JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

قمة العصبية (NC) الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSC) لديها امكانات كبيرة لنمذجة التنمية البشرية والمرض والعلاجات البديلة للخلية. هنا، والتكيف خالية من التغذية للاستخدام على نطاق واسع حاليا في المختبر يرد بروتوكول التمايز لاشتقاق خلايا NC من hPSCs.

Abstract

الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لديها امكانات كبيرة لدراسة التطور الجنيني الإنسان، لنمذجة الأمراض التي تصيب الإنسان في طبق وكمصدر للخلايا زرع للتطبيقات التجدد بعد المرض أو الحوادث. قمة (NC) الخلايا العصبية هي السلائف لمجموعة كبيرة ومتنوعة من الخلايا الجسدية للبالغين، مثل خلايا من النظام العصبي المحيطي والدبقية، الخلايا الصباغية وخلايا اللحمة المتوسطة. أنها تشكل مصدرا قيما للخلايا لدراسة جوانب التنمية الجنينية البشرية، بما في ذلك تحديد مصير الخلية والهجرة. مزيد من تمايز الخلايا الاصلية NC في أنواع الخلايا المتمايزة عضال توفر إمكانية نمذجة الأمراض التي تصيب الإنسان في المختبر، والتحقيق في آليات المرض وتوليد خلايا للطب التجديدي. تقدم هذه المقالة التكيف من المتاحة حاليا في المختبر التمايز بروتوكول لاشتقاق خلايا NC من hPSCs. هذا البروتوكول الجديد يتطلب 18 يوما من differentiation، هو، بسهولة وقابلة للتكرار للغاية بين الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية (HESC) خطوط وكذلك بفعل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) خطوط خالية من التغذية. البروتوكولات القديمة والجديدة على حد سواء تسفر عن الخلايا NC الهوية متساوية.

Introduction

وقد أظهرت الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (hiPSC) إمكانات هائلة، وخاصة للتحقيق والعلاج في المستقبل للأمراض البشرية التي لا نماذج حيوانية جيدة ولا الأنسجة الأولية المتاحة. أمثلة التطبيق للتكنولوجيا HESC / hiPSC ما يلي: يمكن أن تتولد خلايا ذات أهمية خاصة من HESC / hiPSCs الطب التجديدي في كمية غير محدودة 1. يمكن أن تنتج الخلايا من المرضى الذين يحملون مرض معين ويستخدم لإنشاء نماذج في المختبر المرض 2،3. ويمكن بعد هذه النماذج المرض استخدامها لفحص المخدرات على نطاق واسع في البحث عن مركبات الدواء الجديد 4 وكذلك اختبار الأدوية الموجودة لفعالية وسمية 5. في المختبر نماذج المرض يمكن أن تؤدي إلى التعرف على آليات المرض الرواية. لجميع تطبيقات التكنولوجيا HESC / التوجيهية من المهم للعمل مع محددة وتحديد جيداد أنواع الخلايا المتضررة في هذا المرض من الاهتمام. وبالتالي، فإن توافر في المختبر البروتوكولات تمايز صلبة وقابلة للتكرار أمر بالغ الأهمية لجميع تطبيقات التكنولوجيا HESC / hiPSC. البروتوكولات هي من المرغوب فيه أن تظهر الحد الأدنى من التقلبات، حساب الوقت والجهد، وصعوبة وتكلفة، وكذلك استنساخ القصوى بين خطوط HESC / hiPSC والباحثين مختلفة.

قمة العصبية (NC) الخلايا تظهر خلال الفقاريات تكون العصيبة بين البشرة والظهارة العصبية. أنها تتكاثر وتهاجر على نطاق واسع في جميع أنحاء الجنين النامية وتؤدي إلى تنوع هائل من أنواع الخلايا ذرية، بما في ذلك العظام / الغضروف، والهيكل العظمي القحفي والأعصاب الحسية، وخلايا شوان، الخلايا الصباغية، وخلايا العضلات الملساء، الخلايا العصبية المعوية، الخلايا العصبية اللاإرادية، والخلايا أليفة الكروم وخلايا القلب الحاجز والأسنان والكظرية / الغدة الدرقية الخلايا الغدية 6. وبالتالي، NC الخلايا هي نوع من الخلايا جذابة للحقل الخلايا الجذعية وهامة لنماذج من مجموعة متنوعة من الأمراض، مثل أمراض هيرشسبرونغ 7، 8 العائلي خلل الوظائف المستقلة، وكذلك السرطانات مثل العصبية 9. وعلاوة على ذلك، فإنها توفر إمكانية لدراسة جوانب التنمية الجنينية البشرية في المختبر.

المتاحة حاليا وتطبيقها على نطاق واسع في المختبر بروتوكول التمايز لاشتقاق خلايا NC من hESCs 10،11 يتطلب ما يصل الى 35 يوما من التمايز وأنها تنطوي على تحريض العصبية في خلايا انسجة المغذية مثل الخلايا MS5 وبالتالي تتم تحت ظروف محددة بشكل واضح. في حين أنه يمكن أن يصل تحجيم لتوليد كميات كبيرة من خلايا NC، على سبيل المثال المطلوبة للالإنتاجية العالية فحص المخدرات 4، وهذا هو العمل المكثف والتكلفة. وعلاوة على ذلك، فإنه ينطوي على الركض دليل ريدات العصبية، والتي يمكن أن يكون من الصعب استنساخها وبالتالي يخضع للتقلب بشكل عام، ولا سيما عندما يتم تطبيقه على مجموعة كبيرة ومتنوعة من HESC أو hiPSCخطوط. هنا، يظهر الاشتقاق تدريجي الخلايا NC في بروتوكول 18 يوما التي هي خالية من الخلايا المغذية. هذا الأسلوب هو أقصر وأكثر تحديدا من البروتوكول المستخدم حاليا. وعلاوة على ذلك، فمن قوي جدا في توليد خلايا NC بين خطوط hiPSC مختلفة. الأهم من ذلك، فإنه يظهر أن الخلايا NC التي حققها كلا البروتوكولين الظهور على الحدود بين ريدات العصبية (وهو ما يسمى الآخرة ريدة-NC أو R-NC). الخلايا المشتقة باستخدام أي من البروتوكولين تبدو متطابقة شكليا، فإنها تعبر عن نفسها علامات NC والكتلة معا في تحليل ميكروأري. خلايا NC المستمدة باستخدام البروتوكول الجديد (R-NC) وظيفية، مماثلة لخلايا NC المستمدة باستخدام بروتوكول القديمة (MS5-R-NC) بحيث يمكن ترحيل ومزيد من التمايز إلى خلايا عصبية. وبالتالي، فإن الخلايا يمكن استخدامها في نفس الوقت مع الخلايا MS5-R-NC. سوف بروتوكول الخلية R-NC لاشتقاق خلايا NC من HESC / التوجيهية أن تكون مفيدة لجميع تطبيقات التكنولوجيا HESC / التوجيهية التي تنطوي على نسب NC

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام، صحون المغلفة وصيانة hPSCs

إعداد 1.1 وسائل الإعلام

ملاحظة: تصفية جميع وسائل الإعلام في التعقيم وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل الى 2 أسابيع. يتم سرد أسماء كاشف والشركة وكتالوج الأرقام في جدول المواد.

  1. DMEM/10٪ FBS: الجمع بين 885 مل DMEM، و 100 مل FBS، 10 مل القلم / بكتيريا و 5 مل L-الجلوتامين.
  2. HES المتوسطة: الجمع بين 800 مل DMEM/F12، KSR 200 مل، 5 مل L-الجلوتامين، 5 مل القلم / بكتيريا، 10 مل MEM الحد الأدنى الضروري حل الأحماض الأمينية، 1 مل β-المركابتويثانول. إضافة 10 نانوغرام / مل FGF-2 بعد تصفية المتوسطة.
    تنبيه: β-المركابتويثانول هي سامة، وتجنب استنشاق، الابتلاع وملامسة الجلد.
  3. KSR-التمايز المتوسطة: الجمع بين 820 مل خروج المغلوب DMEM، 150 مل KSR، 10 مل L-الجلوتامين، 10 مل القلم / بكتيريا، 10 مل MEM الحد الأدنى الضروري حل الأحماض الأمينية و1 مل β-المركابتويثانول.
  4. N2-differentiatiعلى المتوسط: حل 12 غرام مسحوق DMEM/F12 في 980 مل O 2 درهم، إضافة الجلوكوز 1.55 ز، ز 2 بيكربونات الصوديوم و 100 ملغ APO ترانسفيرين الإنسان. خلط 2 مل درهم 2 O مع 25 ملغ الأنسولين البشري و 40 ميكرولتر 1 N هيدروكسيد الصوديوم، إضافة إلى حل المنحل المتوسط. إضافة 100 ميكرولتر هيدروكلوريد بوتريسين، 60 ميكرولتر زيلونيت، و 100 ميكرولتر البروجسترون وتبرزي حجم ما يصل الى 1 لتر مع DH 2 O.

1.2 طلاء من الأطباق الثقافة

  1. Matrigel طلاء: ذوبان 1 مل تجميد matrigel قسامة من قبل pipetting 19 مل DMEM/F12 على قسامة حتى أنه قد حلت. إزالة كتل بتمريرها من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وصفيحة 8 سم ml/10 الطبق. احتضان الأطباق لمدة 1 ساعة على RT. نضح matrigel مباشرة قبل طلاء الخلايا.
    ملاحظة: العمل بسرعة مع matrigel لأنها يمكن أن تتجمع في درجات الحرارة فوق 4 درجات مئوية.
  2. ص / لام / FN طلاء: إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 15 ميكروغرام / مل بولي L Ornithin هيدروبروميد إلى طبق 10 سم. احتضان الطبق أكثر من ليلة عند 37 درجة مئوية. غسل الأطباق مع برنامج تلفزيوني 1X مرة واحدة وإضافة 10 سم ml/10 طبق من برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 2 ميكروغرام / مل الماوس Laminin-I و 2 ميكروغرام / مل فبرونيكتين. احتضان الأطباق أكثر من ليلة عند 37 درجة مئوية. قبل طلاء الخلايا، وإزالة تماما الحل والسماح لوحات يجف تماما على RT لمدة 15-20 دقيقة من خلال الوقوف عليها حتى على زراعة الأنسجة جدار غطاء محرك السيارة من دون غطاء على.
    ملاحظة: الأطباق تجف تماما وجاهزة للطلاء الخلية عند واحد يمكن أن نرى هياكل الكريستال على السطح (مرئية بالعين). يمكن أن تظل لوحات على RT لبضع ساعات في هذه الولاية المجففة. أطباق ص / لام / FN يجب أن يكون مستعدا قبل 2 أيام من الوقت. في الحالات الطارئة يمكن المحتضنة لام / FN لمدة 2-4 ساعة فقط. ومع ذلك، وهذا قد خطر الأمثل نتائج المفاضلة / بقاء.

1.3 صيانة hPSCs

ملاحظة: يتم الاحتفاظ hPSCs على 0.1٪ الجيلاتين والفأر الجنينية الخلايا الليفية المعطل ميتوتيكلي (MEFS) في HES المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل FGF-2 كما هو موضح سابقا 10،12. ينبغي تقسيم الخلايا كل 6-8 أيام.

  1. معطف طبق 10 سم مع 8 مل 0.1٪ الجيلاتين (في برنامج تلفزيوني 1X المغنيسيوم أو الكالسيوم دون) في RT لمدة 5 دقائق.
  2. ذوبان الجليد MEFs المجمدة بسرعة في حمام مائي 37 ° C. إضافة 1000000 MEFs إلى 10 مل DMEM/10٪ FBS.
  3. نضح الجيلاتين وطبق الخلايا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 6 ساعة.
  4. نضح FBS DMEM/10٪ من لوحة MEF استعداد، وغسل لوحة مع برنامج تلفزيوني 1X مرة واحدة وإضافة 10 مل HES المتوسطة تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد. تسمح المتوسطة في عملية الاحماء عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: للحصول على تقسيم دليل hPSCs يستخدم غطاء تدفق الصفحي مع مجهر المضمنة. ومع ذلك، فإن الخلايا يمكن passaged باستخدام طرق بديلة مناسبة.
  5. تحت غطاء تدفق الصفحي مع مجهر جزءا لا يتجزأ، فصل المستعمرات منفصلة باستخدام رافعة الخلية والسماح لهم تطفو.
  6. استخدام1 مل حقنة لنضح المستعمرات العائمة وترسلهم على ودافئة لوحة MEF الطازجة. نقل حوالي ربع الخلايا إلى طبق جديد. احتضان عند 37 درجة مئوية.
  7. تغذية الخلايا اليومية مع الطازجة المتوسطة هيس.

2. تصفيح من hPSCs عن التمايز

ملاحظة: ينبغي تقسيم hPSCs أو مطلي لتمايز عندما المستعمرات هي كبيرة، ولكن لا تزال لديها حواف حادة مع أقل قدر ممكن من الخلايا التفريق في حدودها (انظر الشكل 1B). عندما تتم المحافظة على الخلايا باستخدام الركض دليل المستعمرات ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي لبسهولة أن ينظر بالعين. للحصول على المظهر المناسب لهذه النقطة مرة واحدة يمكن الحفاظ على طبق hPSC منفصلة لمدة أسبوعين دون الركض ومشاهدة الخلايا الوصول واجتياز نقطة زمنية مثالية للالركض / التفريق بينها.

  1. إعداد أطباق 10 سم مع matrigel 1 ساعة قبل بدء التمايز. نجاح طلاء matrigel يمكن أن يكونالتحقق في 4x والتكبير.
  2. عندما hPSCs جاهزة للتقسيم، ونضح المتوسط ​​وإضافة 4 مل من 0.05٪ التربسين EDTA-إلى الخلايا.
  3. يهز الطبق أفقيا لمدة 2 دقيقة بقوة حتى يمكن للمرء أن يرى MEFs كما الخلايا واحد رفع قبالة لوحة تحت المجهر. تظل المستعمرات hPSC المرفقة بوصفها مستعمرات.
  4. على الفور وبدقة، ونضح التربسين والسماح لوحة الوقوف على RT لمدة 2-4 دقيقة.
  5. إضافة 2 مل من HES المتوسطة على لوحة وباستخدام ماصة P1000، فصل الخلايا.
    ملاحظة: إذا لم يمكن رفع الخلايا من السطح بسهولة، لوحة فارغة يمكن المحتضنة في RT لمدة 2-3 دقائق أخرى.
  6. نقل الخلايا إلى 8 مل HES المتوسطة تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد.
  7. نضح matrigel من معدة مسبقا 10 سم الطبق. لوحة الخلايا في 1:1 أو 1:02 نسبة (على سبيل المثال: وتنقسم هذه الخلايا عن بعضها 10 سم الطبق الى قسمين 10 سم الأطباق) على طبق matrigel. احتضان عند 37 درجةمئوية خلال الليل.
    ملاحظة: هذا الطلاء ينبغي أن يؤدي إلى ما يقرب من 100،000 خلية / سم 2.

3. تحريض العصبية التمايز

ملاحظة: يمكن أن يبدأ التمايز (يوم 0) عندما كانت الخلايا 90-100٪ متموجة (انظر الشكل 1C)، وعادة في اليوم التالي. إذا لم يتم التوصل إلى confluency دقيقة حتى الآن، والخلايا ويمكن تغذية يومية مع HES المتوسطة حتى تكون جاهزة للتمايز. بدلا من ذلك، يمكن زيادة العدد الأولي من الخلايا مطلي.

  1. في يوم 0-3، وإطعام خلايا يوميا مع 10 سم ml/10 طبق KSR-التمايز متوسطة تحتوي على 0.1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر LDN193189 SB431542.
  2. في يوم 4 و 5 الأعلاف الخلايا مع 75٪ المتوسطة KSR-التمايز و 25٪ N2-التمايز المتوسطة على حد سواء التي تحتوي على LDN193189 وSB431542.
  3. في يوم 6 و 7 تغذية الخلايا مع 50٪ المتوسطة KSR-التمايز و 50٪ N2-التمايز المتوسطة على حد سواء التي تحتوي على LDN193189 وSB431542.
  4. في يوم 8 و 9 تغذية الخلايا مع 25٪ المتوسطة KSR-التمايز و75٪ N2-التمايز المتوسطة على حد سواء التي تحتوي على LDN193189 وSB431542.
  5. في يوم 9 و 10 إعداد أطباق ص / لام / FN كما هو مبين في 1.2.2 لreplating من الخلايا في يوم 11.
  6. في يوم 10 خلايا تغذية مع N2-التمايز المتوسطة التي تحتوي على LDN193189 وSB431542.

4. Replating في قطرات للمواصفات NC

  1. في يوم 11 نضح لام / FN من لوحات معدة مسبقا والسماح لهم يجف تماما على RT لمدة 20-30 دقيقة، كما هو موضح في 1.2.2.
  2. إزالة متوسطة من الخلايا التفريق، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 8 مل accutase/10 سم الطبق. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. باستخدام رافعة الخلية، وفصل الخلايا و resuspend لهم في accutase مع ماصة 5 مل. نقل تعليق إلى أنبوب 15 مل.
  4. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X وتدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 114 × ز.
  5. resuspend الخلايا في 10 مل 1س برنامج تلفزيوني. لضمان تعليق خلية واحدة، تصفية لهم من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو تقنية ما يعادلها.
  6. تدور أسفل الخلايا و resuspend لهم في N2-التمايز متوسطة تحتوي على 200 حمض الأسكوربيك ميكرومتر (AA)، و 20 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية، و 100 نانوغرام / مل FGF8، 20 نانوغرام / مل SHH، 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد في تركيز 100،000 -150000 cells/10 ميكرولتر.
  7. باستخدام تكرار-pipettor، لوحة 10 قطرات ميكرولتر على مقربة من بعضها البعض دون لمس منهم على PO المجففة / لام / FN 15 سم الأطباق.
    ملاحظة: واحد 10 سم طبق من الخلايا المتمايزة النتائج عادة في حوالي 2-3 مرات 15 سم الأطباق أو ما يقرب من 100 × 10 سم ميكرولتر droplets/15 الطبق.
  8. السماح للقطرات الوقوف على RT لمدة 20-30 دقيقة، ثم بعناية فائقة (عدم تعكير صفو قطرات) إضافة 30 مل من N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y واحتضان عند 37 درجة مئوية.
  9. في يوم 12، وإطعام بعناية الخلايا مع 20 سم ml/15 طبق N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
  10. من داذ 14-17 تغذية الخلايا كل يوم الثاني أو الثالث مع N2/AA/BDNF/FGF8.
  11. في يوم 16 و 17 إعداد ص / لوحات لام / FN لreplate خلايا NC بعد FACS الفرز.

5. الفرز الإسفار المنشط الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) من الخلايا NC

ملاحظة: إعداد الخلايا لنظام مراقبة الأصول الميدانية يتطلب ما يقرب من 2 ساعة.

  1. في يوم 18 إزالة المتوسطة، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X في صحن وإضافة 12 مل accutase. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  2. باستخدام رافعة الخلية، وفصل الخلايا من السطح والسماح لهم تطفو. ماصة الخلايا في التعليق باستخدام ماصة 5 مل، نقلها إلى أنبوب 50 مل و 30 مل من إضافة برنامج تلفزيوني 1X. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 114 × ز.
  3. باستخدام ماصة P1000، resuspend الخلايا في 1 مل من 2٪ FBS / HBSS (في HBSS يحتوي على 15 ملي HEPES). إضافة 19 مل من 2٪ FBS / HBSS وتحديد الخلايا خلال 40 ميكرومتر مصفاة الخلية لضمان تعليق خلية واحدة. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 15 مترفي لالأضداد الحجب وثم عد لهم باستخدام عدادة الكريات.
  4. تدور أسفل الخلايا و resuspend لهم في تركيز 10 مليون خلية / مل في 2٪ FBS / HBSS.
  5. جانبا 1000000 خلايا لكل من غير ملوثين، واحدة الملطخة (HNK-1 فقط وP75 فقط) والضد الثانوية الملون فقط (APC فقط و 488 فقط) نظام مراقبة الأصول الميدانية تسيطر عليها.
  6. إضافة 5 ميكرولتر من HNK-1 و 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية P75 لكل 10 مليون خلية في 1 مل تعليق على العينات المناسبة واحتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد.
  7. غسل الخلايا في 10 مل برنامج تلفزيوني 1X (أجهزة الطرد المركزي 5 دقائق في 114 x ج) و resuspend الخلايا في 1 مل 2٪ FBS / HBSS. إضافة 2 ميكرولتر من APC و 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية 488 لكل 10 مليون خلية في 1 مل تعليق على العينات المناسبة واحتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد في الظلام.
    ملاحظة: APC و 488 هي الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة هنا لتلطيخ HNK-1 و P75، على التوالي.
  8. غسل الخلايا في 10 مل برنامج تلفزيوني 1X مرتين، في resuspend 10 ملايين الخلايا في 500 ميكرولتر من2٪ FBS / HBSS تحتوي دابي (عند 0.5 نانوغرام / ميكرولتر) أو البديلة وصمة عار الخلية الحية المناسب استبعاد الخلايا الميتة من تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
  9. نقل العينات إلى أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية المناسبة.
  10. إعداد أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية مع 0.5 مل 2٪ FBS / HBSS لجمع الخلية.
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ الخلايا وأنابيب جمع على الجليد في الظلام خلال فترة الفرز.
  11. باستخدام آلة الفرز الخلية مع الليزر التي يمكن الكشف عن دابي، APC و 488 نوع DAPI-/HNK-1 + / + P75 خلايا إيجابية مزدوجة.
    ملاحظة: مدة التحضير والتعامل مع الخلايا يؤدي إلى نسبة صغيرة من موت الخلايا والبقع دابي الخلايا الميتة فقط وبالتالي يسمح لهذه الخلايا سيتم استبعادها من السكان فرزها. أي بديل وصمة عار العيش / القتلى يعمل بشكل جيد على قدم المساواة لهذا الغرض. دابي في حد ذاته لا يسبب سمية الخلايا في السكان الخلية الحية.

6. Replating من خلايا الترتيب، الصيانة والتوسع NC

ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا FACS فرز اليدقاد مع عناية خاصة لضمان بقاء الأمثل. ابقائهم على الجليد حتى replating لهم. لا دوامة أو ماصة منهم بقسوة. الخلايا يمكن معلق عبها الأنبوب.

  1. بعد FACS الفرز، عد الخلايا NC، ثم تدور عليهم وresuspend في N2-التمايز المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل FGF2، 20 نانوغرام / مل EGF و 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد في حجم المناسبة لreplate لهم في خلايا 30،000 / 10 قطرات ميكرولتر.
  2. تماما جافة معدة مسبقا PO / لوحات لام / FN وحوالي 50-70 وحة قطرات لكل 10 سم الطبق. السماح للأطباق الوقوف على RT لمدة 20-30 دقيقة.
  3. إضافة بعناية فائقة 20 سم ml/10 طبق من N2/FGF2/EGF/Y-27632 دون إزعاج قطرات. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.
  4. تغذية الخلايا كل 2-3 أيام مع N2/FGF2/EGF.
    ملاحظة: يتم توسيع الخلايا NC أو passaged كل حوالي 4-5 أيام أو عندما تبدأ تتراكم داخل قطرات.
  5. لمرور الخلايا NC، إزالة المتوسطة، واش خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X وإضافة 8 مل accutase/10 سم الطبق. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. ماصة الخلايا قبالة لوحة باستخدام ماصة 5 مل ونقلها إلى أنبوب 15 مل. إضافة 6 مل برنامج تلفزيوني 1X.
  7. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 114 × ز.
  8. resuspend الخلايا في N2-التمايز المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل FGF2، 20 نانوغرام / مل EGF و 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد من أجل الحصول على 20،000 cells/10 ميكرولتر الحبرية.
  9. Replate الخلايا في 10 ميكرولتر قطرات على لوحات المجففة ص / لام / FN. السماح للأطباق الوقوف على RT لمدة 20-30 دقيقة.
  10. إضافة بعناية ml/10 20 سم طبق من N2/FGF2/EGF/Y-27632. احتضان عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: خلايا NC يمكن الحفاظ على أو توسيع لتصل إلى 2 أسابيع، كما يبلغ عدد سكانها السلف متجانسة نسبيا. الثقافة تعد قد تؤدي بهم إلى التمايز إلى مختلف أنواع الخلايا ذرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وهما أهم التحسينات للبروتوكول R-NC عبر بروتوكول MS5-R-NC 11 هي خالية من التغذية، وظروف محددة التمايز وتقصير العام للمتطلبات الوقت. الخلايا المغذية MS5 13 هي نقي العظم خلايا انسجة الفئران المستمدة التي ثبت لدعم التمايز العصبية من hESCs 14. مثقف HESCs على الخلايا ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لتمايز الخلايا ناجحة R-NC من HESC / hiPSCs ينبغي بذل الاعتبارات التالية. فمن الأهمية بمكان أن تعمل في ظل ظروف معقمة الثقافة في جميع الأوقات. على وجه الخصوص، من المهم لاختبار ثقافات hPSC للتلوث الميكوبلازما بشكل منتظم، لأن هذا التلوث سوف تعيق تمايز ناجحة، ولكن لا يمكن بسهولة يت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل الزمالة للباحثين متقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية، ومن خلال المنح المقدمة من NYSTEM (C026446؛ C026447) ومبادرة الخلايا الجذعية ثلاثي المؤسسية (مؤسسة ستار).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMGibco-Life Technologies11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
DMEM/F12Gibco-Life Technologies11330-032
Knockout Serum ReplacementGibco-Life Technologies10828-028Lot should be tested
L-GlutamineGibco-Life Technologies25030-081
Penicinlin/StreptomycinGibco-Life Technologies15140-122
MEM minimum essential amino acids solution Gibco-Life Technologies11140-050
β-Mercaptoethanol Gibco-Life Technologies21985-023toxic
Recombinant human FGF basic (FGF2)R&D Systems233-FB-001MG/CF
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
DMEM/F12 powder Invitrogen12500-096
GlucoseSigmaG7021
Sodium Bicarbonate SigmaS5761
APO human transferrinSigmaT1147
Human insulin SigmaI2643
Putriscine dihydrochlorideSigmaP5780
SeleniteSigmaS5261
ProgesteroneSigmaP8783
Matrigel matrixBD Biosciences354234
Poly-L Ornithin hydrobromideSigmaP3655
Mouse Laminin-IR&D Systems3400-010-01
FibronectinBD Biosciences356008
Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/mlStem Cell Technologies7013
Trypsin-EDTA Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 dihydrochlorideTocris-R&D Systems1254
LDN193189Stemgent04-0074
SB431542Tocris-R&D Systems1614
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Ascorbic Acid SigmaA4034
BDNFR&D Systems248-BD
FGF8R&D Systems423-F8
Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)R&D Systems464SH
HBSSGibco-Life Technologies14170-112
HEPESGibco-Life Technologies1563-080
Human recombinant EGFR&D Systems236EG
gelatin (PBS without Mg/Ca)in house
Antibodies:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgMSigmaC6680-100TSTlot should be tested
Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)Advanced Targeting SystemsAB-N07lot should be tested
APC rat anti-mIgMBD Parmingen550676lot should be tested
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 InvitrogenA21121lot should be tested
Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)Santa Cruzsc-5279lot should be tested
Material/Equipment:
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)GlobalStemGSC-6105M
Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,  pipettes, pipette tips
Glass hematocytometer
Cell culture centrifuge
Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)
Cell culture laminar flow hood with embedded microscope
Cell culture biosafety hood
Cell sorting machine, i.e. MoFlo
Inverted microscope
1 ml TB syringe 27Gx1/2BD Biosciences309623
Cell lifter PolyethyleneCorning Incorporated3008

References

  1. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
  2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  3. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  4. Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
  5. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  6. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
  7. McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
  8. Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
  9. Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
  10. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
  11. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
  14. Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
  15. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
  16. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
  17. Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

87 iPSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved