Derivação sem alimentador de células da crista neural progenitoras pluripotentes humanas de células-tronco

Resumo

Crista neural (CN), as células derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (HPSC) tem um grande potencial para a modelagem de desenvolvimento humano e de doenças e para terapias de substituição celular. Aqui, uma adaptação livre de alimentador do atualmente utilizado In vitro Protocolo de diferenciação para a derivação de células da CN de hPSCs é apresentado.

Resumo

Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) têm um grande potencial para o estudo do desenvolvimento embrionário humano, para a modelagem de doenças humanas no prato e como fonte de células para transplante para aplicações regenerativas após doença ou acidentes. Células da crista neural (NF) são os precursores para uma grande variedade de células somáticas adultas, tais como células do sistema nervoso periférico e as células gliais, os melanócitos e células mesenquimais. Eles são uma valiosa fonte de células para estudar aspectos do desenvolvimento embrionário humano, incluindo a especificação destino e migração celular. Além disso a diferenciação de células progenitoras NC em tipos de células diferenciados terminalmente oferece a possibilidade de modelar doenças humanas in vitro, investigar os mecanismos da doença e para gerar células medicina regenerativa. Este artigo apresenta a adaptação de um protocolo atualmente disponível em vitro de diferenciação para a derivação de células a partir de NC hPSCs. Este novo protocolo requer 18 dias de diferentiation, é, facilmente escalável e altamente reprodutível entre (hiPSC) linhas humana (hESC) linhas de células estaminais embrionárias, bem como humana induzida de células-tronco pluripotentes sem alimentador. Ambos os antigos e novos protocolos de produzir células NC de igual identidade.

Introdução

Células estaminais embrionárias humanas (hESC) e células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) mostraram um imenso potencial, em particular para a investigação e tratamento futuro de doenças humanas para as quais nem bons modelos animais nem tecidos primários estão disponíveis. Exemplos de aplicação para a tecnologia de células estaminais embrionárias humanas / hiPSC são os seguintes: Células de interesse particular podem ser gerados a partir de células estaminais embrionárias humanas / hiPSCs para a medicina regenerativa em quantidade ilimitada ^1. As células podem ser produzidos a partir de pacientes portadores de uma doença específica e utilizado para estabelecer, em modelos de doenças in vitro, ^2,3. Tais modelos de doenças pode ser empregado para a triagem de drogas em grande escala na busca de novos compostos de drogas ^4, bem como testes de drogas existentes para a eficácia e toxicidade ^5. Em modelos de doenças in vitro podem levar à identificação dos mecanismos da doença da novela. Para todas as aplicações da tecnologia de células estaminais embrionárias humanas / iPSC é importante trabalhar com específica, bem definirtipos d célula afetada na doença de interesse. Assim, a disponibilidade de protocolos de diferenciação in vitro sólidos e reprodutíveis é fundamental para todas as aplicações da tecnologia de células estaminais embrionárias humanas / hiPSC. Protocolos são desejáveis ​​que mostram variabilidade mínima, custa tempo, esforço, dificuldade e custo, bem como a reprodutibilidade máxima entre linhas hESC / hiPSC e diferentes pesquisadores.

Crista neural (NF), as células surgem durante neurulação vertebrado entre a epiderme e o epitélio neural. Eles proliferam e migram extensivamente durante todo o desenvolvimento do embrião, dando origem a uma diversidade impressionante de tipos de células descendentes, incluindo o osso / cartilagem, o esqueleto craniofacial, nervos sensoriais, as células de Schwann, os melanócitos, células musculares lisas, neurônios entéricos, os neurônios autonômicos, células cromafins , células do septo cardíaco, dentes e adrenal / tireóide células glandulares ^6. Assim, células de CN são um tipo de célula atraente para o campo de células-tronco e importante para oa modelagem de uma variedade de doenças, tais como a doença de Hirschsprung, ^7, disautonomia familiar ^8, bem como os cancros, tais como o neuroblastoma ^9. Além disso, eles oferecem a possibilidade de estudar os aspectos do desenvolvimento embrionário humano in vitro.

