Автоматизированный анализ динамических Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Сигналы в последовательности изображений

Резюме

Здесь роман регион протокола анализа процентной ставки, основываясь на сортировку наилучшего соответствия эллипсы, назначенные регионах позитивный сигнал в двумерное промежуток времени последовательности изображений демонстрируется. Этот алгоритм может позволить следователям всесторонне проанализировать физиологические Ca ^{2 +} сигналы с минимальным пользовательского ввода и предвзятости.

Аннотация

Внутриклеточного Са ^{2 +} сигналы, как правило, учился с флуоресцентными красителями Са ^{2 +} индикаторов и методов микроскопии. Однако количественный анализ Ca ^{2 +} данных изображений занимает много времени и при условии смещения. Автоматизированные алгоритмы анализа сигналов, основанные на интересующей области обнаружения (ROI) были реализованы для измерений одномерной линией сканирования, но нет текущий алгоритм, который объединяет оптимизированный выявление и анализ трансформирования в двумерных последовательностей изображений. Вот алгоритм для быстрого сбора и анализа трансформирования в последовательности изображений описывается. Он использует эллипсы подходят для шума с фильтром сигналов, чтобы определить оптимальное размещение ROI, и вычисляет Ca параметры ^{2 +} сигнальные амплитуде, продолжительности и пространственного распространения. Этот алгоритм был реализован в виде свободно распространяемой плагин для ImageJ (NIH) программного обеспечения. Вместе с анализа сценариев, написанных для открытым исходным кодом статистической программного обеспечения обработки R,Такой подход обеспечивает высокую емкость трубопровода для выполнения быстрого статистического анализа экспериментальных выхода. Авторы полагают, что использование этого протокола анализа приведет к более полному и непредвзятой характеристике физиологической Ca ^{2 +-сигнализации.}

Введение

Са ^{2 +} является повсеместное вторичный мессенджер молекулу и цитозольные Ca ^{2 +} уровня сигнализации строго регулируется. Внутриклеточного Са ^{2 +} сигналы сложны и включают отдельные переходные, колебания и распространяющихся волн ^{1 - 4.} Пространственное и временное управление Ca ^{2 +,} как полагают, лежат в основе физиологического специфику сигнала, и поэтому анализ Са ^{2 +} шаблонов сигнала представляет значительный интерес для исследователей в нескольких полей ^5.

Са ^{2 +} индикатор красители, такие как Fluo-4 и Фура-2 обычно используются для измерения внутриклеточных ^{2 +} сигналы Ca с флуоресцентной микроскопии ^5-12. Как правило, временные Са ^{2 +} сигналы оцениваются как зависящих от времени изменений в средней флуоресценции в пределах определенной пользователем области или области интереса (ROI) ^{5,6,13 - 16.} В настоящее время, анализ эксплуатации КОРОЛЬ много времени и труда всоздающий напряжение, потому что это требует, чтобы пользователи определить многие трансформирования и выполнять повторяющиеся вычисления ^{17 - 19.} Эти методы также могут быть подвержены значительным ошибки пользователя, в том числе введения искусственных режимов сигнала и исключения низкой амплитуде или диффузных сигналов ^18,20.

Автоматизированные алгоритмы обнаружения ROI ранее были реализованы с использованием различных статистических подходов, чтобы определить оптимальное размещение ROI, но они, как правило, ограничен анализа строчной развертки или псевдо-линии сканирования изображений, что ограничивает анализ для одного пространственного измерения в момент ^{17, 19 - 22.} Кроме того, многие существующие алгоритмы не являются адекватными, чтобы охватить все разнообразие Ca ² событий ⁺ релиз, которые варьируются от периодических локализованных переходных к распространяющихся волн ^23,24. Комплексная оценка физиологических ^{2 +} сигналов Са часто осложняется наличием значительного искусственн изображениядействовать, что смешивает сигнал к дискриминации шума во многих экспериментальных системах.

Ранее, автоматизированная обнаружения ROI алгоритм решения к Са ^{2 +} сигнал переходный обнаружения, реализован в виде плагина для программного обеспечения NIH ImageJ (Национальные Институты Здоровья, Bethesda, MD), была разработана и утверждена ^25,26. Этот алгоритм, называемый LC_Pro, был разработан, чтобы выявить и проанализировать трансформирования охватывающие Ca ^{2 +} сигналов переходных процессов в двумерных изображений последовательностей промежуток времени. Вот практический экспериментальный протокол и представитель демонстрация применения алгоритма в свиной эндотелия коронарных артерий обеспечивается, с дополнительной постобработки с помощью с открытым исходным кодом статистического программного обеспечения для обработки R генерировать полезную графический вывод.

протокол

1. Вскрытие судно и обработка изображений

1. Урожай ткани из внутренних несовершеннолетних свиней, как описано в Мартенса и др. ^27. Поместите собранные свиного правый желудочки в полидиметилсилоксана (PDMS) нижняя рассечение блюдо с HEPES буферный физиологический раствор (PSS).
   1. С помощью стереомикроскопа, анализировать и удалить сегмент левой передней нисходящей коронарной артерии (~ длина 8 мм, диаметр 0,5 мм) от окружающей ткани с помощью щипцов и пружинные ножницы удалением сегмента сосуда от окружающих слоев сердечной ткани. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проколоть стенку сосуда.
   2. Поставьте PDMS блок (1 х 0,5 х 0,5 см) в рассечение блюдо, и использовать иглу, чтобы повесить это на дно. Вырежьте примерно 40 мкм диаметром вольфрамовой проволоки на двенадцать ~ сегменты длиной 0,3 см, образуя micropins, и разместить их в блюдо. Использование щипцов, обеспечить один конец сегмента сосуда к блоку с micropiн.
   3. Осторожно вставьте небольшие весенние ножницы в просвете сосуда, и разрезаются вдоль по одной стороне судна, чтобы открыть его полностью. Расположите открытый сегмент сосуда с эндотелия вверх.
   4. Используйте оставшиеся micropins обеспечить границы открывшемся сегмента сосуда, чтобы блокировать такие, что судно образует плоский прямоугольник. ПРИМЕЧАНИЕ: Micropin вершины должны быть согнуты на 90 ° и не вставлены заподлицо с поверхности блока. Следует проявлять осторожность, чтобы растянуть подготовку судна без перенапряжения; Окончательный ширина должна быть ~ 1.5x стартовый Unstretched ширину.
   5. Подготовка небольшого объема (~ 1 мл) Fluo-4 утра загрузки раствора путем смешивания Fluo-4 утра (10 мкм), растворенный в ДМСО с плюрониевого (0.03%) в забуференном HEPES PSS (содержащий в мМ: NaCl 134, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 глюкозы), и вставьте весь блок в загрузочный решение для примерно 40 мин при комнатной температуре в темноте.
   6. После загрузки, мыть блок, в HEPES буферныхPSS в течение 5-10 мин.
   7. Установите блок на 50-100 толстыми прокладками мкм в покровного стекла нижней камере, содержащей HEPES буферный PSS. Примечание: Металлические штифты могут быть использованы в качестве распорок и обеспечить сегмент сосуд вниз и не касаясь распорки.
   8. Наведите камеру на сцене инвертированного микроскопа, оснащенного для конфокальной микроскопии, и сосредоточиться на эндотелиальной слоя клеток.
   9. Время захвата покадровой последовательности изображений базального относительной флуоресценции для ~ 3 мин при 20-кратным увеличением и частотой кадров ~ 8 кадров в сек с использованием конфокальной изображения последовательность aquisition программного обеспечения.
   10. После ~ 3 мин записи базальной флуоресценции, заменить HEPES буферный раствор PSS с таким же объемом (~ 1 мл) вещества Р (100 мкм), растворенного в забуференном HEPES PSS и записи для ДОПОЛНИТЕЛЬНО 3 мин.

2. Автоматизированный анализ

1. Рендер последовательность (ы) изображения флуоресцентного деятельности кальция из конфокальной приобретения программного обеспечения, как 8 бит, гrayscale '. TIF' файлы формата, не имеющие масштабной информации.
2. Открыть ImageJ, нажмите «открытой» в меню файла и выберите соответствующую последовательность изображений в окне проводника, чтобы просмотреть последовательность (ы) изображения в ImageJ.
3. Определить соответствующий диаметр ROI при помощи функции прямоугольную ROI для оценки верхней и нижней границы пространственного распространения активности в последовательности (ы) изображения. ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее прямоугольная диаметр является подходящим выбором для диаметра ROI.
4. Создайте новую папку на жестком диске компьютера, а также добавить последовательность (ы) изображения в каталог папок.
5. В ImageJ, нажмите окно "плагины", затем нажмите кнопку "LC_Pro ', чтобы начать анализ.
6. Введите значение диаметра ROI и выберите пороговое фильтр значения (либо 0,05 или 0,01).
7. Нажмите кнопку "лечения от наркозависимости" флажок и введите значения момент времени непосредственно до и после был добавлен препарат (в секундах).
8. Нажмите «ОК», ивойти в каталог последовательность изображения в окно File Explorer.

3. Графический выход

1. Скачать R версию 3.0.2 с http://www.r-project.org/ .
2. Откройте 32 разрядную версию R.
3. Нажмите кнопку "Файл", затем "открытого сценария 'и выберите R сценарий в' traceplot.R 'для создания графических экспериментальные отчеты.
4. Установите калибровку и gplots пакеты для определенных "пакеты ',' установить пакеты 'и выбрав appropirate пакеты.
5. Нажмите "Файл", затем "изменить каталог 'команда, и использовать окно проводника, чтобы выбрать каталог, который соответствует выходу анализа LC_Pro.
6. Нажмите на окне сценария, а затем команду "запустить все", чтобы запустить скрипт.

Результаты

Пользовательский алгоритм, LC_Pro, была разработана и внедрена для того, чтобы выполнить автоматический анализ Са ^{2 +} динамика на конфокальной последовательностей изображений. Как показано на рисунке 1, алгоритм использует последовательные модули обработки, что) обнаружив?...

Обсуждение

Расшифровка сложных Са ^{2 +} сигналов на клеточном и многоклеточного уровне потребует строгие экспериментальные и аналитические подходы. Здесь подход описан в это время решены конфокальной изображения последовательности Ca ^{2 +} в зависимости флуоресценции подвергаются автома...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
Stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
Forceps	Fine Science Tools	#11223-20
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
Metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
Cover-glass bottom chamber			Custom designed
Spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing