apresentado, um segmento da artéria foi isolado de coração de po...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
Stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
Forceps	Fine Science Tools	#11223-20
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
Metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
Cover-glass bottom chamber			Custom designed
Spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing