Ф-бесплатно Вывод нервного гребня клеток-предшественников из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Резюме

Нервного гребня (NC) клетки, полученные из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (HPSC) имеют большой потенциал для моделирования человеческого развития и болезни, а также для замены клеток терапии. Здесь фидерных вольное переложение настоящее время широко используется В пробирке Дифференциация протокол для вывода ЧПУ клеток из hPSCs представлена.

Аннотация

Человека плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) имеют большой потенциал для изучения эмбрионального развития человека, для моделирования болезней человека в блюдо и в качестве источника для трансплантации клеток для регенеративной приложений после болезни или несчастного случая. Нервного гребня (NC) клетки являются предшественниками для большого разнообразия взрослых соматических клеток, таких как клетки из периферической нервной системы и глии, меланоцитов и мезенхимальных клеток. Они являются ценным источником клеток для изучения аспектов эмбрионального развития человека, в том числе спецификации клеточных судеб и миграции. Далее дифференциация клеток-предшественников ЧПУ в терминально дифференцированных типов клеток дает возможность моделировать заболевания человека в пробирке, расследовать механизмов болезни и генерировать клетки для регенеративной медицины. Эта статья представляет адаптацию имеющихся в настоящее время в пробирке дифференциации протокола для вывода ЧПУ клеток из hPSCs. Этот новый протокол требует 18 дней Differentiation, является фидерных бесплатно, легко масштабируемой и легко воспроизводимым среди человеческой эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) линий, а также человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) линий. И старые, и новые протоколы дают NC клетки равной идентичности.

Введение

Эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК) и человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) показали огромный потенциал, в частности, для исследования и дальнейшего лечения болезней человека, для которого ни хорошие модели на животных, ни первичные ткани доступны. Примеры применения для технологии чЭСК / hiPSC являются: Клетки особый интерес могут быть получены из чЭСК / hiPSCs для регенеративной медицины в неограниченном количестве ^1. Клетки могут быть получены от пациентов, несущих конкретного заболевания и используется для установления в пробирке моделей заболеваний ^2,3. Такие модели болезни затем могут быть использованы для крупномасштабного скрининга лекарственных средств в поисках новых лекарственных соединений ^4, а также тестирования существующих препаратов для эффективности и токсичности ^5. В пробирке модели болезнь может привести к идентификации механизмов новых заболеваний. Для всех применений технологии чЭСК / IPSC важно работать с конкретными, хорошо определитьтипы г клеток, пострадавших в болезни интересов. Таким образом, наличие твердых и воспроизводимых в пробирке протоколов дифференцировки имеет решающее значение для всех применений технологии чЭСК / hiPSC. Протоколы являются желательно, чтобы показать минимальный изменчивости, расхода времени, усилий сложность и стоимость, а также максимальное воспроизводимость среди чЭСК / hiPSC линий и различных исследователей.

Нервного гребня (NC) клетки появляются во позвоночных нейруляции между эпидермисом и нервной эпителия. Они размножаются и мигрируют по разным странам во развивающегося эмбриона и привести к впечатляющим разнообразием типов потомство клеток, в том числе кости / хряща, черепно-лицевой скелет, чувствительных нервов, клеток Шванн, меланоцитов, клеток гладкой мускулатуры, кишечных нейронов, вегетативные нейроны, хромаффинных клеток , сердечные перегородки клетки, зубы и надпочечников / щитовидной железы железистые клетки ^6. Таким образом, NC клетки привлекательным типом клеток в поле стволовой клетки и важен длямоделирование различных заболеваний, таких как болезнь Гиршпрунга ^7, семейного Dysautonomia ^8, а также рака, таких как нейробластома ^9. Кроме того, они предлагают возможность изучать аспекты эмбрионального развития человека в пробирке.

В настоящее время доступны и широко применяется в пробирке протокола дифференцирования выводе NC клеток из ЭСК ^10,11 требуется до 35 дней дифференциации, и оно включает нейронной индукцию по стромальных клеток-фидеров, таких как MS5 клеток и, таким образом, выполняется под плохо определенных условиях. Хотя это может быть до масштабных генерировать большое количество NC клеток, например, необходимого для высокопроизводительного скрининга наркотиков ^4, это труд и дорогостоящим. Кроме того, оно требует ручного пассирования нейронных розетками, которые могут быть трудно воспроизвести и, таким образом, подлежит общей изменчивости, в частности, когда он применяется к большим разнообразием чЭСК или hiPSCлинии. Здесь, ступенчато вывод NC клеток в 18-дневной протокола, который свободен от фидерных клеток показана. Этот метод является короче и более определенным, чем используемый в настоящее время протокола. Кроме того, он очень надежен в создании NC клетки по различным статьям hiPSC. Важно отметить, что было показано, что клетки NC, полученных в результате обоих протоколов возникают на границе нейронных розетками (далее называется розетка-NC или R-NC). Клетки, полученные с помощью одного из двух протоколов выглядят морфологически идентичны, они выражают те же маркеры ЧПУ и кластер вместе в микрочипов анализа. NC клетки, полученные с помощью нового протокола (R-NC) функциональны, как и NC клеток, полученных с помощью старого протокола (MS5-R-NC), что они могут мигрировать и далее дифференцируются в нейроны. Таким образом, клетки могут быть использованы одновременно с клетками MS5-R-NC. Протокол клеток R-NC для вывода ЧПУ клеток из чЭСК / IPSC будет полезна для всех применений технологии чЭСК / IPSC участием происхождение ЧПУ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка питательных сред, с покрытием блюда и обслуживании hPSCs

Подготовка 1.1 Медиа

Примечание: Фильтр все средства массовой информации для стерилизации и хранить при температуре 4 ° С в темноте в течение до 2 недель. Имена реагентов, каталог компаний и номера указаны в таблице материалов.

1. DMEM/10% FBS: Комбинат 885 мл DMEM, 100 мл FBS, 10 мл Pen / Strep и 5 мл L-глютамин.
2. HES-среда: Комбинат 800 мл DMEM/F12, 200 мл KSR, 5 мл L-глютамин, 5 мл ручка / стрептококковая, 10 мл MEM минимальная поддерживающая решения аминокислоты, 1 мл β-меркаптоэтанола. Добавить 10 нг / мл FGF-2 после фильтрации среды.
   ВНИМАНИЕ: β-меркаптоэтанол токсичен, избежать вдыхания, проглатывания и контакта с кожей.
3. КСР-дифференциация среда: Комбинат 820 мл Нокаут DMEM, 150 мл KSR, 10 мл L-глютамин, 10 мл Pen / Strep, 10 мл MEM минимально необходимый решение аминокислоты и 1 мл β-меркаптоэтанола.
4. N2-differentiatiна среде: Растворите 12 г DMEM/F12 порошок в 980 мл дН ₂ O, добавить 1,55 г глюкозы, 2 г бикарбоната натрия и 100 мг APO человека трансферрин. Смешайте 2 мл дН ₂ O с 25 мг человеческого инсулина и 40 мкл 1 N NaOH, растворенного добавление раствора к среде. Добавить 100 мкл путресцин дигидрохлорид, 60 мкл селенит, 100 мкл прогестерон и довести объем до 1 л с дН ₂ O.

1.2 Покрытие чашек для культивирования

1. Матригель покрытия: Оттепель 1 мл заморожены Матригель аликвоты с помощью пипетки 19 мл DMEM/F12 над аликвоты, пока он не растворится. Удалить сгустки, пропуская ее через сито клеток 40 мкм и пластины 8 мл/10 см блюдо. Инкубируйте блюда в течение 1 часа при комнатной температуре. Аспирируйте Матригель непосредственно перед покрытием клетки.
   Примечание: Работают быстро при Матригель потому что это может нанести удар при температуре выше 4 ° С.
2. PO / Lam / FN покрытие: Добавьте 10 мл 1x PBS, содержащего 15 мкг / мл поли-L Ornithin гидробромид к 10-см чашку. Выдержите блюдо в течение ночи при 37 ° С Вымойте тарелки с 1x PBS раз и добавить 10 мл на 10 см блюдо 1x PBS, содержащий 2 мкг / мл мыши ламинином я и 2 мкг / мл фибронектина. Выдержите посуду в течение ночи при 37 ° С Перед покрытием клетки, полностью удалить решение и пусть пластины полностью высохнуть при комнатной температуре в течение 15-20 мин, стоя их на капот культуры ткани стене без крышки на.
   Примечание: Блюда полностью сухими и готовыми к клеточной обшивки, когда можно увидеть кристаллические структуры на поверхности (видимой на глаз). Пластины могут храниться при комнатной температуре в течение нескольких часов в этой высушенном состоянии. PO / Лам / FN блюда должны быть готовы за 2 дня раньше срока. В экстренных случаях Лам / FN можно инкубировать только 2-4 часа. Тем не менее, это может рисковать неоптимальных результатов дифференциации / выживания.

1.3 Обеспечение hPSCs

Примечание: hPSCs ведутся на 0,1% желатина и митотически инактивированной мышиных эмбриональных фибробластов (MФ) в HES-среде, дополненной 10 нг / мл FGF-2, как описано выше ^10,12. Клетки должны быть разделены каждые 6-8 дней.

1. Coat 10 см блюдо с 8 мл 0,1% желатина (в 1X PBS без магния или кальция) при комнатной температуре в течение 5 мин.
2. Оттепель замороженных MEFs быстро на водяной бане 37 ° C. Добавить 1000000 MEFs в 10 мл DMEM/10% FBS.
3. Аспирируйте желатин и пластины клеток. Инкубировать при 37 ° С в течение по крайней мере 6 часов.
4. Аспирируйте DMEM/10% FBS из подготовлена ​​MEF пластины, мыть тарелку с 1x PBS раз и добавить 10 мл HES-среду, дополненную 10 мкм Y-27632 дигидрохлорида. Разрешить среда, чтобы согреться при 37 ° С в течение 20 мин.
   Примечание: Для ручного расщепления hPSCs ламинаре со встроенным микроскопом используется. Тем не менее, клетки могут быть пассировать с использованием соответствующих методов альтернативных.
5. Под ламинаре со встроенным микроскопом, отделить отдельных колоний с помощью мобильного подъемник, и пусть они плавают.
6. Используйте1 мл шприц для аспирации плавающие колонии и направить их на свежий, теплый MEF пластины. Трансфер примерно одну четверть клеток к новому блюду. Инкубировать при 37 ° C.
7. Поток клетки ежедневно с новыми ГЭС среды.

2. Покрытие из hPSCs для дифференциации

Примечание: hPSCs следует разделить или покрытием для дифференциации когда колонии большие, но все же имеют острые края с как можно меньше дифференциации клеток в их границ (см. рисунок 1В). Когда клетки поддерживали с помощью ручного пассирования колонии должен быть достаточно большим, чтобы легко увидеть невооруженным глазом. Чтобы получить право почувствовать этот момент времени можно поддерживать отдельный HPSC блюдо в течение двух недель без пассажей и смотреть клетки достигают и передать идеальную точку времени для пассажей / дифференцируя их.

1. Подготовка 10 см блюда с матригель 1 час до начала дифференциации. Успешное матригель покрытие может бытьпроверено на 4-кратным увеличением.
2. Когда hPSCs готовы быть разделен, аспирации среды и добавить 4 мл 0,05% трипсина-ЭДТА к клеткам.
3. Встряхнуть блюдо горизонтально в течение 2 мин энергично, пока никто не может увидеть MEFs как одиночные клетки отрывая тарелку под микроскопом. Колонии HPSC остаются прилагается в колониях.
4. Немедленно и тщательно, аспирации трипсин и пусть пластины стоят при комнатной температуре в течение 2-4 мин.
5. Добавить 2 мл ГЭК-среды к пластине и с использованием P1000 пипетки, открепления клеток.
   Примечание: Если клетки не могут быть сняты с поверхности легко, пластина можно инкубировать пуст при комнатной температуре еще 2-3 мин.
6. Передача клеток в 8 мл HES-среде, дополненной 10 мкм Y-27632 дигидрохлорида.
7. Аспирируйте Матригель из ранее подготовленного 10 см блюдо. Пластина клеток в соотношении 1:1 или 1:2 (например: Клетки из одной 10-см чашку делятся на две 10 см чашки) на матригеля пластины. Инкубировать при температуре 37 °С в течение ночи.
   Примечание: Это покрытие должно привести к примерно 100 000 клеток / см ^2.

3. Индукция Neural дифференциации

Примечание: дифференцирование может быть инициирован (день 0), когда клетки 90-100% сливной (см. рисунок 1с), как правило, на следующий день. Если точное конфлюентности еще не достигнуто, клетки могут быть поданы в день с HES-среде, пока они не готовы к дифференциации. С другой стороны, начальное число посеянных клеток может быть увеличена.

1. В день 0 до 3, питания клеток ежедневно с 10 мл/10 см чашку KSR-дифференцировки среду, содержащую 0,1 мкм LDN193189 и 10 мкМ SB431542.
2. На 4-й день и 5 канал клетки с 75% КСР-дифференцирования средних и 25% N2-дифференцирования среды и содержащий LDN193189 и SB431542.
3. На 6-й день и 7 корма клетки с 50% КСР-дифференцирования средних и 50% N2-дифференцирования среды и содержащий LDN193189 и SB431542.
4. На день 8 и 9 корма клетки с 25% КСР-дифференцирования средних и 75% N2-дифференцирования среды и содержащий LDN193189 и SB431542.
5. В день 9 и 10 подготовить PO / Лам / FN блюда, как указано в пункте 1.2.2 для replating клеток на 11-й день.
6. В день 10 кормовые клетки с N2-дифференцирования среде, содержащей LDN193189 и SB431542.

4. Replating в каплях для уточнения НК

1. На 11 день аспирации Lam / FN из заранее подготовленных пластин, и пусть они полностью высохнуть при комнатной температуре в течение 20-30 мин, как описано в пункте 1.2.2.
2. Удалить среды из отличительных клеток, промыть клетки один раз 1x PBS и добавить 8 мл accutase/10 см блюдо. Инкубировать в течение 20 мин при 37 ° С
3. Использование сотового подъемник, открепления клеток и ресуспендируют их в Accutase с 5 мл пипетки. Передача суспензии в 15 мл пробирку.
4. Добавить 5 мл 1x PBS и спина клетки в течение 5 мин при 114 х г.
5. Ресуспендируют клеток в 10 мл 1х PBS. Для обеспечения однородной клеточной суспензии, фильтровать их через сито 40 мкм клеток и подсчета клеток с помощью гемоцитометра или эквивалентный метод.
6. Спин клетки вниз и ресуспендируют их в N2-дифференцировки среде, содержащей 200 мкМ аскорбиновой кислоты (AA), 20 нг / мл BDNF, 100 нг / мл FGF8, 20 нг / мл SHH, 10 мкМ Y-27632 дигидрохлорид при концентрации 100000 -150000 cells/10 мкл.
7. Использование повторения-пипетка, пластина 10 мкл капли близко друг к другу без них касаясь на высушенный 15 см блюда ПО / Лам / FN.
   Примечание: Один 10 см блюдо из дифференцированных клеток обычно приводит к примерно в 2-3 раза 15 см блюда или примерно 100 х 10 мкл droplets/15 см блюдо.
8. Пусть капли стоять при комнатной температуре в течение 20-30 мин, затем очень осторожно (чтобы не нарушить капель) добавляют 30 мл N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y и инкубировать при 37 ° С
9. На 12-й день, тщательно питания клеток с 20 ml/15 см блюдо N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
10. От дау 14-17 питания клеток каждый второй или третий день с N2/AA/BDNF/FGF8.
11. На 16-й день и 17 подготовить PO / Лам / FN пластины replate NC клетки после FACS сортировки.

5. Флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS) размыкающих клеток

Примечание: Получение клеток для FACS требует приблизительно 2 часов.

1. На 18 день удалить среды, промыть клетки один раз 1x PBS в блюдо и добавить 12 мл Accutase. Инкубируйте клетки в течение 20 мин при 37 ° С
2. Использование сотового подъемник, открепления клеток с поверхности, и пусть они плавают. Внесите клеток в суспензии с использованием 5 мл пипетки, перенести их на 50 мл трубки и добавляют 30 мл 1x PBS. Вращайте клеток для 5 мин при 114 х г.
3. Использование P1000 пипетки ресуспендирования клеток в 1 мл 2% FBS / HBSS (HBSS содержит 15 мМ HEPES). Добавить 19 мл 2% FBS / HBSS и фильтровать клетки через клеточный фильтр 40 мкм, чтобы обеспечить суспензии отдельных клеток. Инкубируйте клетки на льду в течение 15 м.в течение блокирования антител, а затем считать их помощью гемоцитометра.
4. Спин клетки вниз и ресуспендируют их в концентрации 10 миллионов клеток / мл в 2% FBS / HBSS.
5. Отложите 1000000 ячеек, каждая для неокрашенных, один окрашенных (HNK-1 только и только p75) и вторичным антителом окрашенных только (APC только и 488 только) СУИМ контролирует.
6. Добавьте 5 мкл ХНК-1 и 5 мкл первичного антитела p75 в 10 миллионов клеток в 1 мл суспензии в соответствующие образцы и инкубировать в течение 20 мин на льду.
7. Вымойте клеток в 10 мл 1x PBS (центрифуга 5 мин при температуре 114 мкг) и ресуспендирования клеток в 1 мл 2% FBS / HBSS. Добавить 2 мкл APC и 1 мкл 488 вторичным антителом на 10 миллионов клеток в 1 мл суспензии в соответствующие образцы и выдержать в течение 20 минут на льду в темноте.
   Примечание: APC и 488 являются вторичные антитела, используемые здесь для окрашивания ХНК-1 и р75 соответственно.
8. Промывают клетки в 10 мл 1x PBS дважды, ресуспендируют 10000000 клеток в 500 мкл2% FBS / ССРХ содержащий DAPI (на 0,5 нг / мкл) или альтернативный необходимости жить пятно клеток для исключения мертвых клеток из анализа FACS.
9. Перенесите образцы присвоить FACS труб.
10. Подготовка FACS труб с 0,5 мл 2% FBS / HBSS для сбора клеток.
    Примечание: Клетки и сбора трубы выдерживали на льду в темноте во время сортировки.
11. Использование сортировочной машины клеток с помощью лазеров, которые могут обнаружить DAPI, БТР и 488 рода DAPI-/HNK-1 + / P75 + двойные положительные клетки.
    Примечание: Время приготовления и обработки клеток приводит к небольшой процент гибели клеток, DAPI пятна мертвых клеток только и таким образом позволяет эти клетки должны быть исключены из отсортированного населения. Любая альтернатива живой / мертвый пятно работает одинаково хорошо для этой цели. Сам DAPI не вызывает цитотоксичность в живой клеточной популяции.

6. Replating из отсортированных клеток, Северная Каролина Техническое обслуживание и расширение

Примечание: FACS отсортированы клетки должны быть рукипривели с особой тщательностью, чтобы обеспечить оптимальное выживание. Держать их на льду до replating их. Не вихрь или пипетки их строго. Клетки ресуспендировали может быть слегка ударяя по пробирке.

1. После сортировки FACS, подсчет клеток NC, то спина их вниз и ресуспендируют в N2-дифференцировки среде, дополненной 10 нг / мл FGF2, 20 нг / мл EGF и 10 мкм Y-27632 дигидрохлорида в объеме, соответствующем replate их на 30000 клеток / 10 мкл капли.
2. Тщательно сухой предварительно приготовленный PO / Лам / FN тарелки и пластины примерно 50-70 капель на 10 см блюдо. Пусть блюда стоят при комнатной температуре в течение 20-30 мин.
3. Очень осторожно добавить 20 мл на 10 см блюдо N2/FGF2/EGF/Y-27632 не нарушая капельки. Инкубируйте клетки при 37 ° С.
4. Поток клетки каждые 2-3 дня с N2/FGF2/EGF.
   Примечание: NC клетки расширяются или пассировать около каждые 4-5 дней или когда они начинают накапливаться в каплях.
5. Для прохождения клетки NC, удалите среднего, Вашингтонш клетки один раз 1x PBS и добавить 8 мл accutase/10 см блюдо. Инкубировать в течение 20 мин при 37 ° С
6. Внесите клетки от пластины, используя 5 мл пипетки и перенести их на 15 мл трубки. Добавить 6 мл 1x PBS.
7. Вращайте клеток для 5 мин при 114 х г.
8. Ресуспендируют клеток в N2-дифференцировки среде, дополненной 10 нг / мл FGF2, 20 нг / мл EGF и 10 мкМ Y-27632 дигидрохлорида, чтобы иметь 20000 cells/10 мкл капли.
9. Replate клеток в 10 капель мкл на сушеных PO / LAM / FN пластин. Пусть блюда стоят при комнатной температуре в течение 20-30 мин.
10. Осторожно добавить 20 мл на 10 см блюдо N2/FGF2/EGF/Y-27632. Инкубировать при 37 ° C.
    Примечание: NC клетки могут сохраняться и расширяться на срок до 2 недель в качестве относительно однородной популяции предшественников. Дольше культура может привести их к дифференцироваться в различные типы клеток потомство.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Два наиболее важных улучшений протокола R-NC по протоколу MS5-R-NC ¹¹ являются фидерные без, определенные условия дифференциации и в целом сокращение требованием времени. MS5 фидерные клетки ¹³ представляют собой мышиные костного мозга стромальных клеток, полученных, которые были ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Для успешного дифференциации R-NC клеток из чЭСК / hiPSCs следующие соображения должны быть сделаны. Очень важно, чтобы работать в стерильных условиях культивирования во все времена. В частности, важно, чтобы проверить HPSC культур на загрязнение микоплазмой регулярно, так как это загрязнени?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco-Life Technologies	11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
DMEM/F12	Gibco-Life Technologies	11330-032
Knockout Serum Replacement	Gibco-Life Technologies	10828-028	Lot should be tested
L-Glutamine	Gibco-Life Technologies	25030-081
Penicinlin/Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140-122
MEM minimum essential amino acids solution	Gibco-Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Gibco-Life Technologies	21985-023	toxic
Recombinant human FGF basic (FGF2)	R&D Systems	233-FB-001MG/CF
Knockout DMEM	Gibco-Life Technologies	10829-018
DMEM/F12 powder	Invitrogen	12500-096
Glucose	Sigma	G7021
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
APO human transferrin	Sigma	T1147
Human insulin	Sigma	I2643
Putriscine dihydrochloride	Sigma	P5780
Selenite	Sigma	S5261
Progesterone	Sigma	P8783
Matrigel matrix	BD Biosciences	354234
Poly-L Ornithin hydrobromide	Sigma	P3655
Mouse Laminin-I	R&D Systems	3400-010-01
Fibronectin	BD Biosciences	356008
Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml	Stem Cell Technologies	7013
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300-054
Y-27632 dihydrochloride	Tocris-R&D Systems	1254
LDN193189	Stemgent	04-0074
SB431542	Tocris-R&D Systems	1614
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
BDNF	R&D Systems	248-BD
FGF8	R&D Systems	423-F8
Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH)	R&D Systems	464SH
HBSS	Gibco-Life Technologies	14170-112
HEPES	Gibco-Life Technologies	1563-080
Human recombinant EGF	R&D Systems	236EG
gelatin (PBS without Mg/Ca)	in house
Antibodies:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM	Sigma	C6680-100TST	lot should be tested
Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor)	Advanced Targeting Systems	AB-N07	lot should be tested
APC rat anti-mIgM	BD Parmingen	550676	lot should be tested
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1	Invitrogen	A21121	lot should be tested
Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution)	Santa Cruz	sc-5279	lot should be tested
Material/Equipment:
Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial)	GlobalStem	GSC-6105M
Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes,  pipettes, pipette tips
Glass hematocytometer
Cell culture centrifuge
Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled)
Cell culture laminar flow hood with embedded microscope
Cell culture biosafety hood
Cell sorting machine, i.e. MoFlo
Inverted microscope
1 ml TB syringe 27Gx1/2	BD Biosciences	309623
Cell lifter Polyethylene	Corning Incorporated	3008