ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

Summary

הנה אזור רומן של פרוטוקול ניתוח ריבית המבוססת על מיון אליפסות מיטבית הוקצו לאזורים של אות חיובית בתוך רצפי זמן לשגות תמונה דו ממדי מודגם. אלגוריתם זה עשוי לאפשר לחוקרים לנתח באופן מקיף אותות פיסיולוגיים ⁺ Ca ² עם קלט משתמש מינימאלי ומשוא פנים.

Abstract

תאיים Ca ^{2 +} אותות נלמדים בדרך כלל עם צבעי Ca ^{2 +} חיווי ניאון ושיטות מיקרוסקופיה. עם זאת, ניתוח כמותי של Ca ^{2 +} נתוני הדמיה הוא זמן רב ובכפוף למשוא פנים. אלגוריתמי ניתוח אותות אוטומטיים המבוססים על האזור של עניין גילוי (ROI) יושמו למדידות קו סריקה חד ממדי, אבל אין שום אלגוריתם הנוכחי המשלב זיהוי מותאם וניתוח של ROIs ברצפי תמונה דו ממדיים. הנה אלגוריתם לרכישה מהירה וניתוח של ROIs ברצפי תמונה מתואר. הוא מנצל אליפסות שיתאימו לאותות מסוננים רעש על מנת לקבוע את המיקום אופטימלי את ההחזר על ההשקעה, ומחשב את פרמטרי אות ^{2 +} Ca של משרעת, משך והתפשטות במרחב. אלגוריתם זה מיושם כתוסף זמין באופן חופשי לתוכנת ImageJ (NIH). יחד עם סקריפטים ניתוח נכתבו עבור R תוכנת עיבוד הסטטיסטי הקוד הפתוח,גישה זו מספקת צינור קיבולת גבוהה לביצוע ניתוחים סטטיסטיים מהירים של תפוקה ניסיונית. המחברים מראים כי שימוש בפרוטוקול ניתוח זה יוביל לאפיון של Ca ^{2 +} איתות פיזיולוגית שלם יותר ובלתי משוחד.

Introduction

Ca ^{2 +} הוא שליח שני בכל מקום איתות מולקולה וCa ^{2 +} רמות cytosolic קבועות בתקנות. תאיים Ca ^{2 +} אותות הם מורכבים וכוללים ארעיים מבודדים, תנודות ומתפשטים גלים ^{4 - 1.} שליטה במרחב ובזמן של Ca ^{2 +} הוא חשב לבסיס סגוליות אות פיזיולוגית, ולכן הניתוח של ^{2 +} דפוסי אות Ca הוא עניין רב לחוקרים בתחומים מרובים ^5.

צבעי Ca ^{2 +} מחוון כגון Fluo-4 ופורע-2 הם בדרך כלל מועסקים על מנת למדוד ^{2 +} אותות תאיים Ca עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ^5-12. בדרך כלל, Ca ^{2 +} אותות זמן מוערכים כשינויים תלויי זמן בקרינה ממוצעת בתוך אזור המוגדר על ידי משתמש, או באזור של עניין (ROI) ^{5,6,13 - 16.} נכון לעכשיו, ניתוח ROI במדריך הוא גם זמן רב ועבודה בtensive מכיוון שהיא דורשת למשתמשים לזהות ROIs רבות ולבצע חישובים החוזרים על עצמן ^17-19. טכניקות אלו עשויות להיות כפופות גם למשתמש שגיאה ניכרת, כוללים הקדמה של מצבי אות מלאכותיים והדרה של משרעת נמוכה או אותות מפוזר ^18,20.

אלגוריתמים לזיהוי אוטומטיים את ההחזר על ההשקעה בעבר יושמו באמצעות מגוון של גישות סטטיסטיות כדי לקבוע מיקום ROI אופטימלי, אבל הם בדרך כלל היו מוגבלים לניתוח של קו סריקה או פסאודו אונליין תמונות סריקה, אשר מגבילה את הניתוח לממד מרחבי יחיד בזמן ^{17, 19-22.} בנוסף, קיימים אלגוריתמים רבים אינם מספיקים כדי להקיף את המגוון של Ca ^{2 +} אירועי שחרור אשר נעו בין ארעיים תקופתי, מקומי לגלים מתפשט ^23,24. הערכה מקיפה של ^{2 +} אותות Ca הפיסיולוגיים לעתים קרובות מסתבכת עוד יותר על ידי הנוכחות של artif תמונה המשמעותיתלפעול שמקעקעת אות לרעש באפליה רבות מערכות ניסיוניות.

בעבר, פתרון אוטומטי זיהוי ROI אלגוריתם לCa ^{2 +} אות זיהוי חולף, מיושם כתוסף לתוכנת NIH ImageJ (המכונים הלאומיים לבריאות, Bethesda, MD), פותח ומאומתים ^25,26. אלגוריתם זה, הנקרא LC_Pro, תוכנן כדי לזהות ולנתח ROIs המקיפה ארעיים ^{2 +} אות Ca ברצפי הזמן לשגות תמונה דו ממדיים. הנה פרוטוקול ניסוי מעשי והפגנת נציג יישום של האלגוריתם בהאנדותל של עורקים הכליליים חזירי מסופק, עם postprocessing נוסף באמצעות R תוכנת עיבוד הסטטיסטי בקוד הפתוח ליצירת פלט גרפי שמיש.

Protocol

1. Dissection כלי והדמיה

1. רקמת קציר מחזירים לנוער מקומיים, כמתואר במרטנס et ²⁷ אל. הנח חדרים תקין חזירים שנקטפו לpolydimethylsiloxane צלחת לנתיחה תחתונה המכילה HEPES נאגרו פתרון פיסיולוגי מלוח (PSS) (PDMS).
   1. בעזרת סטראו, לנתח ולהסיר את קטע של קדמי עורק הכלל השמאלי יורדת (אורך ~ 8 מ"מ, קוטר 0.5 מ"מ) מרקמות באמצעות מלקחיים ומספריים באביב על ידי הסרת קטע הכלי משכבות רקמת לב שמסביב. הערה: שים לב שלא לנקב את דפנות כלי הדם.
   2. מניחים בלוק PDMS (1 x 0.5 x 0.5 סנטימטר) לתוך הצלחת לנתיחה, ולהשתמש במחט להצמיד אותו לתחתית. חותכים כ 40 מיקרומטר תיל טונגסטן בקוטר לשנתי עשרה מקטעים באורך 0.3 סנטימטר ~, ויצר micropins, ולמקם את אלה בצלחת. בעזרת מלקחיים, לאבטח את הקצה אחד של מגזר הכלי לבלוק עם micropin.
   3. בזהירות להכניס מספריים באביב קטנים לתוך לומן הכלי, וחתך אורכים בצד אחד של הכלי כדי לפתוח אותו לחלוטין. לכוון את מגזר הכלי נפתח עם האנדותל למעלה.
   4. השתמש micropins שנותר כדי לאבטח את הגבולות של מגזר הכלי נפתח כדי לחסום באופן שהכלי יוצר מלבן שטוח. הערה: צריכה להיות כפופות צמרות Micropin 90 ° ונוסף עד מיושר עם משטח הבלוק. יש להקפיד למתוח את הכנת הכלי ללא מתיחת יתר; רוחב סופי צריך להיות ~ 1.5x רוחב unstretched מתחיל.
   5. הכן את הנפח קטן (~ 1 מיליליטר) של Fluo-4 פתרון טעינת PM על ידי ערבוב Fluo-4 בבוקר (10 מיקרומטר) מומסים DMSO עם (0.03%) pluronic בHEPES נאגר PSS (המכיל במ"מ: 134 NaCl, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 גלוקוז), והכנס את כל הגוש לפתרון הטעינה כ 40 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
   6. לאחר טעינה, לשטוף את הבלוק בHEPES נאגרוPSS ל5-10 דק '.
   7. הר האבן על 50-100 מפרידי עבים מיקרומטר בתא תחתון coverglass מכיל HEPES נאגרו PSS. הערה: פינים ממתכת יכולים לשמש כמפרידים ולהבטיח מגזר הכלי פונה כלפי מטה ולא נוגע במפרידים.
   8. מניחים את החדר על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה מצוידת להדמית confocal, ומתמקד בשכבת תאי האנדותל.
   9. רצפי הזמן לשגות תמונת לכידה של הקרינה היחסית הבסיסית ל~ 3 דקות בהגדלה 20X וקצב פריימים של ~ 8 פריימים לשנייה באמצעות תוכנת aquisition רצף תמונת confocal.
   10. לאחר ~ 3 דקות של הקלטת הקרינה הבזליים, להחליף HEPES נאגרו פתרון PSS עם אותו הנפח (~ 1 מיליליטר) של החומר P (100 PM) מומס בHEPES נאגרו PSS, ולהקליט עבור 3 דקות addtional.