A atualmente disponíveis e amplamente aplicado em protocolo de diferenciação in vitro para a derivação de células da CN de hESCs ^10,11 requer até 35 dias de diferenciação e que envolve indução neural em células alimentadoras, como as células do estroma MS5 e é, portanto, realizadas em condições mal definidas. Embora possa ser em maior escala para gerar grandes quantidades de células da CN, por exemplo necessário para high-throughput screening de drogas ^4, este é o trabalho e onerosa. Além disso, envolve passaging manual das rosetas neurais, que podem ser difíceis de reproduzir e, portanto, é sujeito a variabilidade global, em particular quando é aplicado a uma grande variedade de células estaminais embrionárias humanas, ou hiPSClinhas. Aqui, a derivação gradual de células NC em um protocolo de 18 dias que está livre de células alimentadoras é mostrado. Este método é mais curto e mais definido do que o protocolo usado atualmente. Além disso, ele é muito robusto na geração de células NC entre diferentes linhas hiPSC. Importante, é mostrado que as células NC gerados por ambos os protocolos surgem na fronteira de rosetas neurais (doravante denominado roseta-NC ou R-NC). As células derivadas utilizando um dos dois protocolos olhar morfologicamente idênticos, eles expressam os mesmos marcadores NC e se agrupam em análise de microarray. Células NC derivadas usando o novo protocolo (R-NC) são funcionais, semelhantes às células NC derivados usando o protocolo de idade (MS5-R-NC) de tal forma que eles podem migrar e diferenciar-se em neurónios mais. Portanto, as células podem ser utilizadas simultaneamente com as células MS5-R-NC. O protocolo de células R-NC para a derivação de células a partir de células estaminais embrionárias humanas NC / iPSC será útil para todas as aplicações da tecnologia hESC / iPSC envolvendo a linhagem NC.

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Protocolo

1. Preparação de Meios de Cultura, pratos revestidos e Manutenção de hPSCs

Preparação 1.1 Mídia

Nota: Filtro de todos os meios para a esterilização e armazenar a 4 ° C no escuro por até 2 semanas. Números nomes de reagentes, da empresa e catálogo estão listadas na Tabela de Materiais.

1. DMEM/10% de FBS: Combinar 885 mL de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml de Pen / Strep e 5 ml de L-Glutamina.
2. HES-médio: Combinar 800 mL de DMEM/F12, KSR 200 ml, 5 ml de L-glutamina, 5 mL de Pen / Strep, 10 ml de solução de MEM essencial mínimo de aminoácidos, 1 ml β-mercaptoetanol. Adiciona-se 10 ng / ml de FGF-2, depois de filtrar o meio.
   CUIDADO: β-mercaptoetanol é tóxico, evitar a inalação, ingestão e contato com a pele.
3. Meio KSR diferenciação: Combinar 820 mL Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml de L-Glutamina, 10 ml de Pen / Strep, 10 ml de solução de MEM essencial mínimo de aminoácidos e 1 ml β-mercaptoetanol.
4. N2-differentiatino meio: Dissolve-se 12 g do pó em DMEM/F12 980 mL _{de dH2O,} adicionar 1,55 g de glucose, 2 g de bicarbonato de sódio e 100 mg de APO transferrina humana. Misturar 2 mL _{de dH2O} com 25 mg de insulina humana e 40 mL de NaOH 1 N, adicionar a solução dissolvida ao meio. Adicionar 100 ul de di-hidrocloreto de putrescina, selenito de 60 ul, 100 ul de progesterona e trazer o volume até 1 L com _dH2O

1.2 Revestimento de placas de cultura

1. Revestimento Matrigel: Thaw 1 ml congelado matrigel alíquota pipetando 19 ml DMEM/F12 sobre a alíquota até que se dissolva. Remover aglomerados fazendo-o passar através de um filtro de células de 40 ^ m e placa 8 ml/10 cm de disco. Incubar os pratos durante 1 hora à temperatura ambiente. Aspirar o matrigel imediatamente antes do plaqueamento das células.
   Nota: trabalhar rapidamente com matrigel porque podem aglutinar-se a temperaturas acima de 4 ° C.
2. Revestimento PO / Lam / FN: Adicionam-se 10 ml de 1x PBS contendo 15 ug / ml de bromidrato de poli-L Ornithin para uma placa de 10 cm. Incubar o prato durante a noite a 37 ° C. Lavar as placas com PBS 1x e depois adicionar 10 ml/10 cm de disco de 1x PBS contendo 2 mg / ml de rato laminina-I e 2 ug / ml de fibronectina. Incubar os pratos durante a noite a 37 ° C. Antes de plaqueamento das células, remova completamente a solução e deixe secar completamente as placas à temperatura ambiente durante 15-20 minutos por pé-los para a cultura parede capô do tecido, sem a tampa.
   Nota: Os pratos são completamente seco e pronto para o chapeamento de celular quando pode-se ver as estruturas de cristal na superfície (visível a olho nu). As placas podem ser mantidas à temperatura ambiente durante algumas horas a este estado seco. Pratos PO / Lam / FN tem que estar preparado dois dias antes do tempo. Em casos de emergência Lam / FN pode ser incubada por apenas 2-4 horas. No entanto, isso pode arriscar subótimas resultados diferenciação / sobrevivência.

1.3 Manutenção de hPSCs

Nota: hPSCs são mantidos em 0,1% de gelatina e rato mitoticamente inactivadas fibroblastos embrionários (MFE) em HES meio suplementado com 10 ng / ml de FGF-2, conforme descrito anteriormente ^10,12. As células devem ser divididas a cada 6-8 dias.

1. Revestir uma placa de 10 cm, com 8 ml de gelatina a 0,1% (em 1x PBS sem cálcio ou magnésio), a temperatura ambiente durante 5 min.
2. Descongelar MEFs congeladas rapidamente num banho de água a 37 ° C. Adicionar 1 milhão MEFs para 10 ml DMEM/10% de FBS.
3. Aspirar a gelatina e placa das células. Incubar a 37 ° C durante pelo menos 6 horas.
4. Aspirar o FBS DMEM/10% a partir da placa MEF preparado, lavar placa com 1x PBS uma vez e adicionar 10 ml de HES-meio suplementado com 10 mM Y-27632, dicloridrato. Permitir que o meio para se aquecer a 37 ° C por 20 min.
   Nota: Para a divisão manual hPSCs uma câmara de fluxo laminar com um microscópio incorporado é usado. No entanto, as células podem ser passadas através de métodos alternativos adequados.
5. Dentro de uma câmara de fluxo laminar com um microscópio incorporado, retire colônias separadas usando um levantador de celular e deixá-los flutuar.
6. Use umaSeringa de 1 ml para aspirar as colônias flutuantes e despachá-los para o, placa MEF quente fresco. Transferir cerca de um quarto das células para a nova antena. Incubar a 37 ° C.
7. Alimente células diariamente com meio HES fresco.

2. Chapeamento de hPSCs para Diferenciação

Nota: hPSCs deve ser dividido ou revestida de diferenciação, quando as colônias são grandes, mas ainda tem arestas cortantes com tão pouco como possíveis células diferenciadoras nas suas fronteiras (ver Figura 1B). Quando as células são mantidas através de passagens em manual, as colónias deve ser suficientemente grande para ser facilmente visto pelo olho. Para começar a sentir certo para este ponto do tempo pode-se manter um prato HPSC separado para duas semanas sem passaging e assistir as células alcançar e passar o ponto de tempo ideal para passaging / diferenciá-los.

1. Preparar placas de 10 cm com matrigel 1 h antes de iniciar a diferenciação. Revestimento matrigel bem sucedida pode serverificada com ampliação de 4x.
2. Quando os hPSCs está pronto para ser dividida, aspirar o meio e adicionar 4 ml de 0,05% de tripsina-EDTA para as células.
3. Agite o prato na horizontal por 2 min vigorosamente até que se possa ver os MEFs como células individuais levantando a placa sob o microscópio. As colônias HPSC permanecer anexado como colônias.
4. Imediata e cuidadosamente, aspirar a tripsina e deixar o prato ficar à temperatura ambiente durante 2-4 min.
5. Adicionar 2 ml de HES-meio para a placa e com uma pipeta P1000, separar as células.
   Nota: Se as células não podem ser levantados facilmente para fora da superfície, a placa pode ser incubada vazio à TA por mais 2-3 minutos.
6. Transferir as células a 8 mL de HES-meio suplementado com 10 mM Y-27632, dicloridrato.
7. Aspirar o matrigel a partir de uma previamente preparada placa de 10 cm. Placa as células em uma relação de 1:1 ou 1:2 (por exemplo: as células de uma placa de 10 cm são divididos em duas placas de 10 cm) sobre a placa de matrigel. Incubar a 37 °C durante a noite.
   Nota: Esta camada deve resultar em cerca de 100.000 células / cm ^2.

3. Indução da diferenciação neural

Nota: A diferenciação pode ser iniciado (dia 0), quando as células são 90-100% confluentes (ver Figura 1C), normalmente no dia seguinte. Se a confluência exata ainda não foi alcançado, as células podem ser alimentados diariamente com HES-médio até que estejam prontos para a diferenciação. Alternativamente, o número inicial de células plaqueadas pode ser aumentada.

1. No dia 0-3, as células alimentar diariamente, com 10 ml/10 cm de disco médio KSR diferenciação contendo 0,1 uM e 10 uM LDN193189 SB431542.
2. Nos dias 4 e 5 de alimentação das células com 75% de meio KSR-diferenciação e 25% de meio N2-diferenciação tanto contendo LDN193189 e SB431542.
3. No dia 6 e 7 de alimentos para as células com 50% de médio KSR-diferenciação e 50% médio N2-diferenciação ambos contendo LDN193189 e SB431542.
4. No dia 8 e 9 de alimentação das células com 25% de meio KSR-diferenciação e 75% de meio N2-diferenciação tanto contendo LDN193189 e SB431542.
5. No dia 9 e 10 de preparar pratos PO / Lam / FN, tal como indicado em 1.2.2 por replating das células no dia 11.
6. No dia 10 células de alimentação com meio N2-diferenciação contendo LDN193189 e SB431542.

4. Repique em gotas para Especificação NC

1. No dia 11 aspirado Lam / FN a partir dos pratos previamente preparados e deixá-las secar completamente à temperatura ambiente, durante 20-30 minutos, tal como explicado em 1.2.2.
2. Remova o meio das células em diferenciação, lave as células uma vez com PBS 1x e adicionar 8 mL accutase/10 cm prato. Incubar durante 20 min a 37 ° C.
3. Usando um levantador de celular, separar as células e ressuspender-los em Accutase com uma pipeta de 5 ml. Transferir a suspensão para um tubo de 15 ml.
4. Adicionar 5 ml de PBS 1x e girar as células durante 5 min a 114 x g.
5. Ressuspender as células em 10 ml de 1x PBS. Para garantir uma suspensão única célula, filtrá-los através de um filtro de células 40 mM e contar as células usando um hemocitômetro ou técnica equivalente.
6. Rodar as células para baixo e ressuspender-los em meio N2-diferenciação contendo 200 ^ M do ácido ascórbico (AA), 20 ng / ml de BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / mL de SHH, 10 uM Y-27632, dicloridrato, na concentração de 100 mil -150,000 células/10 jil.
7. Usando um repeat-pipeta, placa 10 gotas ul próximos uns dos outros, sem lhes tocar na PO secos / Lam / FN 15 centímetros pratos.
   Nota: Uma placa de 10 cm de células diferenciadas, normalmente resulta em cerca de 2-3 vezes 15 centímetros de pratos ou de aproximadamente 100 x 10 cm ul droplets/15 prato.
8. Deixe as gotículas repousar à temperatura ambiente durante 20-30 minutos, em seguida, muito cuidadosamente (para não perturbar as gotas) adicionar 30 ml de N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y e incubar a 37 ° C.
9. No dia 12, cuidadosamente alimentar as células com 20 ml/15 cm de disco N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
10. A partir day 14-17 alimentar as células a cada segundo ou terceiro dia com N2/AA/BDNF/FGF8.
11. No dia 16 e 17 de preparar pratos PO / Lam / FN para replate células NC após FACS classificação.

5. Fluorescência celular ativado (FACS) de células NC

Nota: A preparação das células para FACS requer cerca de 2 horas.

1. No dia 18 de meio de remoção, lave as células uma vez com PBS 1x no prato e adicionar 12 ml de Accutase. Incubar as células durante 20 min a 37 ° C.
2. Usando um levantador de célula, separar as células da superfície e deixá-los flutuar. Pipetar as células em suspensão usando uma pipeta de 5 ml, transferi-los para um tubo de 50 ml e adicionar 30 ml de PBS 1x. Rodar as células durante 5 min a 114 x g.
3. Usando uma pipeta P1000, ressuspender as células em 1 ml de 2% de FBS / HBSS (HBSS contém 15 mM de HEPES). Adicionar 19 ml de 2% de FBS / HBSS e filtrar as células através de um coador de células de 40 mM para assegurar uma suspensão de células individuais. Incubar as células em gelo durante 15 min para bloqueio de anticorpos e depois contá-los usando um hemocitômetro.
4. Rodar as células para baixo e ressuspender deles na concentração de 10 milhões de células / ml em 2% de FBS / HBSS.
5. Separe 1 milhão de células cada um para o imaculado, single-coradas (HNK-1 apenas e só p75) e anticorpo secundário manchado apenas (APC só e 488 apenas) FACS controla.
6. Adicionar 5 mL de HNK-1 e 5 uL de anticorpo primário p75 por 10 milhões de células em 1 ml de suspensão apropriados para as amostras e incuba-se durante 20 min em gelo.
7. Lavar as células em 10 ml de PBS 1X (5 min de centrifugação a 114 xg) e ressuspender as células em 1 ml de 2% de FBS / HBSS. Adicionar 2 mL de APC e 1 ml de 488 anticorpo secundário por 10 milhões de células em 1 ml de suspensão apropriados para as amostras e incuba-se durante 20 minutos em gelo no escuro.
   Nota: A APC e 488 são os anticorpos secundários utilizados aqui para a coloração HNK-1 e p75, respectivamente.
8. Lave as células em 10 ml de 1x PBS, duas vezes, ressuspender 10 milhões de células em 500 ul de2% de FBS / HBSS contendo DAPI (a 0,5 ng / mL) ou alternativo da mancha de células vivas adequada para excluir as células mortas da análise de FACS.
9. Transferir as amostras para tubos de FACS apropriar.
10. Prepare os tubos de FACS com 0,5 ml de 2% FBS / HBSS para coleta de células.
    Nota: As células e tubos de coleta são mantidos em gelo, no escuro, durante o tempo de classificação.
11. Usando uma máquina de classificação de células com lasers que podem detectar DAPI, APC e 488 tipo DAPI-/HNK-1 + / P75 + células positivas duplas.
    Nota: o tempo e manipulação das células Preparação leva a uma pequena percentagem de morte celular, DAPI manchas células mortas e, assim, permite que apenas a estas células a ser excluídos da população classificada. Qualquer mancha vivo / morto alternativa funciona igualmente bem para esta finalidade. O próprio DAPI não provocar citotoxicidade na população de células vivas.

6. Repique de células classificadas, NC Manutenção e Expansão

Nota: células FACS classificadas deve ser mãolevou com cuidado especial para garantir a sobrevivência ideal. Mantenha-os no gelo até repique eles. Não vórtice ou pipeta-los duramente. As células podem ser ressuspendidas sacudindo o tubo.

1. Após separação FACS, contar as células de CN, em seguida, colocá-los para baixo e ressuspender em meio N2-diferenciação suplementado com 10 ng / mL de FGF2, 20 ng / mL de EGF e 10 uM dicloridrato Y-27632 no volume apropriado para replate los em 30.000 células / 10 gotas ul.
2. Completamente seco previamente preparado PO / placas Lam / FN ea placa de aproximadamente 50-70 gotas por 10 centímetros prato. Deixe os pratos repousar à temperatura ambiente durante 20-30 min.
3. Adicionar muito cuidado 20 ml/10 cm prato de N2/FGF2/EGF/Y-27632 sem perturbar as gotas. Incubar as células a 37 ° C.
4. Alimentar as células a cada 2-3 dias com N2/FGF2/EGF.
   Nota: células NC são expandidos ou repicadas aproximadamente a cada 4-5 dias ou quando eles começam a se acumulando dentro das gotículas.
5. Para a passagem das células NC, retire o meio, wash as células uma vez com PBS 1x e adicionar 8 mL accutase/10 cm prato. Incubar durante 20 min a 37 ° C.
6. Pipetar as células para fora da placa com uma pipeta de 5 ml, e transferi-los para um tubo de 15 ml. Adicionar 6 ml de 1x PBS.
7. Rodar as células durante 5 min a 114 x g.
8. Ressuspender as células em meio N2-diferenciação suplementadas com 10 ng / mL de FGF2, 20 ng / mL de EGF e 10 uM Y-27632, dicloridrato, a fim de ter 20000 células/10 ul gota.
9. Replate as células em 10 gotas ul em placas de PO / Lam / FN secas. Deixe os pratos repousar à temperatura ambiente durante 20-30 min.
10. Adicione cuidadosamente 20 ml/10 cm prato de N2/FGF2/EGF/Y-27632. Incubar a 37 ° C.
    Nota: células NC pode ser mantido ou ampliado por até 2 semanas, como uma população progenitor relativamente homogênea. Cultura já pode levá-los a se diferenciar em vários tipos de células descendentes.

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Resultados

As duas melhorias mais importantes do protocolo R-NC sobre o protocolo MS5-R ^NC-11, são as condições de diferenciação definidos isentos de alimentação e a redução global do requisito de tempo. Células alimentadoras MS5 ¹³ são da medula óssea células estromais derivadas de ratinho que foram mostrados para apoiar a diferenciação neural de hESCs ^14. HESCs cultivadas em células alimentadoras MS5 em estruturas de baixa densidade forma epiteliais e rosetas neurais ^15,

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Discussão

Para a diferenciação de células bem sucedida R-NC a partir de células estaminais embrionárias humanas / hiPSCs as seguintes considerações devem ser feitas. É crítico para o trabalho sob condições de cultura estéril em todos os momentos. Em particular, é importante testar culturas HPSC de contaminação por micoplasma regular, uma vez que esta contaminação irá dificultar a diferenciação com êxito, mas não pode ser facilmente detectada visualmente em culturas HPSC. A diferenciação de R-NC deve ser in...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco-Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
DMEM/F12	Gibco-Life Technologies	11330-032
Knockout Serum Replacement	Gibco-Life Technologies	10828-028	Lot should be tested
L-Glutamine	Gibco-Life Technologies	25030-081
Penicinlin/Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140-122
MEM minimum essential amino acids solution	Gibco-Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Gibco-Life Technologies	21985-023	toxic
Recombinant human FGF basic (FGF2)	R&D Systems	233-FB-001MG/CF
Knockout DMEM	Gibco-Life Technologies	10829-018
DMEM/F12 powder	Invitrogen	12500-096
Glucose	Sigma	G7021
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
APO human transferrin	Sigma	T1147
Human insulin	Sigma	I2643
Putriscine dihydrochloride	Sigma	P5780
Selenite	Sigma	S5261
Progesterone	Sigma	P8783
Matrigel matrix	BD Biosciences	354234
Poly-L Ornithin hydrobromide	Sigma	P3655
Mouse Laminin-I	R&D Systems	3400-010-01
Fibronectin	BD Biosciences	356008
Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml	Stem Cell Technologies	7013
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300-054
Y-27632 dihydrochloride	Tocris-R&D Systems	1254
LDN193189	Stemgent	04-0074
SB431542	Tocris-R&D Systems	1614
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
BDNF	R&D Systems	248-BD
FGF8	R&D Systems	423-F8
Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)	R&D Systems	464SH
HBSS	Gibco-Life Technologies	14170-112
HEPES	Gibco-Life Technologies	1563-080
Human recombinant EGF	R&D Systems	236EG
gelatin (PBS without Mg/Ca)	in house
Antibodies:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM	Sigma	C6680-100TST	lot should be tested
Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)	Advanced Targeting Systems	AB-N07	lot should be tested
APC rat anti-mIgM	BD Parmingen	550676	lot should be tested
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1	Invitrogen	A21121	lot should be tested
Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)	Santa Cruz	sc-5279	lot should be tested
Material/Equipment:
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)	GlobalStem	GSC-6105M
Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,  pipettes, pipette tips
Glass hematocytometer
Cell culture centrifuge
Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)
Cell culture laminar flow hood with embedded microscope
Cell culture biosafety hood
Cell sorting machine, i.e. MoFlo
Inverted microscope
1 ml TB syringe 27Gx1/2	BD Biosciences	309623
Cell lifter Polyethylene	Corning Incorporated	3008