Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

Resumen

Las células de la cresta neural (NC) derivadas de células madre pluripotentes humanas (HPSC) tienen un gran potencial para modelar el desarrollo humano y las enfermedades y para las terapias de reemplazo celular. Aquí, una adaptación libre del alimentador ampliamente utilizado en la actualidad In vitro Protocolo de diferenciación para la derivación de células NC de hPSCs se presenta.

Resumen

Células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen un gran potencial para el estudio de desarrollo embrionario humano, para el modelado de enfermedades humanas en el plato y como una fuente de células trasplantables para aplicaciones de regeneración después de la enfermedad o accidentes. Células de la cresta neural (NC) son los precursores para una gran variedad de células somáticas adultas, tales como células del sistema nervioso periférico y glía, melanocitos y células mesenquimales. Ellos son una valiosa fuente de células para estudiar aspectos del desarrollo embrionario humano, incluida la especificación del destino celular y la migración. Además diferenciación de las células progenitoras NC en tipos de células diferenciadas terminalmente ofrece la posibilidad de modelar enfermedades humanas in vitro, investigar mecanismos de la enfermedad y generar células para la medicina regenerativa. En este artículo se presenta la adaptación de un protocolo vitro disponibles actualmente en la diferenciación para la derivación de células NC desde hPSCs. Este nuevo protocolo requiere 18 días de diferenciación, es-alimentador libre, fácilmente escalable y altamente reproducible entre células madre embrionarias humanas (hESC) líneas, así como células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) líneas. Ambos viejos y nuevos protocolos producen células NC de igual identidad.

Introducción

Las células madre embrionarias (células madre) y las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) han demostrado un enorme potencial, en particular para la investigación y el tratamiento futuro de enfermedades humanas para las que están disponibles ni los buenos modelos animales ni los tejidos primarios. Ejemplos de aplicación de la tecnología de células madre / hiPSC son los siguientes: Las células de especial interés pueden ser generados a partir de células madre / hiPSCs para la medicina regenerativa en cantidad ilimitada ^1. Las células pueden producirse a partir de pacientes portadores de una enfermedad específica y se utiliza para establecer en modelos de enfermedad in vitro ^2,3. Tales modelos de enfermedad pueden ser empleados para la detección de drogas a gran escala en la búsqueda de nuevos compuestos farmacológicos ^4, así como las pruebas de los medicamentos existentes para la eficacia y la toxicidad ^5. Modelos in vitro de enfermedades pueden conducir a la identificación de los mecanismos de las enfermedades nuevas. Para todas las aplicaciones de la tecnología de células madre / IPSC es importante trabajar con específica, bien definirtipos d células afectadas en la enfermedad de interés. Por lo tanto, la disponibilidad de protocolos de diferenciación in vitro sólidas y reproducibles en es crucial para todas las aplicaciones de la tecnología de células madre / hiPSC. Los protocolos son deseables que muestran una variabilidad mínima, gasto de tiempo, esfuerzo, dificultad y costo, así como la reproducibilidad máxima entre las líneas de células madre / hiPSC y diferentes investigadores.

Las células de la cresta neural (NC) emergen durante neurulation vertebrados entre la epidermis y el epitelio neural. Ellos proliferan y migran ampliamente en todo el embrión en desarrollo y dan lugar a una impresionante diversidad de tipos de células progenie, incluyendo el hueso / cartílago, el esqueleto craneofacial, los nervios sensoriales, las células de Schwann, melanocitos, células de músculo liso, las neuronas entéricas, las neuronas autónomas, células cromafines , células cardiacas tabique, los dientes y las células glandulares suprarrenal / tiroideas ^6. Por lo tanto, las células NC son un tipo de célula atractivo para el campo de células madre e importante para lamodelización de una variedad de enfermedades, como la enfermedad de Hirschsprung ^7, disautonomía familiar ^8, así como cánceres tales como el neuroblastoma ^9. Además, ofrecen la posibilidad de estudiar los aspectos del desarrollo embrionario humano in vitro.

El actualmente disponibles y ampliamente aplicado en protocolo de diferenciación in vitro para la derivación de células NC de hESCs ^10,11 requiere hasta 35 días de diferenciación y que implica la inducción neural en células alimentadoras tales como células del estroma MS5 y por lo tanto se lleva a cabo bajo condiciones de mal definidos. Si bien puede ser en mayor escala para generar grandes cantidades de células NC, por ejemplo se requiere para la detección de drogas de alto rendimiento ^4, se trata de mano de obra y costos de obra. Además, se trata de pases manual de las rosetas de los nervios, que pueden ser difíciles de reproducir y por lo tanto está sujeta a la variabilidad general, en particular cuando se aplica a una gran variedad de células madre o hiPSClíneas. Aquí, se muestra la derivación gradual de células NC en un protocolo de 18 días que está libre de células alimentadoras. Este método es más corto y más definido que el protocolo utilizado actualmente. Además, es muy robusto en la generación de células NC entre diferentes líneas hiPSC. Es importante destacar que se ha demostrado que las células NC producidas por ambos protocolos surgen en la frontera de los rosetones de los nervios (en lo sucesivo denominado roseta-NC o R-NC). Las células derivadas utilizando cualquiera de los dos protocolos parecen morfológicamente idénticas, expresan los mismos marcadores NC y se agrupan en el análisis de microarrays. NC células derivadas usando el nuevo protocolo (R-NC) son funcionales, similar a las células derivadas NC usando el protocolo antiguo (MS5-R-NC) tal que pueden migrar y diferenciarse en neuronas más. Por lo tanto, las células se pueden utilizar simultáneamente con las células MS5-R-NC. El protocolo de células R-NC para la derivación de células NC de células madre / IPSC será útil para todas las aplicaciones de la tecnología de células madre / IPSC que implica el linaje NC.

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Protocolo

1. Preparación de medios de cultivo, placas revestidas y Mantenimiento de hPSCs

Preparación 1.1 Medios

Nota: todos los medios de filtro para la esterilización y se almacenan a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de 2 semanas. Números de los nombres de Reactivos para la empresa y catálogo se listan en la Tabla de Materiales.

1. DMEM/10% de SFB: Combinar 885 ml DMEM, FBS 100 ml, 10 ml penicilina / estreptomicina y 5 ml de L-glutamina.
2. HES-medio: Combinar 800 ml de DMEM/F12, KSR 200 ml, 5 ml de L-glutamina, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 10 ml de MEM mínimo de solución aminoácidos esenciales, 1 ml β-mercaptoetanol. Añadir 10 ng / ml de FGF-2 después de filtrar el medio.
   PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es tóxico, evitar la inhalación, ingestión y contacto con la piel.
3. Medio KSR-diferenciación: Combinar 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml de L-glutamina, 10 ml penicilina / estreptomicina, 10 ml MEM mínima solución aminoácidos esenciales y 1 ml β-mercaptoetanol.
4. N2-differentiatien un medio: Disolver 12 g de polvo en 980 ml ​​de DMEM/F12 dH ₂ O, añadir 1,55 g de glucosa, 2 g Bicarbonato sódico y 100 mg APO transferrina humana. Mezclar 2 ml de _dH2O con 25 mg de insulina humana y 40 l de NaOH 1 N, añadir la solución disuelta para el medio. Añadir 100 l de dihidrocloruro de putrescina, 60 l de selenito, 100 l progesterona y llevar el volumen hasta 1 litro con dH ₂ O.

1.2 Recubrimiento de placas de cultivo

1. Revestimiento Matrigel: Descongelar 1 ml congelados alícuota matrigel al vaso 19 ml DMEM/F12 sobre la alícuota hasta que se haya disuelto. Eliminar grumos haciéndola pasar a través de un filtro de células de 40 micras y la placa 8 ml/10 cm plato. Incubar los platos durante 1 hora a TA. Aspirar el matrigel inmediatamente antes placas las células.
   Nota: Trabaje rápidamente con matrigel porque puede agruparse a temperaturas superiores a 4 ° C.
2. Recubrimiento PO / Lam / FN: Añadir 10 ml de 1x PBS que contenía 15 mg / ml bromhidrato de poli-L ornitina a una placa de 10 cm. Incubar la placa durante la noche a 37 ° C. Lavar las placas con PBS 1x vez y añadir 10 ml/10 cm plato de 1x PBS que contenía 2 mg / ml ratón laminina-I y 2 mg / ml de fibronectina. Incubar los platos durante la noche a 37 ° C. Antes de placas las células, eliminar completamente la solución y deje que los platos se sequen completamente a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos en pie para arriba en la pared campana de cultivo de tejidos sin la tapa puesta.
   Nota: Los platos son completamente seca y lista para la siembra celular cuando uno puede ver las estructuras de cristal en la superficie (visible a simple vista). Las placas se pueden mantener a temperatura ambiente durante unas pocas horas en este estado seco. Platos PO / Lam / FN tienen que estar preparados 2 días antes de tiempo. En casos de emergencia Lam / FN puede incubarse por tan solo 2-4 horas. Sin embargo, esto puede poner en riesgo los resultados de la diferenciación / supervivencia subóptimos.

1.3 Mantenimiento de hPSCs

Nota: hPSCs se mantienen en el 0,1% de gelatina y el ratón mitóticamente inactivados fibroblastos embrionarios (MEFS) en HES-medio suplementado con 10 ng / ml de FGF-2 como se describe previamente ^10,12. Las células deben dividirse cada 6-8 días.

1. Escudo un plato de 10 cm con 8 ml de 0,1% de gelatina (en 1x PBS sin magnesio o calcio) a TA durante 5 min.
2. Descongele MEFs congelados rápidamente en un baño de agua a 37 ° C. Añadir 1 millón de MEFs a 10 ml de DMEM/10% de FBS.
3. Aspirar la gelatina y la placa de las células. Incubar a 37 ° C durante al menos 6 horas.
4. Aspirar el FBS DMEM/10% de la placa de MEF preparado, lavar la placa con 1x PBS una vez y añadir 10 ml de HES-medio suplementado con 10 mM de Y-27632 dihidrocloruro. Dejar que el medio se caliente a 37 ° C durante 20 min.
   Nota: Para la división manual hPSCs se utiliza una campana de flujo laminar con un microscopio incorporado. Sin embargo, las células pueden ser pasadas utilizando métodos alternativos apropiados.
5. Bajo una campana de flujo laminar con un microscopio incorporado, separar colonias separadas de utilizar una grúa móvil y permiten flotar.
6. Utilice un1 ml jeringa para aspirar las colonias flotantes y enviarlos a la placa MEF fresco, cálido. Transferir aproximadamente un cuarto de las células para el nuevo plato. Se incuba a 37 ° C.
7. Alimente células diariamente con medio HES fresco.

2. Plating de hPSCs de Diferenciación

Nota: hPSCs deben dividir o chapada de diferenciación cuando las colonias son grandes, pero todavía tienen bordes afilados con tan poco como posibles células que se diferencian en sus fronteras (véase la Figura 1B). Cuando las células se mantienen utilizando pases manual de las colonias deben ser lo suficientemente grandes para ser fácilmente visto por el ojo. Para conseguir la sensación adecuada para este punto en el tiempo se puede mantener un plato HPSC separada por dos semanas sin pases y ver las células alcanzan y pasar el punto de tiempo ideal para pases / diferenciarlas.

1. Preparar platos de 10 cm con matrigel 1 hora antes de iniciar la diferenciación. Revestimiento de matrigel acertada puede serverificado en la magnificación de 4x.
2. Cuando los hPSCs están listos para ser dividido, aspirar el medio y añadir 4 ml de 0,05% de tripsina-EDTA a las células.
3. Agite el plato horizontalmente durante 2 min vigorosamente hasta que uno puede ver los MEFs como células individuales de elevación de la placa bajo el microscopio. Las colonias HPSC permanecen unidos como colonias.
4. Inmediatamente ya fondo, aspirar la tripsina y dejar reposar la placa a temperatura ambiente durante 2-4 min.
5. Añadir 2 ml de HES-medio a la placa y el uso de una pipeta P1000, separar las células.
   Nota: Si las células no se pueden levantar fácilmente la superficie, la placa se puede incubar vacío a TA durante otros 2-3 min.
6. Transferir las células a 8 ml de HES-medio suplementado con 10 mM de Y-27632 dihidrocloruro.
7. Aspirar el Matrigel a partir de un preparado previamente placa de 10 cm. Placa las células a una proporción de 1:1 o 1:2 (por ejemplo: Las células de una placa de 10 cm se dividen en dos placas de 10 cm) en la placa de Matrigel. Incubar a 37 °C durante la noche.
   Nota: Este chapado debe dar lugar a aproximadamente 100.000 células / cm ^2.

3. La inducción de la diferenciación neuronal

Nota: La diferenciación puede ser iniciado (día 0) cuando las células son confluentes al 90-100% (véase la Figura 1C), por lo general el día siguiente. Si la confluencia exacta no se alcanza, sin embargo, las células pueden ser alimentados diariamente con HES-medio hasta que estén listos para la diferenciación. Alternativamente, el número inicial de células sembradas se puede aumentar.

1. En el día 0 a 3, alimentar a las células diariamente con 10 ml/10 cm plato medio KSR-diferenciación que contiene 0,1 LDN193189 mu M y 10 M SB431542.
2. En el día 4 y 5 de alimentación de las células con 75% de medio KSR-diferenciación y 25% medio N2-diferenciación tanto que contiene LDN193189 y SB431542.
3. En el día 6 y 7 de alimentación de las células con 50% de medio KSR-diferenciación y 50% medio N2-diferenciación tanto que contiene LDN193189 y SB431542.
4. En el día 8 y 9 de alimentación de las células con 25% de medio KSR-diferenciación y 75% medio N2-diferenciación tanto que contiene LDN193189 y SB431542.
5. El día 9 y 10 se preparan platos PO / Lam / FN, como se indica en el punto 1.2.2 para replating de las células en el día 11.
6. El día 10 las células de alimentación con medio N2-diferenciación que contiene LDN193189 y SB431542.

4. Replating en Gotitas por NC Especificaciones

1. El día 11 de aspirado Lam / FN de las placas preparadas con anterioridad y deje que se sequen por completo a temperatura ambiente durante 20 a 30 min, como se explica en el punto 1.2.2.
2. Retire medio de las células diferenciadoras, se lavan las células una vez con PBS 1x y añadir 8 ml accutase/10 cm plato. Incubar durante 20 minutos a 37 ° C.
3. Utilizando un elevador de celular, separar las células y resuspender en accutase con una pipeta de 5 ml. Transferir la suspensión a un tubo de 15 ml.
4. Añadir 5 ml de 1x PBS y girar las células durante 5 min a 114 x g.
5. Resuspender las células en 10 ml de 1x PBS. Para garantizar una única suspensión de células, filtrado a través de un filtro de células de 40 micras y contar las células usando un hemocitómetro o una técnica equivalente.
6. Girar las células hacia abajo y volver a suspender en medio N2-diferenciación que contiene 200 mM de ácido ascórbico (AA), 20 ng / ml de BDNF, 100 ng / ml de FGF8, 20 ng / ml de SHH, 10 mM de Y-27632 de dihidrocloruro a la concentración de 100 000 -150.000 células/10 l.
7. Usando una pipeta de repetición-, placa 10 l gotitas cerca uno del otro sin que toquen a la PO seca / Lam / FN 15 cm de platos.
   Nota: Una placa de 10 cm de células diferenciadas que normalmente se traduce en aproximadamente 2-3 veces 15 cm de platos o de aproximadamente 100 x 10 cm l droplets/15 plato.
8. Deje que las gotitas de pie a temperatura ambiente durante 20 a 30 min, luego con mucho cuidado (no molestar a las gotas) añadir 30 ml de N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y y se incuba a 37 ° C.
9. El día 12, se alimentan con cuidado las células con 20 ml/15 cm N2/AA/BDNF/FGF8/SHH plato.
10. De day 14-17 alimentar las células cada dos o tres días con N2/AA/BDNF/FGF8.
11. El día 16 y 17 de la preparación / placas Lam / FN PO a replate NC células después de la separación FACS.

5. Fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) de células NC

Nota: La preparación de las células para FACS requiere aproximadamente 2 horas.

1. El día 18 a medio quitar, lavar las células una vez con PBS 1x en el plato y añadir 12 ml accutase. Se incuban las células durante 20 min a 37 ° C.
2. Utilizando un elevador de celular, separar las células de la superficie y permiten flotar. Pipetear las células en suspensión utilizando una pipeta de 5 ml, transferir a un tubo de 50 ml y añadir 30 ml de PBS 1x. Haga girar las células durante 5 minutos a 114 x g.
3. Usando una pipeta P1000, resuspender las células en 1 ml de 2% de FBS / HBSS (el HBSS contiene 15 mM de HEPES). Añadir 19 ml de 2% de FBS / HBSS y filtrar las células a través de un filtro de células de 40 micras para asegurar una suspensión de células individuales. Se incuban las células en hielo durante 15 men para el bloqueo de anticuerpos y luego contarlos utilizando un hemocitómetro.
4. Girar las células hacia abajo y resuspender a la concentración de 10 millones de células / ml en FBS al 2% / HBSS.
5. Ponga a un lado 1 millón de células cada uno por la mancha, de un solo manchado (HNK-1 sólo y únicamente p75) y anticuerpo secundario manchado solamente (APC solamente y 488 solamente) FACS controla.
6. Añadir 5 l de HNK-1 y 5 l de p75 anticuerpo primario por 10 millones de células en 1 ml de suspensión a las muestras adecuadas y se incuba durante 20 min en hielo.
7. Lavar las células en 10 ml de PBS 1x (centrífuga 5 min a 114 xg) y resuspender las células en 1 ml de 2% de FBS / HBSS. Añadir 2 l de APC y 1 l de anticuerpo secundario 488 por 10 millones de células en 1 ml de suspensión a las muestras adecuadas y se incuba durante 20 min en hielo en la oscuridad.
   Nota: APC y 488 son los anticuerpos secundarios utilizados aquí para la tinción HNK-1 y p75, respectivamente.
8. Se lavan las células en 10 ml de 1x PBS dos veces, volver a suspender 10 millones de células en 500 l de2% de FBS / HBSS que contenía DAPI (a 0,5 ng / l) o tinción de células alternativa apropiada en vivo para excluir las células muertas del análisis FACS.
9. Transferir las muestras de apropiarse tubos de FACS.
10. Preparar tubos de FACS con 0,5 ml de FBS al 2% / HBSS para la recolección de células.
    Nota: Las células y los tubos de recogida se mantienen en hielo en la oscuridad durante el tiempo de clasificación.
11. Usando una máquina de clasificación de células con rayos láser que pueden detectar DAPI, APC y 488 especie DAPI-/HNK-1 + / P75 + células dobles positivas.
    Nota: El tiempo de preparación y la manipulación de las células conduce a un pequeño porcentaje de muerte celular, DAPI manchas células muertas sólo por lo que permite a estas células para ser excluidos de la población ordenada. Cualquier mancha en vivo / muerto alternativa funciona igual de bien para este propósito. DAPI en sí no causa citotoxicidad en la población de células vivas.

6. Replating de células clasificadas, Mantenimiento NC y Expansión

Nota: las células FACS ordenados deben ser parteconducido con especial cuidado para asegurar la supervivencia óptima. Manténgalos en hielo hasta resiembra ellos. No agite ni pipetear con dureza. Las células se pueden resuspendieron accionando el tubo.

1. Después de la separación FACS, contar las células NC, a continuación, girar hacia abajo y resuspender en medio N2-diferenciación suplementado con 10 ng / ml de FGF2, 20 ng / ml de EGF y 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 en el volumen apropiado para replate ellos en 30.000 células / 10 gotas mu l.
2. Seque bien previamente preparado / placas Lam / FN PO y placa aproximadamente 50 a 70 gotas por placa de 10 cm. Deje que los platos se destacan a temperatura ambiente durante 20 a 30 min.
3. Añadir mucho cuidado 20 ml/10 cm plato de N2/FGF2/EGF/Y-27632 sin molestar a las gotas. Se incuban las células a 37 ° C.
4. Alimentar a las células cada 2-3 días con N2/FGF2/EGF.
   Nota: NC células se expanden o se pasaron aproximadamente cada 4-5 días o cuando empiezan a acumular dentro de las gotitas.
5. Para el paso de las células NC, eliminar el medio, wash las células una vez con PBS 1x y añadir 8 ml accutase/10 cm plato. Incubar durante 20 minutos a 37 ° C.
6. Pipetear las células de la placa usando una pipeta de 5 ml y transferir a un tubo de 15 ml. Añadir 6 ml 1x PBS.
7. Haga girar las células durante 5 minutos a 114 x g.
8. Resuspender las células en medio N2-diferenciación suplementado con 10 ng / ml de FGF2, 20 ng / ml de EGF y 10 mM de dihidrocloruro de Y-27632 con el fin de tener 20.000 células/10 l gotita.
9. Replate las células en 10 gotas mu l en placas de PO / Lam / FN secas. Deje que los platos se destacan a temperatura ambiente durante 20 a 30 min.
10. Añadir con cuidado 20 ml/10 cm plato de N2/FGF2/EGF/Y-27632. Se incuba a 37 ° C.
    Nota: NC células pueden mantenerse o ampliarse hasta por 2 semanas como progenitoras población relativamente homogénea. Cultura ya puede llevarlos a diferenciarse en diversos tipos de células progenie.

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Resultados

Las dos mejoras más importantes del protocolo R-NC a través del protocolo MS5-R-NC ¹¹ son las condiciones de diferenciación, definidos libres de alimentador y el acortamiento general del requisito de tiempo. Células alimentadoras MS5 ¹³ son de médula ósea células del estroma derivadas murinas que han sido mostrados para apoyar la diferenciación neural de hESCs ^14. Células madre embrionarias humanas cultivadas sobre células alimentadoras MS5 en estructuras de baja densidad de fo...

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Discusión

Para la diferenciación de las células exitosa R-NC de células madre / hiPSCs deben hacerse las siguientes consideraciones. Es fundamental trabajar en condiciones de cultivo estériles en todo momento. En particular, es importante para poner a prueba las culturas HPSC para contaminación por micoplasma regularmente, ya que esto impedirá la contaminación diferenciación exitosa, pero no puede fácilmente ser detectado visualmente en cultivos de HPSC. La diferenciación R-NC debe iniciarse con la densidad celular 90-1...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco-Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
DMEM/F12	Gibco-Life Technologies	11330-032
Knockout Serum Replacement	Gibco-Life Technologies	10828-028	Lot should be tested
L-Glutamine	Gibco-Life Technologies	25030-081
Penicinlin/Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140-122
MEM minimum essential amino acids solution	Gibco-Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Gibco-Life Technologies	21985-023	toxic
Recombinant human FGF basic (FGF2)	R&D Systems	233-FB-001MG/CF
Knockout DMEM	Gibco-Life Technologies	10829-018
DMEM/F12 powder	Invitrogen	12500-096
Glucose	Sigma	G7021
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
APO human transferrin	Sigma	T1147
Human insulin	Sigma	I2643
Putriscine dihydrochloride	Sigma	P5780
Selenite	Sigma	S5261
Progesterone	Sigma	P8783
Matrigel matrix	BD Biosciences	354234
Poly-L Ornithin hydrobromide	Sigma	P3655
Mouse Laminin-I	R&D Systems	3400-010-01
Fibronectin	BD Biosciences	356008
Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml	Stem Cell Technologies	7013
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300-054
Y-27632 dihydrochloride	Tocris-R&D Systems	1254
LDN193189	Stemgent	04-0074
SB431542	Tocris-R&D Systems	1614
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
BDNF	R&D Systems	248-BD
FGF8	R&D Systems	423-F8
Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)	R&D Systems	464SH
HBSS	Gibco-Life Technologies	14170-112
HEPES	Gibco-Life Technologies	1563-080
Human recombinant EGF	R&D Systems	236EG
gelatin (PBS without Mg/Ca)	in house
Antibodies:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM	Sigma	C6680-100TST	lot should be tested
Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)	Advanced Targeting Systems	AB-N07	lot should be tested
APC rat anti-mIgM	BD Parmingen	550676	lot should be tested
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1	Invitrogen	A21121	lot should be tested
Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)	Santa Cruz	sc-5279	lot should be tested
Material/Equipment:
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)	GlobalStem	GSC-6105M
Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,  pipettes, pipette tips
Glass hematocytometer
Cell culture centrifuge
Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)
Cell culture laminar flow hood with embedded microscope
Cell culture biosafety hood
Cell sorting machine, i.e. MoFlo
Inverted microscope
1 ml TB syringe 27Gx1/2	BD Biosciences	309623
Cell lifter Polyethylene	Corning Incorporated	3008