Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane

Riepilogo

Cresta neurale (NC), le cellule derivate da cellule umane staminali pluripotenti (HPSC) hanno un grande potenziale per modellare lo sviluppo umano e la malattia e per le terapie di sostituzione cellulare. Qui, un libero adattamento-feeder della tuttora ampiamente utilizzate In vitro Protocollo di differenziazione per la derivazione di cellule NC da hPSCs è presentato.

Abstract

Le cellule umane staminali pluripotenti (hPSCs) hanno un grande potenziale per lo studio dello sviluppo embrionale umano, per modellare malattie umane nel piatto e come fonte di cellule trapiantabili per applicazioni rigenerative dopo malattie o incidenti. Cresta (NC), le cellule neurali sono i precursori per una grande varietà di cellule somatiche adulte, come le cellule del sistema nervoso periferico e glia, melanociti e cellule mesenchimali. Essi sono una preziosa fonte di cellule per studiare gli aspetti dello sviluppo embrionale umana, inclusa la specificazione destino delle cellule e la migrazione. Ulteriore differenziazione delle cellule progenitrici NC in tipi di cellule terminalmente differenziate offre la possibilità di modellare malattie umane in vitro, studiare meccanismi di malattia e di generare cellule per la medicina rigenerativa. Questo articolo presenta l'adattamento di un protocollo vitro attualmente disponibile nella differenziazione per la derivazione di cellule NC da hPSCs. Questo nuovo protocollo richiede 18 giorni di differentiation, è facilmente scalabile e altamente riproducibile tra cellule staminali embrionali umane (hESC) linee così come cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) linee privo di alimentatore. Entrambi i protocolli vecchi e nuovi producono celle NC di uguale identità.

Introduzione

Le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSC) hanno mostrato un potenziale immenso, in particolare per la ricerca e il trattamento futuro delle malattie umane per i quali sono disponibili né modelli animali buoni né i tessuti primari. Esempi di applicazione per la tecnologia hESC / hiPSC sono i seguenti: Celle di particolare interesse possono essere generati da hESC / hiPSCs per la medicina rigenerativa in quantità illimitata ^1. Le cellule possono essere prodotti da pazienti portatori di una malattia specifica e usati per stabilire in modelli di malattia vitro ^2,3. Tali modelli di malattia possono poi essere utilizzati per lo screening di stupefacenti su larga scala nella ricerca di nuovi composti farmacologici ^4, nonché la sperimentazione di farmaci esistenti per l'efficacia e la tossicità ^5. Modelli in vitro di malattia può portare alla identificazione di nuovi meccanismi di malattia. Per tutte le applicazioni della tecnologia hESC / iPSC è importante lavorare con specifici e ben definiretipi d cellule colpite nella malattia di interesse. Pertanto, la disponibilità di protocolli di differenziazione solidi e riproducibili in vitro è fondamentale per tutte le applicazioni della tecnologia hESC / hiPSC. I protocolli sono desiderabili che mostrano la variabilità minima, spese tempo, fatica, difficoltà e costi, nonché la riproducibilità massima tra le linee hESC / hiPSC e diversi ricercatori.

Cresta neurale (NC), le cellule emergono durante neurulazione vertebrati tra l'epidermide e l'epitelio neurale. Essi proliferano e migrano ampiamente in tutto l'embrione in via di sviluppo e danno luogo a una varietà impressionante di tipi di cellule progenie, tra cui ossa / cartilagine, lo scheletro cranio-facciale, nervi sensoriali, cellule di Schwann, melanociti, cellule muscolari lisce, i neuroni enterici, i neuroni autonomici, cellule cromaffini , cellule setto cardiaco, denti e surrenale / tiroide cellule ghiandolari ^6. Così, le cellule NC sono un tipo cellulare attraente per il campo delle cellule staminali e importante per lamodellazione di una varietà di malattie, come la malattia di Hirschsprung ^7, familiare Disautonomia ⁸ nonché tumori come il neuroblastoma ^9. Inoltre, offrono la possibilità di studiare aspetti dello sviluppo embrionale umano in vitro.

Il attualmente disponibili e ampiamente applicato in protocollo di differenziazione in vitro per la derivazione di cellule NC da hESCs ^10,11 richiede fino a 35 giorni di differenziazione e comporta l'induzione neurale delle cellule stromali di alimentazione come le cellule MS5 e viene così eseguita in condizioni scarsamente definiti. Mentre può essere up-scalata a generare grandi quantità di celle NC, ad esempio necessaria per high throughput screening farmacologico ^4, questo è il lavoro e costosi. Inoltre, esso comporta passaging manuale di rosette neurali, che possono essere difficili da riprodurre e quindi è soggetta a variabilità complessiva, in particolare quando viene applicato ad una grande varietà di hESC o hiPSClinee. Qui, viene mostrata la derivazione graduale delle cellule NC in un protocollo di 18 giorni che è privo di cellule di alimentazione. Questo metodo è più breve e più definito rispetto al protocollo attualmente utilizzato. Inoltre, è molto robusto nel generare celle NC tra diverse linee hiPSC. Importante, è dimostrato che le cellule CN prodotti dai entrambi i protocolli emergono al confine di rosette neurali (qui di seguito denominato rosetta-NC o R-NC). Le cellule derivate utilizzando uno dei due protocolli appaiono morfologicamente identici, esprimono gli stessi marcatori NC e si raggruppano in analisi di microarray. Celle NC derivate utilizzando il nuovo protocollo (R-NC) sono funzionali, simili alle cellule derivate NC utilizzando il vecchio protocollo (MS5-R-NC) tale che possono migrare e ulteriormente differenziarsi in neuroni. Pertanto, le cellule possono essere usati contemporaneamente con le cellule MS5-R-NC. Il protocollo di cellule R-NC per la derivazione di cellule NC da cellule staminali embrionali umane / iPSC sarà utile per tutte le applicazioni della tecnologia hESC / iPSC che coinvolge il lignaggio NC.

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Protocollo

1. Preparazione della Cultura Media, piatti rivestiti e manutenzione di hPSCs

Preparazione 1.1 supporti

Nota: Filtrare tutti i media per la sterilizzazione e conservare a 4 ° C al buio per un massimo di due settimane. Numeri nomi dei reagenti, della società e catalogo sono elencati nella tabella dei materiali.

1. % FBS DMEM/10: Unire 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep e 5 ml di L-glutammina.
2. HES-medio: Combine 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml di L-glutammina, 5 ml Pen / Strep, 10 ml di MEM minimo di soluzione aminoacidi essenziali, 1 ml β-mercaptoetanolo. Aggiungere 10 ng / ml di FGF-2 dopo filtrazione il mezzo.
   ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo è tossico, evitare l'inalazione, ingestione e contatto con la pelle.
3. Medio KSR-differenziazione: Combine 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutammina, 10 ml Pen / Strep, 10 ml di MEM minima soluzione di amminoacidi essenziali e 1 ml di β-mercaptoetanolo.
4. N2-differentiatisu supporto: sciogliere 12 g DMEM/F12 polvere in 980 ml ​​di dH ₂ O, aggiungere 1,55 g di glucosio, 2 g di bicarbonato di sodio e 100 mg APO transferrina umana. Mescolare 2 ml dH ₂ O con 25 mg di insulina umana e 40 microlitri 1 N NaOH, aggiungere la soluzione disciolta al mezzo. Aggiungere 100 microlitri dicloridrato putrescina, 60 microlitri selenite, 100 microlitri progesterone e portare al volume di 1 litro con dH ₂ O.

1.2 Rivestimento di piatti della cultura

1. Rivestimento Matrigel: Thaw 1 ml congelati matrigel aliquota pipettando 19 ml DMEM/F12 sul aliquota fino a quando non si è sciolta. Togliere macchie passando attraverso un colino cella 40 micron e piastra 8 ml/10 cm piatto. Incubare i piatti per 1 ora a RT. Aspirare il matrigel immediatamente prima placcatura le cellule.
   Nota: Lavorate rapidamente con matrigel perché può aggregarsi a temperature superiori a 4 ° C.
2. Rivestimento PO / Lam / FN: Aggiungere 10 ml di 1x PBS contenente 15 mg / ml Poly-L ornitina hydrobromide ad un piatto 10 centimetri. Incubare il piatto per una notte a 37 ° C. Lavare le piastre con PBS 1x volta e aggiungere 10 ml/10 cm piatto di 1x PBS contenente 2 mg / ml topo laminina-I e 2 mg / ml di fibronectina. Incubare i piatti per una notte a 37 ° C. Prima placcatura le cellule, rimuovere completamente la soluzione e lasciare asciugare completamente le piastre a temperatura ambiente per 15-20 min da loro piedi sulla parete cappa coltura tissutale senza il coperchio.
   Nota: I piatti sono completamente asciutte e pronte per la placcatura cellulare quando si può vedere strutture cristalline sulla superficie (visibile ad occhio). Le piastre possono essere conservati a temperatura ambiente per qualche ora in questo stato essiccato. Piatti PO / Lam / FN devono essere preparati due giorni prima del tempo. In casi di emergenza Lam / FN può essere incubato per solo 2-4 ore. Tuttavia, questo può rischiare di non ottimali risultati differenziazione / sopravvivenza.

1.3 Manutenzione di hPSCs

Nota: hPSCs sono mantenute su 0,1% di gelatina e mouse mitoticamente inattivato fibroblasti embrionali (MEFS) nelle HES-medium supplementato con 10 ng / ml di FGF-2 come descritto in precedenza ^10,12. Le cellule devono essere divise ogni 6-8 giorni.

1. Coat un piatto 10 centimetri con 8 ml di 0,1% di gelatina (in 1x PBS senza calcio o magnesio) a temperatura ambiente per 5 min.
2. Scongelare MEF congelati rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C. Aggiungi milione MEF a 10 ml% FBS DMEM/10.
3. Aspirare la gelatina e piastra le cellule. Incubare a 37 ° C per almeno 6 ore.
4. Aspirare il FBS DMEM/10% dalla piastra MEF preparato, lavare piatto con 1x PBS una volta e aggiungere 10 ml HES-medium supplementato con 10 mM Y-27632 dicloridrato. Lasciar riscaldare a 37 ° C per 20 min.
   Nota: Per splitting manuale di hPSCs viene utilizzata una cappa a flusso laminare con un microscopio incorporato. Tuttavia, le cellule possono essere diversi passaggi utilizzando opportuni metodi alternativi.
5. Sotto una cappa a flusso laminare con un microscopio incorporato, staccare colonie separate utilizzando un sollevatore cella e far galleggiare.
6. Utilizzare unSiringa da 1 ml per aspirare le colonie galleggianti e li spedisce sul caldo piatto MEF fresca. Trasferire circa un quarto delle cellule al nuovo piatto. Incubare a 37 ° C.
7. Concime cellule quotidianamente con fresco medio HES.

2. Placcatura di hPSCs di Differenziazione

Nota: hPSCs dovrebbero essere raggruppati o placcati per la differenziazione, quando le colonie sono grandi, ma hanno ancora margini taglienti con il meno possibile le cellule di differenziazione alle frontiere (vedi Figura 1B). Quando le cellule sono mantenuti utilizzando passaging manuale colonie dovrebbero essere abbastanza grandi da essere facilmente visibile ad occhio. Per ottenere la giusta sensazione per questo punto di tempo si può mantenere un piatto HPSC separata per due settimane senza passaging e guardare le cellule raggiungono e passare il punto di tempo ideale per passaging / li differenzia.

1. Preparare 10 centimetri piatti con matrigel 1 ora prima di avviare la differenziazione. Rivestimento matrigel successo può essereverificate a 4 ingrandimenti.
2. Quando le hPSCs sono pronti per essere diviso, aspirare il terreno e aggiungere 4 ml di 0,05% tripsina-EDTA alle cellule.
3. Agitare il piatto orizzontale per 2 minuti energicamente fino a quando si può vedere il MEF come singole cellule sollevare la piastra sotto il microscopio. Le colonie HPSC rimangono attaccati come colonie.
4. Immediatamente e accuratamente, aspirare il tripsina e lasciare che la piastra di riposare a temperatura ambiente per 2-4 min.
5. Aggiungere 2 ml di HES-medio alla piastra e con una pipetta P1000, staccare le cellule.
   Nota: Se le cellule non possono essere sollevati dalla superficie facilmente, la piastra può essere incubato vuoto a temperatura ambiente per altri 2-3 min.
6. Trasferire le cellule a 8 ml HES-medium supplementato con 10 mM Y-27632 dicloridrato.
7. Aspirare il matrigel da 10 cm piatto precedentemente preparato. Piastra le cellule con un rapporto di 1:1 o 01:02 (per esempio: le cellule da un piatto 10 centimetri sono divisi in due 10 centimetri piatti) sulla piastra matrigel. Incubare a 37 °C durante la notte.
   Nota: Questo placcatura dovrebbe portare a circa 100.000 cellule / cm ^2.

3. Induzione della differenziazione neurale

Nota: La differenziazione può essere iniziata (giorno 0) quando le cellule sono 90-100% confluenti (vedere Figura 1C), di solito il giorno seguente. Se la confluenza preciso non è ancora raggiunto, le cellule possono essere alimentati quotidianamente con HES-medio finché non sono pronti per la differenziazione. In alternativa, il numero iniziale di cellule piastrate può essere aumentata.

1. Il giorno 0-3, nutrire le cellule al giorno con 10 ml/10 cm servire a medio KSR-differenziazione contenente 0,1 micron LDN193189 e 10 micron SB431542.
2. Il giorno 4 e 5 alimenti le cellule con il 75% di media KSR-differenziazione e il 25% a medio N2-differenziazione entrambi contenenti LDN193189 e SB431542.
3. Il giorno 6 e 7 mangimi le cellule con 50% medio KSR-differenziazione e 50% N2 medio-differenziazione entrambi contenenti LDN193189 e SB431542.
4. Il giorno 8 e 9 nutrire le cellule con il 25% di media KSR-differenziazione e il 75% a medio N2-differenziazione entrambi contenenti LDN193189 e SB431542.
5. Il giorno 9 e 10 preparare piatti PO / Lam / FN come indicato in 1.2.2 per replating delle cellule il giorno 11.
6. Il giorno 10 celle di alimentazione a media N2-differenziazione contenente LDN193189 e SB431542.

4. Replating in Goccioline per NC Specifica

1. Il giorno 11 aspirato Lam / FN dalle piastre precedentemente preparati e lasciarli asciugare completamente a temperatura ambiente per 20-30 minuti, come spiegato in 1.2.2.
2. Rimuovere mezzo dalle cellule differenziazione, lavare le cellule una volta con PBS 1x e aggiungere 8 ml accutase/10 cm piatto. Incubare per 20 minuti a 37 ° C.
3. Utilizzando un sollevatore cella, staccare le cellule e risospendere in accutase con una pipetta da 5 ml. Trasferire la sospensione in una provetta da 15 ml.
4. Aggiungere 5 ml di PBS 1x e far girare le cellule per 5 min a 114 x g.
5. Risospendere le cellule in 10 ml 1x PBS. Per garantire una sospensione di cellule singole, li filtrare attraverso un colino cella 40 pm e contare le cellule utilizzando un emocitometro o tecnica equivalente.
6. Spin le cellule giù e risospendere in mezzo N2-differenziazione contenente 200 mM Acido ascorbico (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 pM Y-27632 dicloridrato alla concentrazione di 100.000 -150.000 cells/10 microlitri.
7. Utilizzando un repeat-pipetta, piatto 10 gocce microlitri vicini gli uni agli altri senza toccarli sul PO essiccati / Lam / FN 15 centimetri piatti.
   Nota: Un 10 centimetri piatto di cellule differenziate normalmente si traduce in piatti cm o circa 100 x 10 microlitri droplets/15 cm piatto circa 2-3 volte 15.
8. Lasciate che le goccioline stanno a temperatura ambiente per 20-30 minuti, poi con molta attenzione (per non disturbare le goccioline) aggiungere 30 ml di N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y e incubare a 37 ° C.
9. Il giorno 12, con attenzione nutrire le cellule con 20 ml/15 cm piatto N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
10. Da day 14-17 nutrire le cellule ogni secondo o terzo giorno con N2/AA/BDNF/FGF8.
11. Il giorno 16 e 17 preparare PO / piastre Lam / FN per replate celle NC dopo FACS ordinamento.

5. Fluorescence Activated Cell (FACS) di celle NC

Nota: La preparazione delle cellule per FACS richiede circa 2 ore.

1. Il giorno 18 di media rimuovere, lavare le cellule una volta con PBS 1x nel piatto e aggiungere 12 ml accutase. Incubare le cellule per 20 min a 37 ° C.
2. Utilizzando un sollevatore cellulare, staccare le cellule dalla superficie e lasciarli galleggiare. Pipettare le cellule in sospensione con una pipetta da 5 ml, trasferirli in una provetta da 50 ml e aggiungere 30 ml di 1x PBS. Centrifugare le cellule per 5 min a 114 x g.
3. Usando una pipetta P1000, risospendere le cellule in 1 ml di 2% FBS / HBSS (il HBSS contenente 15 mM HEPES). Aggiungere 19 ml di 2% FBS / HBSS e filtrare le cellule attraverso un colino cella 40 micron per garantire una sospensione di cellule singole. Incubare le cellule in ghiaccio per 15 min per gli anticorpi di blocco e poi contare utilizzando un emocitometro.
4. Spin le cellule verso il basso e risospendere alla concentrazione di 10 milioni di cellule / ml a 2% FBS / HBSS.
5. Mettere da parte 1 milione di celle ciascuno per la macchia, single-macchiato (HNK-1 solo e soltanto p75) e anticorpo secondario macchiato solo (APC solo ed esclusivamente 488) FACS controlla.
6. Aggiungere 5 ml di HNK-1 e 5 ml di p75 anticorpo primario per 10 milioni di cellule in 1 ml di sospensione ai campioni adeguati e incubare per 20 min in ghiaccio.
7. Lavare le cellule in 10 ml di PBS 1x (centrifuga 5 min a 114 xg) e risospendere le cellule in 1 ml 2% FBS / HBSS. Aggiungere 2 ml di APC e 1 ml di 488 anticorpo secondario per 10 milioni di cellule in 1 ml di sospensione ai campioni adeguati e incubare per 20 min in ghiaccio al buio.
   Nota: APC e 488 sono gli anticorpi secondari utilizzati qui per la HNK-1 e p75 colorazione, rispettivamente.
8. Lavare le cellule in 10 ml 1x PBS due volte, risospendere 10 milioni di cellule in 500 ml di2% FBS / HBSS contenente DAPI (a 0.5 ng / ml) o opportuno macchia cellule vive alternativa di escludere le cellule morte dalla analisi FACS.
9. Trasferire i campioni di appropriarsi tubi FACS.
10. Preparare tubi FACS con 0,5 ml 2% FBS / HBSS per la raccolta delle cellule.
    Nota: Le celle e tubi di raccolta sono tenuti in ghiaccio al buio durante il tempo di ordinamento.
11. Utilizzando una macchina di smistamento delle cellule con il laser in grado di rilevare DAPI, APC e 488 specie DAPI-/HNK-1 + / P75 + cellule doppie positive.
    Nota: Tempo di preparazione e manipolazione delle cellule porta ad una piccola percentuale di cellule morte, macchie DAPI cellule morte permette solo e quindi per queste cellule per essere esclusi dalla popolazione ordinato. Qualsiasi alternativa macchia dal vivo / morto funziona altrettanto bene per questo scopo. DAPI sé non causa citotossicità nella popolazione di cellule vivo.

6. Replating di cellule ordinati, NC manutenzione ed espansione

Nota: le cellule FACS ordinati dovrebbero essere a manocondotto con particolare cura per garantire la sopravvivenza ottimale. Tenerli in ghiaccio fino al loro replating. Non vortex o pipettare loro duramente. Le cellule possono essere risospese muovendo il tubo.

1. Dopo FACS ordinamento, contare le celle NC, poi girare giù e risospendere in mezzo N2 differenziazione integrato con 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF e 10 micron Y-27632 dicloridrato nel volume appropriato per loro replate a 30.000 cellule / 10 gocce microlitri.
2. Asciugare accuratamente preparata in precedenza PO piastre / Lam / FN e piatto circa 50-70 gocce per 10 centimetri piatto. Lasciate che i piatti si distinguono a temperatura ambiente per 20-30 min.
3. Aggiungere molto attentamente 20 ml/10 cm piatto di N2/FGF2/EGF/Y-27632 senza disturbare le goccioline. Incubare le cellule a 37 ° C.
4. Nutrire le cellule ogni 2-3 giorni con N2/FGF2/EGF.
   Nota: le cellule NC vengono espanse o diversi passaggi circa ogni 4-5 giorni o quando iniziano ad accumularsi all'interno delle goccioline.
5. Per il passaggio delle cellule NC, rimuovere il mezzo, wash le cellule una volta con PBS 1x e aggiungere 8 ml accutase/10 cm piatto. Incubare per 20 minuti a 37 ° C.
6. Pipettare le cellule dalla piastra con una pipetta 5 ml e trasferirli in una provetta da 15 ml. Aggiungere 6 ml di PBS 1X.
7. Centrifugare le cellule per 5 min a 114 x g.
8. Risospendere le cellule in mezzo N2-differenziazione addizionato con 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF e 10 pM Y-27632 dicloridrato per avere 20.000 cells/10 microlitri gocciolina.
9. Replate le cellule in 10 gocce microlitri sulle secche piatti PO / Lam / FN. Lasciate che i piatti si distinguono a temperatura ambiente per 20-30 min.
10. Aggiungere con cautela 20 ml/10 cm piatto di N2/FGF2/EGF/Y-27632. Incubare a 37 ° C.
    Nota: le cellule NC possono essere mantenuti o ampliati per un massimo di due settimane come una popolazione progenitore relativamente omogenea. Cultura più può portare loro di differenziarsi in vari tipi di cellule progenie.

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Risultati

I due più importanti miglioramenti del protocollo R-NC tramite il protocollo MS5-R-NC ¹¹ sono le condizioni differenziazione definite libero-feeder e la riduzione complessiva del requisito tempo. Cellule di alimentazione MS5 ¹³ sono di midollo osseo cellule stromali derivate murine che hanno dimostrato di sostenere differenziamento neurale da hESC ^14. HESCs coltivati ​​su cellule di alimentazione MS5 presso le strutture epiteliali bassa densità di forma e rosette neurali ^15,

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Discussione

Per la differenziazione di successo di cellule R-NC da hESC / hiPSCs devono essere effettuate le seguenti considerazioni. E 'fondamentale per lavorare in condizioni di coltura sterili in ogni momento. In particolare, è importante testare culture HPSC per contaminazione micoplasma regolarmente, poiché questa contaminazione ostacolerà differenziazione successo, ma non può essere facilmente rilevata visivamente in culture HPSC. La differenziazione R-NC deve essere iniziato al 90-100% della densità cellulare; densi...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco-Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
DMEM/F12	Gibco-Life Technologies	11330-032
Knockout Serum Replacement	Gibco-Life Technologies	10828-028	Lot should be tested
L-Glutamine	Gibco-Life Technologies	25030-081
Penicinlin/Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140-122
MEM minimum essential amino acids solution	Gibco-Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Gibco-Life Technologies	21985-023	toxic
Recombinant human FGF basic (FGF2)	R&D Systems	233-FB-001MG/CF
Knockout DMEM	Gibco-Life Technologies	10829-018
DMEM/F12 powder	Invitrogen	12500-096
Glucose	Sigma	G7021
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
APO human transferrin	Sigma	T1147
Human insulin	Sigma	I2643
Putriscine dihydrochloride	Sigma	P5780
Selenite	Sigma	S5261
Progesterone	Sigma	P8783
Matrigel matrix	BD Biosciences	354234
Poly-L Ornithin hydrobromide	Sigma	P3655
Mouse Laminin-I	R&D Systems	3400-010-01
Fibronectin	BD Biosciences	356008
Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml	Stem Cell Technologies	7013
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300-054
Y-27632 dihydrochloride	Tocris-R&D Systems	1254
LDN193189	Stemgent	04-0074
SB431542	Tocris-R&D Systems	1614
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
BDNF	R&D Systems	248-BD
FGF8	R&D Systems	423-F8
Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)	R&D Systems	464SH
HBSS	Gibco-Life Technologies	14170-112
HEPES	Gibco-Life Technologies	1563-080
Human recombinant EGF	R&D Systems	236EG
gelatin (PBS without Mg/Ca)	in house
Antibodies:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM	Sigma	C6680-100TST	lot should be tested
Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)	Advanced Targeting Systems	AB-N07	lot should be tested
APC rat anti-mIgM	BD Parmingen	550676	lot should be tested
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1	Invitrogen	A21121	lot should be tested
Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)	Santa Cruz	sc-5279	lot should be tested
Material/Equipment:
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)	GlobalStem	GSC-6105M
Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,  pipettes, pipette tips
Glass hematocytometer
Cell culture centrifuge
Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)
Cell culture laminar flow hood with embedded microscope
Cell culture biosafety hood
Cell sorting machine, i.e. MoFlo
Inverted microscope
1 ml TB syringe 27Gx1/2	BD Biosciences	309623
Cell lifter Polyethylene	Corning Incorporated	3008