Análisis automatizado de Dinámica Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en secuencias de imágenes

Resumen

Aquí una novela región de interés protocolo de análisis basado en la clasificación de las elipses de mejor ajuste asignados a las regiones de la señal positiva dentro de secuencias de imágenes lapso de tiempo de dos dimensiones se demuestra. Este algoritmo puede permitir a los investigadores a analizar exhaustivamente las señales ⁺ Ca ² fisiológicas con intervención mínima del usuario y el sesgo.

Resumen

Intracelular ^de Ca ^{2 +} señales se estudian comúnmente con colorantes fluorescentes Ca ^{2 +} indicadores y técnicas de microscopía. Sin embargo, el análisis cuantitativo de Ca ^{2 +} de datos de formación de imágenes es mucho tiempo y sujetos a sesgo. Algoritmos de análisis de señales automatizadas basadas en región de interés (ROI) de detección han sido implementados para las mediciones de barrido línea unidimensional, pero no hay ningún algoritmo actual que integra la identificación optimizado y el análisis de rendimiento de la inversión en secuencias de imágenes bidimensionales. Aquí se describe un algoritmo para la rápida adquisición y el análisis de rendimiento de la inversión en secuencias de imágenes. Utiliza elipses ajustan a las señales filtradas de ruido con el fin de determinar la colocación óptima retorno de la inversión, y calcula Ca ^{2 +} parámetros de la señal de amplitud, duración y amplitud espacial. Este algoritmo fue implementado como un plugin disponible gratuitamente para ImageJ (NIH) de software. Junto con guiones escritos para el análisis de código abierto de software de procesamiento estadístico R,este enfoque proporciona una tubería de alta capacidad para llevar a cabo el análisis estadístico rápida de la producción experimental. Los autores sugieren que el uso de este protocolo de análisis dará lugar a una caracterización más completa y no sesgada de fisiológica Ca ^{2 +} señalización.

Introducción

Ca ^{2 +} es un segundo mensajero ubicua molécula de señalización y citosólica de Ca ^{2 +} niveles están muy regulados. Intracelular ^de Ca ^{2 +} señales son complejas e incluyen transitorios aislados, oscilaciones y ondas que se propagan ^1-4. Control espacial y temporal de Ca ^{2 +} se cree que subyacen especificidad señal fisiológica, y por lo tanto el análisis de Ca ^{2 +} patrones de señales es de gran interés para los investigadores en múltiples campos ^5.

Colorantes Ca ^{2 +} indicador como Fluo-4 y Fura-2 se emplean comúnmente para medir Ca ^{2 +} señales intracelulares con microscopía de fluorescencia ^5-12. Por lo general, temporales Ca ^{2 +} señales se evalúan los cambios dependientes del tiempo en medio de fluorescencia dentro de un área definida por el usuario, o región de interés (ROI) ^{5,6,13 - 16.} Actualmente, el análisis ROI manual es a la vez tiempo y mano de obra enintensivo, ya que requiere que los usuarios identifiquen muchas regiones de interés y realizar cálculos repetitivos ^17-19. Estas técnicas también pueden estar sujetos a considerables errores de los usuarios, incluida la introducción de modos de señal artificiales y la exclusión de las señales difusas ^18,20 baja amplitud o.

Algoritmos automatizados de detección de ROI se han aplicado anteriormente usando una variedad de métodos estadísticos para determinar la colocación óptima retorno de la inversión, pero por lo general se han limitado al análisis de exploración de línea o pseudo-line imágenes de exploración, lo que restringe el análisis a una sola dimensión espacial en el tiempo ^{17, 19-22.} Además, muchos algoritmos existentes no son suficientes para abarcar la diversidad de Ca ^{2 +} de liberación eventos que van desde, transientes periódicos localizados a las ondas que se propagan a ^23,24. Evaluación integral de Ca ^{2 +} señales fisiológicas a menudo se complica aún más por la presencia de Artif imagen significativaacto que confunde señal a ruido de la discriminación en muchos sistemas experimentales.

Anteriormente, una solución algoritmo de detección de ROI automatizado para Ca ^{2 +} señal de detección de transitorios, implementado como un plug-in para el software ImageJ NIH (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD), fue desarrollado y validado ^25,26. Este algoritmo, llamado LC_Pro, fue diseñado para identificar y analizar los ROIs que abarca Ca ^{2 +} transitorios de señal en secuencias de imágenes de lapso de tiempo de dos dimensiones. Aquí se proporciona un protocolo experimental práctico y demostración representativa de una aplicación del algoritmo en el endotelio de la arteria coronaria porcina, con post-procesamiento adicional utilizando el código abierto estadística software de procesamiento de R para generar una salida gráfica utilizable.

Protocolo

1. Disección de Buques e Imagen

1. Tejido de cosecha de cerdos juveniles nacionales como se describe en Martens et al ^27. Coloque ventrículos derecho porcina cosechadas en un polidimetilsiloxano (PDMS) plato de disección de fondo que contiene tamponada con HEPES solución salina fisiológica (PSS).
   1. Con la ayuda de un estereomicroscopio, diseccionar y retirar un segmento de la arteria descendente anterior izquierda coronaria (~ 8 mm de longitud, 0,5 mm de diámetro) del tejido circundante utilizando fórceps y tijeras de primavera mediante la eliminación de la segmento de vaso de las capas de tejido cardiaco de los alrededores. NOTA: Tenga cuidado de no perforar la pared del vaso.
   2. Coloque un bloque de PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) en el plato de disección, y el uso de una aguja para fijarlo a la parte inferior. Cortar un alambre de tungsteno de aproximadamente 40 m de diámetro en doce ~ segmentos de longitud 0,3 cm, formando microalfileres, y colocarlos en el plato. Con unas pinzas, sujete un extremo del segmento del vaso al bloque con una MICROPIn.
   3. Inserte con cuidado las pequeñas tijeras de primavera en la luz del vaso, y cortar longitudinalmente en un lado de la embarcación para abrirlo por completo. Oriente el segmento de vaso abierto con el endotelio hacia arriba.
   4. Utilice los microalfileres restantes para asegurar las fronteras del segmento de vaso abierto para bloquear de manera que el recipiente forma un rectángulo plano. NOTA: Micropin tapas deben estar dobladas a 90 ° y se insertan hasta que quede nivelado con la superficie del bloque. Se debe tener cuidado para estirar la preparación buque sin estirar demasiado; anchura final debe ser ~ 1,5 x el ancho de partida sin estirar.
   5. Preparar un volumen pequeño (~ 1 ml) de Fluo-4 AM solución de carga mediante la mezcla de Fluo-4 a.m. (10 mM) disuelto en DMSO con plurónico (0,03%) en un tamponada con HEPES PSS (que contiene en mM: 134 NaCl, KCl 6 , 1 de MgCl, 10 HEPES, 10 glucosa), e insertar todo el bloque en la solución de carga durante aproximadamente 40 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
   6. Después de cargar, lavar el bloque en tampón HEPESPSS durante 5-10 min.
   7. Monte el bloque a 50-100 micras espaciadores de espesor en una cámara inferior cubre objetos que contiene tamponada con HEPES PSS. NOTA: Los clavos metálicos se pueden utilizar como separadores y asegurar el segmento de vaso esté hacia abajo y no tocar los espaciadores.
   8. Coloque la cámara en el escenario de un microscopio invertido equipado para imagen confocal, y se centran en la capa de células endoteliales.
   9. Secuencias de imágenes de lapso de tiempo de captura de fluorescencia relativa basal durante ~ 3 min a 20 aumentos y una velocidad de ~ 8 fotogramas por segundo utilizando la imagen confocal software de secuencia de adquisición.
   10. Después de ~ 3 min de grabación de fluorescencia basal, reemplazar tamponada con HEPES solución de PSS con el mismo volumen (~ 1 ml) de la sustancia P (100 pM) disuelto en tampón HEPES PSS, y récord para un addtional 3 min.

2. Análisis Automatizado

1. Render secuencia (s) imagen de la actividad de calcio fluorescente del software de adquisición confocal como 8 bits, grayscale '. tif' archivos de formato sin información de escala.
2. Abrir ImageJ, haga clic en "abierto" en el menú archivo y seleccionar la secuencia de imágenes apropiado en la ventana del explorador para ver la secuencia (s) imagen en ImageJ.
3. Determinar un diámetro ROI apropiada mediante el uso de la herramienta de ROI rectangular para estimar los límites superior e inferior de la propagación espacial de la actividad dentro de la secuencia (s) de imagen. NOTA: El diámetro rectangular media es una buena opción para diámetro ROI.
4. Cree una nueva carpeta en el disco duro del ordenador, y agregar la secuencia (s) imagen en el directorio de la carpeta.
5. En ImageJ, haga clic en la ventana de 'plugins', a continuación, haga clic en 'LC_Pro' para iniciar el análisis.
6. Introduzca el valor de retorno de la inversión de diámetro y seleccione el valor umbral del filtro (ya sea 0.05 o 0.01).
7. Haga clic en la casilla de verificación 'tratamiento contra las drogas' y escriba los valores de los puntos de tiempo se añadió el fármaco inmediatamente antes y después (en segundos).
8. Haga clic en 'ok', yentrar en el directorio de secuencias de imágenes en la ventana del explorador de archivos.

3. Salida gráfica

1. Descargar R versión 3.0.2 de http://www.r-project.org/ .
2. Abra la versión de 32 bits de R.
3. Haga clic en "Archivo", luego "guión abierto 'y seleccione el script de R' traceplot.R 'para la generación de informes de experimentación gráfica.
4. Instale la calibración, y los paquetes gplots seleccionando "paquetes", "instalar paquetes", y la selección de los paquetes appropirate.
5. Haga clic en 'Archivo' y luego 'cambio de directorio "de comandos, y el uso de la ventana del explorador para seleccionar el directorio que corresponde a la salida análisis LC_Pro.
6. Haga clic en la ventana de guión y luego el 'run all' comando para ejecutar el script.

Resultados

Un algoritmo personalizado, LC_Pro, fue desarrollado e implementado con el fin de realizar el análisis automatizado de Ca ^{2 +} en la dinámica de las secuencias de imagen confocal. Como se muestra en la Figura 1, el algoritmo utiliza los módulos de procesamiento secuencial que A) detectar y yacimientos de huellas de dinámica Ca ^{2 +} cambiar encima estadística (p <0,01) el ruido, B) definir regiones de interés (ROI) de forma automática en los centros del sitio activo, y C) el...

Discusión

Descifrando complejos Ca ^{2 +} señales a nivel celular y pluricelular requerirá enfoques experimentales y analíticos rigurosos. Aquí, un enfoque se describe en el cual las secuencias de imagen confocal resueltos de Ca ^{2 +} dependientes de fluorescencia se someten a un análisis automatizado que identifica y cuantifica Ca ^{2 +} señales estadísticamente relevantes dentro de campos celulares intactas en el caso concreto que se presentan, un segmento de la arteria se aisló de corazón de c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
Stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
Forceps	Fine Science Tools	#11223-20
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
Metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
Cover-glass bottom chamber			Custom designed
Spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing