Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules

Résumé

Crête neurale (NC) des cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) ont un grand potentiel pour la modélisation du développement humain et de la maladie et des thérapies de remplacement cellulaire. Ici, une adaptation libre-alimentation de l'a largement utilisé In vitro Protocole de différenciation pour la dérivation de cellules NC de hPSCs est présenté.

Résumé

Cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont un grand potentiel pour l'étude du développement embryonnaire humain, pour la modélisation des maladies humaines dans le plat et comme une source de cellules transplantables pour des applications de régénération après la maladie ou les accidents. Les cellules de la crête neurale (CN) sont les précurseurs pour une grande variété de cellules somatiques adultes, comme les cellules du système nerveux périphérique et les cellules gliales, les mélanocytes et les cellules mésenchymateuses. Ils sont une source précieuse de cellules pour étudier les aspects du développement embryonnaire humaine, y compris la spécification du destin cellulaire et la migration. En outre la différenciation de cellules progénitrices CN en types de cellules à différenciation terminale offre la possibilité de modéliser les maladies humaines in vitro, étudier les mécanismes de la maladie et de générer des cellules pour la médecine régénératrice. Cet article présente l'adaptation d'un protocole in vitro de différenciation actuellement disponibles pour la dérivation de cellules NC de hPSCs. Ce nouveau protocole nécessite 18 jours de différenciation, est facilement extensible et hautement reproductible entre cellules embryonnaires humaines (CSEh souches) des lignes ainsi que les cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) des lignes sans chargeur. Les anciens et les nouveaux protocoles donnent des cellules NC de l'identité égale.

Introduction

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) ont montré un immense potentiel, en particulier pour l'enquête et le traitement futur des maladies humaines, pour laquelle aucun des modèles animaux de bonnes ni de tissus primaires sont disponibles. Exemples d'applications pour la technologie CSEh / hiPSC sont les suivantes: les cellules d'intérêt particulier peuvent être générés à partir de CSEh / hiPSCs pour la médecine régénérative à ^une quantité illimitée. Les cellules peuvent être produites à partir de patients porteurs d'une maladie spécifique et utilisées pour établir des modèles in vitro de la maladie ^2,3. Ces modèles de la maladie peuvent alors être utilisés pour le dépistage de drogues à grande échelle dans la recherche de nouveaux composés médicamenteux ⁴ ainsi que les essais de médicaments existants pour l'efficacité et la toxicité du ^5. Dans des modèles de maladie in vitro peuvent conduire à l'identification des mécanismes de la maladie de nouveaux. Pour toutes les applications de la technologie CSEh / iPSC il est important de travailler avec spécifique, bien définirtypes d cellulaires touchées dans la maladie d'intérêt. Ainsi, la disponibilité de protocoles de différenciation in vitro solides et reproductibles est essentiel pour toutes les applications de la technologie CSEh / hiPSC. Protocoles sont souhaitables qui montrent une variabilité minimale, dépense de temps, d'efforts, la difficulté et le coût ainsi que la reproductibilité maximale entre les lignes CSEh / hiPSC et différents chercheurs.

Cellules de la crête neurale (NC) apparaissent pendant la neurulation vertébrés entre l'épiderme et l'épithélium neural. Elles prolifèrent et migrent largement tout au long de l'embryon en développement et donnent lieu à une impressionnante diversité de types de cellules de la descendance, y compris des os / du cartilage, du squelette cranio-facial, les nerfs sensoriels, les cellules de Schwann, les mélanocytes, les cellules musculaires lisses, les neurones entériques, neurones autonomes, des cellules chromaffines , les cellules du septum cardiaque, des dents et des surrénales / thyroïde cellules glandulaires ^6. Ainsi, des cellules NC sont un type de cellule attractive pour le domaine des cellules souches et important pour lemodélisation d'une variété de maladies, telles que la maladie de Hirschsprung ^7, dysautonomie familiale ^8, ainsi que les cancers tels que le neuroblastome ^9. En outre, ils offrent la possibilité d'étudier les aspects du développement embryonnaire humain in vitro.

Actuellement disponibles et largement utilisés dans le protocole de différenciation in vitro pour la dérivation de cellules NC à partir de CSEh ^10,11 nécessite jusqu'à 35 jours de différenciation et il implique l'induction neurale sur les cellules stromales de connexion telles que les cellules MS5 et est donc effectuée dans des conditions mal définies. Alors qu'il peut être mis à échelle pour produire de grandes quantités de cellules NC, par exemple nécessaire pour haut débit médicament dépistage ^4, c'est la main-d'œuvre et coûteux. En outre, elle implique des passages manuel de rosettes de neurones, ce qui peut être difficile à reproduire, et donc est soumis à une variabilité dans l'ensemble, en particulier lorsqu'elle est appliquée à une grande variété de hESC ou hiPSClignes. Ici, la dérivation progressive des cellules NC dans un protocole de 18 jours qui est libre de cellules nourricières est affiché. Cette méthode est plus courte et plus défini que le protocole actuellement utilisé. En outre, il est très robuste dans la génération de cellules NC entre les différentes lignes de hiPSC. Surtout, il est démontré que les cellules NC produites par les deux protocoles émergent à la frontière de rosettes neurales (ci-après appelé rosette-NC ou R-NC). Les cellules dérivées en utilisant soit des deux protocoles semblent morphologiquement identiques, ils expriment les mêmes marqueurs NC et se regroupent dans l'analyse des microréseaux. Des cellules NC obtenues à l'aide du nouveau protocole (R-NC) sont fonctionnels, semblables à des cellules dérivées NC en utilisant l'ancien protocole (MS5-R-NC) de telle sorte qu'ils peuvent migrer et se différencier en neurones supplémentaire. Par conséquent, les cellules peuvent être utilisées en même temps que les cellules MS5-R-CN. Le protocole de la cellule R-NC pour la dérivation de cellules NC à partir de CSEh / iPSC sera utile pour toutes les applications de la technologie CSEh / iPSC impliquant la lignée NC.

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Protocole

1. Préparation de milieux de culture, des boîtes recouvertes et entretien de hPSCs

Préparation 1.1 Médias

Remarque: Filtrez tous les médias pour la stérilisation et conserver à 4 ° C dans l'obscurité pendant 2 semaines. noms de réactifs, la société et numéros de catalogue sont répertoriés dans le tableau des matières.

1. DMEM/10% de FBS: Mélanger 885 ml de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml Pen / Strep et 5 ml de L-glutamine.
2. HES-moyen: Mélanger 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml de L-glutamine, 5 ml Pen / Strep, 10 ml de MEM minimum solution essentielle d'acides aminés, de 1 ml β-mercaptoéthanol. Ajouter 10 ng / ml de FGF-2 après filtration du milieu.
   ATTENTION: β-mercaptoéthanol est toxique, éviter l'inhalation, ingestion et contact avec la peau.
3. Moyen KSR-différenciation: Mélanger 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml de L-glutamine, 10 ml Pen / Strep, 10 ml de MEM minimum solution d'acides aminés essentiels et 1 ml β-mercaptoéthanol.
4. N2-differentiatisur le milieu: Dissoudre 12 g de poudre dans DMEM/F12 980 ml ​​dH ₂ O, ajouter 1,55 g de glucose, 2 g de bicarbonate de sodium et 100 mg APO transferrine humaine. Mélanger 2 ml dH ₂ O: 25 mg d'insuline humaine et 40 ul de NaOH 1 N, ajouter la solution dissoute dans le milieu. Ajouter 100 pi de dichlorhydrate de putrescine, 60 pl sélénite, 100 pi de la progestérone et porter le volume à 1 L avec dH ₂ O.

1.2 Revêtement de boîtes de culture

1. Matrigel revêtement: Dégel 1 ml gelés matrigel aliquote par aspiration 19 ml DMEM/F12 sur l'aliquote jusqu'à ce qu'il soit dissous. Éliminer les grumeaux en le faisant passer à travers un tamis cellulaire de 40 um et la plaque 8 ml/10 cm plat. Incuber les boîtes pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer le matrigel immédiatement avant l'étalement des cellules.
   Remarque: Travaillez rapidement avec matrigel car il peut s'agglutiner à des températures supérieures à 4 ° C.
2. Revêtement PO / Lam / FN: Ajouter 10 ml de 1 x PBS contenant 15 ug / ml de bromhydrate de poly-L ornithine dans un plat de 10 cm. Incuber le plat pendant une nuit à 37 ° C. Laver les plaques avec du PBS 1x fois et ajouter 10 ml/10 cm plat de 1x PBS contenant 2 pg / ml souris laminine-I et 2 pg / ml de fibronectine. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C. Avant l'étalement des cellules, enlever complètement la solution et laisser les plaques sécher complètement à température ambiante pendant 15-20 min en les debout sur le mur de la hotte de culture de tissus sans le couvercle.
   Remarque: Les plats sont complètement sec et prêt pour le placage de la cellule où l'on peut voir des structures cristallines sur la surface (visible à l'œil nu). Les plaques peuvent être conservées à température ambiante pendant quelques heures dans cet état séché. Plats PO / Lam / FN doivent être préparés deux jours à l'avance. En cas d'urgence Lam / FN peut être incubé pendant 2-4 heures seulement. Toutefois, cela risquerait résultats différenciation / de survie sous-optimales.

1.3 Maintien de hPSCs

Remarque: hPSCs sont maintenus sur 0,1% de gélatine et de la souris mitotique inactivé fibroblastes embryonnaires (MFE) à la HES-milieu supplémenté avec 10 ng / ml de FGF-2 comme décrit précédemment ^10,12. Les cellules doivent être divisés tous les 6-8 jours.

1. Manteau un plat de 10 cm avec 8 ml de 0,1% de gélatine (PBS 1x sans en magnésium ou calcium) à température ambiante pendant 5 min.
2. Décongeler MEF congelés rapidement dans un bain d'eau à 37 ° C. Ajouter 1 million MEF à 10 ml DMEM/10% de FBS.
3. Aspirer la gélatine et plaquer les cellules. Incuber à 37 ° C pendant au moins 6 heures.
4. Aspirer le DMEM/10% de FBS de la plaque MEF prêt, laver la plaque avec PBS 1x fois et ajouter 10 ml de la HES-milieu supplémenté avec 10 uM Y-27632 dichlorhydrate. Laisser le milieu se réchauffer à 37 ° C pendant 20 min.
   Remarque: Pour fendage manuel de hPSCs une hotte à flux laminaire avec un microscope intégré est utilisé. Cependant, les cellules peuvent être soumises à des passages en utilisant des méthodes de substitution appropriées.
5. Sous une hotte à flux laminaire avec un microscope intégré, détachez colonies distinctes en utilisant un levier de cellule et les laisser flotter.
6. Utilisez unSeringue de 1 ml pour aspirer les colonies flottantes et les dépêcher sur le, plaque MEF chaud frais. Transférer environ un quart des cellules de la nouvelle antenne. Incuber à 37 ° C.
7. Nourrir les cellules quotidien avec le milieu HES frais.

2. Placage de hPSCs pour la différenciation

Remarque: hPSCs devraient être divisée ou plaqué de différenciation lorsque les colonies sont grandes, mais qui ont encore des arêtes vives avec aussi peu que possible cellules qui se différencient au niveau de leurs frontières (voir la figure 1B). Lorsque les cellules sont maintenues en utilisant des passages manuel, les colonies doivent être suffisamment grandes pour être facilement vu par les yeux. Pour obtenir la bonne idée de ce point de temps on peut conserver un plat HPSC séparée pendant deux semaines sans repiquer et regarder les cellules atteignent et passer le point de moment idéal pour passages / les différencier.

1. Préparer boîtes de 10 cm avec matrigel 1 heure avant de commencer la différenciation. Revêtement de matrigel réussie peut êtregarantie à un grossissement de 4x.
2. Lorsque les hPSCs sont prêts à être divisé, aspirer le milieu et ajouter 4 ml de 0,05% de trypsine-EDTA pour les cellules.
3. Secouez le plat horizontalement pendant 2 min vigoureusement jusqu'à ce que l'on peut voir sur les FAE comme des cellules individuelles soulevant la plaque sous le microscope. Les colonies HPSC restent attachés comme des colonies.
4. Immédiatement et abondamment, aspirer la trypsine et laissez la plaque reposer à température ambiante pendant 2-4 min.
5. Ajouter 2 ml d'HES-support à la plaque et à l'aide d'une pipette P1000, détacher les cellules.
   Remarque: Si les cellules ne peuvent pas être levées facilement de la surface, la plaque peut être incubée vide à température ambiante pour un autre 2-3 min.
6. Transférer les cellules à 8 ml HES-milieu supplémenté avec 10 uM Y-27632 dichlorhydrate.
7. Aspirer le matrigel d'un préalablement préparé de 10 cm. Plaquer les cellules à un ratio de 1:1 ou 1:2 (par exemple: Les cellules d'un plat de 10 cm sont divisés en deux boîtes de 10 cm) sur la plaque de Matrigel. Incuber à 37 °C pendant une nuit.
   Note: Ce revêtement devrait aboutir à environ 100 000 cellules / cm ^2.

3. L'induction de la différenciation neurale

Remarque: La différenciation peut être initiée (jour 0) lorsque les cellules sont de 90-100% de confluence (voir figure 1C), généralement le lendemain. Si la confluence exacte n'est pas encore atteinte, les cellules peuvent être nourris quotidiennement avec HES-moyen jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour la différenciation. En variante, le nombre initial de cellules étalées peut être augmentée.

1. Au jour 0 à 3, nourrir les cellules quotidien avec 10 ml/10 cm bomber moyen KSR-différenciation contenant 0,1 uM LDN193189 et 10 uM SB431542.
2. Le jour 4 et 5 aliments les cellules avec 75% de milieu KSR-différenciation et 25% de milieu N2 différenciation à la fois contenant et LDN193189 SB431542.
3. Au jour 6 et 7 d'alimentation des cellules avec 50% de milieu KSR-différenciation et 50% de milieu N2 différenciation à la fois contenant LDN193189 et SB431542.
4. Le jour 8 et 9 alimenter les cellules avec 25% de milieu KSR-différenciation et 75% de milieu N2 différenciation à la fois contenant et LDN193189 SB431542.
5. Le jour 9 et 10 de la préparation des plats PO / Lam / FN comme indiqué au point 1.2.2 de réensemencement des cellules sur 11 jours.
6. Le jour 10 cellules d'alimentation avec un milieu N2 différenciation contenant LDN193189 et SB431542.

4. Replacage en gouttelettes pour Spécification NC

1. Le jour 11 aspirer Lam / FN des plaques préalablement préparés et laissez-les sécher complètement à température ambiante pendant 20-30 minutes, comme expliqué au point 1.2.2.
2. Éliminer le milieu des cellules qui se différencient, se laver les cellules une fois avec PBS 1x et ajouter 8 ml accutase/10 cm plat. Incuber pendant 20 min à 37 ° C.
3. L'utilisation d'un dispositif de levage de la cellule, détacher les cellules et les remettre en suspension dans Accutase avec une pipette de 5 ml. Transférer la suspension dans un tube de 15 ml.
4. Ajouter 5 ml de PBS 1x et tourner les cellules pendant 5 min à 114 x g.
5. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml 1x PBS. Pour assurer une suspension de cellules individuelles, les filtrer à travers un tamis cellulaire de 40 pm et compter les cellules en utilisant un hématimètre ou une technique équivalente.
6. Faire tourner les cellules vers le bas et les remettre en suspension dans un milieu N2-différenciation contenant 200 pM d'acide ascorbique (AA), 20 ng / ml de BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 uM Y-27632, dichlorhydrate à la concentration de 100 000 -150 000 cellules/10 ul.
7. L'utilisation d'un repeat-pipette, plaque 10 pi gouttelettes proches les uns des autres, sans les toucher sur le PO séché / Lam / FN 15 cm plats.
   Remarque: Un plat de 10 cm de cellules différenciées aboutit normalement à environ 2-3 fois 15 cm plats ou environ 100 x 10 pi droplets/15 cm plat.
8. Laissez les gouttelettes s'élèvent à température ambiante pendant 20-30 minutes, puis très soigneusement (ne pas déranger les gouttelettes) ajouter 30 ml d'N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y et incuber à 37 ° C.
9. Le jour 12, nourrir soigneusement les cellules avec 20 ml/15 cm plat N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
10. De day 14-17 nourrir les cellules chaque deuxième ou troisième jour de N2/AA/BDNF/FGF8.
11. Le jour 16 et 17 préparer PO / plaques Lam / FN à Réensemencement cellules NC après tri FACS.

5. Cellulaire activé par fluorescence (FACS) des cellules NC

Remarque: La préparation des cellules pour FACS nécessite environ 2 h.

1. Le jour 18 moyen de supprimer, laver les cellules une fois avec PBS 1x dans le plat et ajouter 12 ml Accutase. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 ° C.
2. L'utilisation d'un dispositif de levage de la cellule, détacher les cellules de la surface et laisser flotter. Introduire à la pipette les cellules en suspension en utilisant une pipette de 5 ml, transférer à un tube de 50 ml et ajouter 30 ml de PBS 1x. Faites tourner les cellules pendant 5 min à 114 x g.
3. En utilisant une pipette P1000, remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 2% de FBS / HBSS (la HBSS contient 15 mM de HEPES). Ajouter 19 ml de 2% de FBS / HBSS et de filtrer des cellules à travers un tamis cellulaire de 40 um pour assurer une suspension cellulaire unique. Incuber les cellules sur la glace pour 15 mdans de blocage d'anticorps puis les compter en utilisant un hématimètre.
4. Faire tourner les cellules vers le bas et les remettre en suspension à la concentration de 10 millions de cellules / ml dans 2% de FBS / HBSS.
5. Mettre de côté 1 million de cellules par la tache, unique teinté (HNK-1 seulement et p75 seulement) et l'anticorps secondaire taché seulement (APC seulement et 488 uniquement) FACS contrôle.
6. Ajouter 5 ul de HNK-1 et 5 pi de p75 anticorps primaire par 10 millions de cellules dans 1 ml de suspension pour les échantillons appropriés et incuber pendant 20 min sur la glace.
7. Laver les cellules dans 10 ml de PBS 1x (centrifugeuse 5 min à 114 x g) et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 2% de FBS / HBSS. Ajouter 2 ul d'une APC et 488 ul de l'anticorps secondaire par 10 millions de cellules dans 1 ml de suspension appropriés pour les échantillons et incuber pendant 20 min sur de la glace dans l'obscurité.
   Remarque: APC et 488 sont les anticorps secondaires utilisés ici pour la coloration HNK-1 et p75, respectivement.
8. Laver les cellules dans 10 ml 1x PBS deux fois, remettre en suspension 10 millions de cellules dans 500 ul de2% de FBS / HBSS contenant DAPI (0,5 ng / ul) ou alternatif coloration de cellules vivantes appropriées d'exclure les cellules mortes de l'analyse FACS.
9. Transférer les échantillons de s'approprier tubes FACS.
10. Préparer des tubes FACS avec 0,5 ml de 2% de FBS / HBSS à la collecte de cellules.
    Remarque: Les cellules et les tubes de prélèvement sont conservés sur de la glace dans l'obscurité pendant le temps de tri.
11. En utilisant une machine de tri cellulaire avec des lasers qui peuvent détecter DAPI, APC et 488 tri DAPI-/HNK-1 + / P75 + cellules doubles positives.
    Note: Temps de préparation et de manipulation des cellules conduit à un faible pourcentage de la mort cellulaire, taches DAPI des cellules mortes permet seulement et donc pour ces cellules doivent être exclues de la population triée. Toute tache en direct / morts de remplacement fonctionne aussi bien à cette fin. DAPI lui-même ne provoque pas de cytotoxicité dans la population de cellules vivantes.

6. Replacage de cellules triées, NC Agrandissement et entretien

Remarque: les cellules triées par FACS doit être la mainconduit avec un soin particulier pour assurer la survie optimale. Gardez-les sur de la glace jusqu'à ce que leur réensemencement. Ne pas vortex ou la pipette avec dureté. Les cellules peuvent être remises en suspension par agitation du tube.

1. Après tri FACS, compter les cellules NC, puis tournez-les vers le bas et remettre en suspension dans un milieu N2 différenciation complété avec 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml d'EGF et 10 uM Y-27632 dichlorhydrate dans le volume approprié de les Réensemencement à 30 000 cellules / 10 ul de gouttelettes.
2. Bien sécher préalablement préparé PO / plaques Lam / FN et plaque environ 50-70 gouttes par boîte de 10 cm. Laissez les plats s'élèvent à température ambiante pendant 20-30 min.
3. Ajouter très soigneusement 20 ml/10 cm plat de N2/FGF2/EGF/Y-27632 sans déranger les gouttelettes. Incuber les cellules à 37 ° C.
4. Nourrir les cellules tous les 2-3 jours avec N2/FGF2/EGF.
   Remarque: les cellules NC sont développés ou des passages environ tous les 4-5 jours ou quand ils commencent à s'accumuler dans les gouttelettes.
5. Pour le passage des cellules NC, supprimer le support, wash les cellules une fois avec PBS 1x et ajouter 8 ml accutase/10 cm plat. Incuber pendant 20 min à 37 ° C.
6. Introduire à la pipette les cellules de la plaque à l'aide d'une pipette de 5 ml et transférer dans un tube de 15 ml. Ajouter 6 ml 1x PBS.
7. Faites tourner les cellules pendant 5 min à 114 x g.
8. Remettre en suspension les cellules dans un milieu N2-différenciation supplémenté avec 10 ng / ml de FGF2, 20 ng / ml d'EGF et 10 uM Y-27632, dichlorhydrate afin d'avoir 20 000 cellules/10 ul gouttelette.
9. Réensemencement les cellules dans 10 gouttes de pi sur des plaques PO / Lam / FN secs. Laissez les plats s'élèvent à température ambiante pendant 20-30 min.
10. Ajouter avec précaution 20 ml/10 cm plat de N2/FGF2/EGF/Y-27632. Incuber à 37 ° C.
    Remarque: les cellules NC peuvent être maintenues ou développées pour 2 semaines en tant que population de progéniteurs relativement homogène. Culture plus peut les amener à se différencier en divers types de cellules de la descendance.

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Résultats

Les deux améliorations les plus importantes du protocole R-NC-dessus du protocole MS5-R-CN ¹¹ sont les conditions de différenciation, définies libre-desserte et le raccourcissement global de l'exigence de délai. MS5 cellules nourricières ¹³ sont des cellules murines de moelle osseuse provenant stromales qui ont été présentés à l'appui différenciation neurale de CSEh ^14. HESCs cultivées sur des cellules nourricières MS5 à former des structures épithéliales de faibl...

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Discussion

Pour la différenciation réussie de cellules R-NC de CSEh / hiPSCs les considérations suivantes doivent être prises. Il est essentiel de travailler dans des conditions de culture stériles à tout moment. En particulier, il est important de tester les cultures HPSC pour contamination par des mycoplasmes régulièrement, depuis cette contamination va entraver la différenciation réussie, mais ne peut pas être facilement détecté visuellement dans les cultures HPSC. La différenciation R-NC doit être instauré à l...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco-Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
DMEM/F12	Gibco-Life Technologies	11330-032
Knockout Serum Replacement	Gibco-Life Technologies	10828-028	Lot should be tested
L-Glutamine	Gibco-Life Technologies	25030-081
Penicinlin/Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140-122
MEM minimum essential amino acids solution	Gibco-Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Gibco-Life Technologies	21985-023	toxic
Recombinant human FGF basic (FGF2)	R&D Systems	233-FB-001MG/CF
Knockout DMEM	Gibco-Life Technologies	10829-018
DMEM/F12 powder	Invitrogen	12500-096
Glucose	Sigma	G7021
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
APO human transferrin	Sigma	T1147
Human insulin	Sigma	I2643
Putriscine dihydrochloride	Sigma	P5780
Selenite	Sigma	S5261
Progesterone	Sigma	P8783
Matrigel matrix	BD Biosciences	354234
Poly-L Ornithin hydrobromide	Sigma	P3655
Mouse Laminin-I	R&D Systems	3400-010-01
Fibronectin	BD Biosciences	356008
Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml	Stem Cell Technologies	7013
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300-054
Y-27632 dihydrochloride	Tocris-R&D Systems	1254
LDN193189	Stemgent	04-0074
SB431542	Tocris-R&D Systems	1614
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
BDNF	R&D Systems	248-BD
FGF8	R&D Systems	423-F8
Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)	R&D Systems	464SH
HBSS	Gibco-Life Technologies	14170-112
HEPES	Gibco-Life Technologies	1563-080
Human recombinant EGF	R&D Systems	236EG
gelatin (PBS without Mg/Ca)	in house
Antibodies:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM	Sigma	C6680-100TST	lot should be tested
Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)	Advanced Targeting Systems	AB-N07	lot should be tested
APC rat anti-mIgM	BD Parmingen	550676	lot should be tested
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1	Invitrogen	A21121	lot should be tested
Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)	Santa Cruz	sc-5279	lot should be tested
Material/Equipment:
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)	GlobalStem	GSC-6105M
Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,  pipettes, pipette tips
Glass hematocytometer
Cell culture centrifuge
Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)
Cell culture laminar flow hood with embedded microscope
Cell culture biosafety hood
Cell sorting machine, i.e. MoFlo
Inverted microscope
1 ml TB syringe 27Gx1/2	BD Biosciences	309623
Cell lifter Polyethylene	Corning Incorporated	3008