قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Summary

الاضطرابات الأيضية هي من بين واحدة من الأمراض الأكثر شيوعا لدى البشر. نموذج كائن لين العريكة وراثيا D. ويمكن استخدام البطن لتحديد الجينات الرواية التي تنظم عملية التمثيل الغذائي. وتصف هذه الورقة طريقة بسيطة نسبيا والتي تسمح بدراسة معدل الأيض في الذباب عن طريق قياس إنتاجها CO _2.

Abstract

الاضطرابات الأيضية هي مشكلة متكررة تؤثر على صحة الإنسان. وبالتالي، فهم الآليات التي تنظم عملية التمثيل الغذائي هي مهمة علمية حاسمة. المرض يسبب العديد من الجينات في البشر لها نديد ذبابة، مما يجعل ذبابة الفاكهة نموذجا جيدا لدراسة مسارات الإشارات المشاركة في تطوير اضطرابات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، فإن قابلية الإستطراق من ذبابة الفاكهة يبسط شاشات الجينية للمساعدة في تحديد الأهداف العلاجية الرواية التي قد تنظم عملية التمثيل الغذائي. من أجل أداء هذه الشاشة طريقة بسيطة وسريعة لتحديد التغيرات في التمثيل الغذائي للدولة من الذباب هو ضروري. بشكل عام، وإنتاج ثاني أكسيد الكربون هو مؤشر جيد للأكسدة الركيزة والطاقة النفقات وتوفير المعلومات حول حالة الأيض. في هذا البروتوكول ونحن نقدم طريقة بسيطة لقياس CO ₂ الناتج من الذباب. هذه التقنية يمكن أن يحتمل أن تكون مساعدة في تحديد الاضطرابات الوراثية التي تؤثر على معدل الأيض.

Introduction

دورة البيوكيميائية كريب يولد ATP من خلال الأكسدة من خلات المستمدة من الكربوهيدرات والدهون والبروتينات وإنتاج ثاني أكسيد الكربون _2. في ذبابة الفاكهة، ويرتبط O ₂ مدخلات مباشرة مع CO ₂ الناتج ويعكس مستوى التمثيل الغذائي ^1. وبالتالي، فقد استخدمت بنجاح قياس CO ₂ الناتج في الدراسات المتعلقة بالشيخوخة والتمثيل الغذائي ^2-5. هنا مختبرنا وتعديل الاجهزة التجريبية المصممة مسبقا، مما يتيح قياس ثاني أكسيد الكربون ₂ في إنتاج ما يصل إلى ثمانية عشر عينات دون الحاجة إلى أي معدات متخصصة. الآخرين، ونحن قد استخدمت سابقا هذه الطريقة لإظهار الفروق في معدلات الأيض في الذباب التي تعاني من نقص في البروتين العضلي ضمور المرتبطة بها، Dystroglycan (المديرية العامة) ^6-8.

O ₂ تستخدم لالأيض المؤكسدة يتم تحويلها إلى CO _2، الذي طرد في حاوية نفايات في الجهاز التنفسي. والإنشاءاتيوصف نشوئها قياس التنفس المصنوعة يدويا التي تسمح لتحديد معدل استهلاك O _2. يتم وضع الذباب في حاوية مغلقة مع المادة التي تمتص ثاني أكسيد الكربون طرد _2، والقضاء بكفاءة من المرحلة الغازية. ويتم قياس التغير في حجم الغاز (الضغط انخفض) عن تشريد السائل في الزجاج الشعرية التي تعلق على مقياس التنفس مغلقة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة مع الآخرين هو التكلفة. وقد تقاس الدراسات السابقة CO ₂ الانتاج بمقدار ذبابة الفاكهة باستخدام محللات الغاز وأنظمة قياس التنفس تقدما من الناحية التقنية ^1،9. على الرغم من المعدات أكثر تعقيدا، وحساسية الطريقة الموصوفة هنا يشبه القيم ذكرت (الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت العديد من المجموعات الأخرى من الاختلافات هذه التقنية لتحديد معدلات التمثيل الغذائي النسبي في ذبابة الفاكهة ^4-6. لذلك، هذا الاختبار يمكن استخدامها لتوليد reliabجنيه، والبيانات ذات الصلة استنساخه لذبابة الفاكهة الأيض دون شراء المعدات المتخصصة التي يمكن أن تكون في أي مختبر الإعداد، ويمكن استخدامها لأغراض تعليمية.

بشكل عام، تقنيات مقبولة لتحديد التمثيل الغذائي للكائن الحي هو قياس CO ₂ تنتج، وO ₂ المستهلكة، أو كليهما ^3،4،9. رغم ذلك، فإنه يمكن الافتراض أن ما يعادل واحد من O ₂ يولد ما يعادل واحد من ثاني أكسيد الكربون _2، ونسبة دقيقة من CO ₂ إنشاؤها تعتمد على الركيزة الأيض تستخدم ^10. وبالتالي، لتحديد بدقة معدل الأيض في وحدات الطاقة فمن الضروري قياس كل من O ₂ CO ₂ المستهلكة والمنتجة. ونتيجة لهذا، فإن الطريقة الموصوفة هنا هو ذات الصلة على وجه التحديد لمقارنة الاختلافات في CO ₂ الإنتاج بين الحيوانات وليس قيمة مطلقة. أسلوبنا يدمج متعددة الحيوان CO ₂ الإنتاج على مدى فترة من تيمه (1-2 ساعة) وبالتالي إرجاع متوسط ​​النشاط الحيوانات. إذا كان هناك سبب للاعتقاد بأن حيوانات التجارب هي أقل نشاطا من الحيوانات سيطرة القياس يمكن أن تعكس مستويات مختلفة من النشاط وليس بالضرورة عملية التمثيل الغذائي.

Protocol

1. إعداد قياس التنفس

1. قطع 1،000 ميكرولتر ماصة مع شفرة حلاقة للسماح بإدخال الشعرية micropipette 50 ميكرولتر، في محاولة للحصول على طرف ماصة كما مستقيم ممكن.
2. وضع قطعة من المادة العازلة في ماصة ودفعها لأسفل في تلميح ماصة.
3. إضافة كمية صغيرة من ثاني أكسيد الكربون ₂ ماصة واحتوائه من قبل القطعة الثانية من الرغوة.
4. تطبيق الغراء في المكان الذي يتم إدراج micropipette في تلميح ماصة.
5. ترك بين عشية وضحاها مقياس التنفس للسماح للالغراء لتجف.
   ويرد التخطيطي لمقياس التنفس في الشكل 1A.

2. إعداد غرفة القياس

1. إعداد الحل غرفة عن طريق خلط الماء مع يوزين في نسبة من شأنها أن تؤدي في التلوين مرئية.
2. صب الحل يوزين / الماء إلى الغرفة.
3. تسمية أحد جانبي الغرفة مع مقياس سنتيمتر.

معشوقة = "jove_title"> 3. وضع الذباب في قياس التنفس

1. تسمية قياس التنفس الفردية مع علامة.
2. تخدير الذباب باستخدام طريقة بديلة لثاني ₂ وتضع 3-5 الذباب من النمط الجيني المطلوب داخل كل مقياس التنفس.
3. ختم قياس التنفس بإحكام في أعلى باستخدام المعجون دائنية.
4. تسمح الذباب للتعافي من التخدير لحوالي 15 دقيقة.
5. إعداد مقياس التنفس واحد دون الذباب، والتي سيتم استخدامها كعنصر التحكم في الغلاف الجوي.

4. المسرحية التجربة

1. شنق قياس التنفس في غرفة عن طريق ربط 1.5 مل إيبندورف حامل أنبوب مفتوح على أعلى وأسفل في الجزء العلوي من القاعة.
2. إدراج قياس التنفس مع طرف micropipette إلى أسفل داخل غرفة السماح للتلميح إلى يغرق في حل الملونة.
3. إضافة الفازلين بين الغطاء غطاء وغرفة لتوفير العزلة أقوى من درجة الحرارة والضغط fluctuations.
4. إغلاق الغطاء والسماح للنظام للتوازن لمدة 15 دقيقة.
5. التقاط صورة من الغرفة والتأكد من أن مستوى السائل داخل كل micropipette مرئيا وذلك هو المقياس (انظر المثال هو موضح في الشكل 1B).
6. بعد 1-2 ساعة، التقاط صورة أخرى.
7. عندما يتم الانتهاء من التجربة، وإزالة الذباب من قياس التنفس وتزن إذا رغبت أو نقلها إلى القارورة إذا لزم الأمر أبعد من ذلك.

5. تحليل النتائج

1. اكتسبت المفتوحة الصور باستخدام برنامج ImageJ ^11.
2. باستخدام مقياس في كل صورة، ضبط التحجيم بكسل في البرنامج.
3. قياس المسافة (Δd) أن السائل سافر من بقعة إشارة العزم في الصور التي التقطت في بداية (D1) ونهاية التجربة (D2). ويرد مثال التخطيطي في الشكل 1C.
4. حساب كمية إنتاج CO ₂ (ميكرولتر / ساعة / ذبابة) مع الصيغة:

R = نصف قطر أنبوب micropipette في سم
Δd = المسافة انتقلت السائل حتى في micropipette من عينات اختبار قياس بالسنتيمتر
انتقلت Δc = المسافة السائل حتى في micropipette من العينة السيطرة السلبية (بدون الذباب)
n = عدد من الذباب المستخدمة
ح = ساعات

النتائج

من أجل إظهار أن أسلوب حساس قمنا بقياس CO ₂ الإنتاج من النوع البري (ولاية أوريغون R) الذباب الذكور في 18، 25، و 29 درجة مئوية والذباب متحولة عن المديرية العامة. وأثيرت الذباب عند 25 درجة مئوية ومن ثم تحولت إلى درجة حرارة تجريبية لمدة 5 أيام قبل القياس. كما هو متو...

Discussion

في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة غير مكلفة ويمكن الاعتماد عليها لقياس ثاني أكسيد الكربون ₂ الإنتاج في الذباب. وجدنا أن هذه التجربة هي سهلة وسريعة لإجراء ويولد بيانات قابلة للتكرار وهذا هو في اتفاق مع دراسات أخرى ^{1، 6، 9.} بروتوكول المذكورة هنا يمكن تعديلها ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes	VWR	612-1413
Soda Lime	Wako	CDN6847
Eosine	Sigma	031M4359	Any dye that can create visible colorization of liquid can be used
Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber	VWR	21432-761	Any transparent glass chamber that can be closed with the lid
Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit	Flinn	FB1438
Power Gel Glue	Pritt
1 ml pipett tips	Any
Foam	Any
Plaesticine Putty	Any
Scalpel	Any
Tweezers	Any