2. ניתוח אוטומטי

1. לדקלם רצף תמונה (ים) של פעילות סיד ניאון מתוכנה רכישת confocal כ8 סיביות, גרם'. Tif' קבצי rayscale תבנית עם מידע לא בקנה מידה.
2. ImageJ הפתוח, לחץ על "פתוח" בתפריט הקובץ, ובחר את התמונה ברצף המתאים בחלון הסייר כדי להציג את התמונה ברצף (ים) בImageJ.
3. לקבוע את ההחזר על ההשקעה בקוטר מתאים על ידי שימוש בכלי ROI המלבני להעריך את הגבולות העליונים ותחתונים של הפריסה המרחבית של פעילות בתוך רצף התמונה (ים). הערה: הקוטר המלבני הממוצע הוא בחירה מתאימה לקוטר החזר על השקעה.
4. צור תיקייה חדשה בכונן הקשיח של המחשב, ולהוסיף את התמונה ברצף (ים) לתוך ספריית התיקייה.
5. בImageJ, לחץ על החלון 'התוספים', ולאחר מכן לחץ על 'LC_Pro' כדי להתחיל את הניתוח.
6. הזן את ערך קוטר החזר על ההשקעה ובחר את ערך סף מסנן (או 0.05 או 0.01).
7. לחץ על תיבת הסימון 'הטיפול תרופתי' והזן את ערכי נקודת הזמן מייד לפני ואחרי התרופה נוספת (בשניות).
8. לחץ על 'אישור', והזן את ספריית רצף התמונה לתוך חלון סייר קבצים.

3. פלט גרפי

1. הורד גרסת R 3.0.2 מhttp://www.r-project.org/.
2. פתח את גרסת 32 ביט של ר '
3. לחץ על "קובץ", ואז "תסריט פתוח 'ובחר תסריט R' traceplot.R 'להפקת דוחות ניסיוניים גרפיים.
4. התקן את הכיול, וחבילות gplots על ידי בחירה "חבילות", "התקנת חבילות", ובחירה בחבילות appropirate.
5. לחץ על 'קובץ ", ואז" מדריך שינוי "הפקודה, ולהשתמש בחלון הסייר כדי לבחור את הספרייה המתאימה לפלט ניתוח LC_Pro.
6. לחץ על חלון סקריפט ולאחר מכן "להפעיל את כל" הפקודה כדי להריץ את הסקריפט.

תוצאות

אלגוריתם מותאם אישית, LC_Pro, פותח ומיושם על מנת לבצע ניתוח אוטומטי של Ca ^{2 +} דינמיקה ברצפי תמונת confocal. כמתואר באיור 1, האלגוריתם מנצל מודולים עיבוד רציפים ש) לזהות ואתרי מסלול של Ca הדינמי ^{2 +} לשנות מעל סטטיסטי (p <0.01) רעש, B) להגדיר אזורים של עניין (ROI) באופ?...

Discussion

פענוח Ca ^{2 +} אותות מורכבים ברמה התאית ורבה תאית ידרוש גישות ניסוייות ואנליטיות קפדניים. כאן, גישה מתוארת שבזמן רצפי תמונת confocal נפתרו של Ca ^{2 +} הקרינה תלויה נתונים לניתוח אוטומטי שמזהה ומכמת Ca ^{2 +} אותות רלוונטיים מבחינה סטטיסטית בתוך שדות סלולריים ללא פגע ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
Stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
Forceps	Fine Science Tools	#11223-20
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
Metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
Cover-glass bottom chamber			Custom designed
Spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing