جيل المعدلة وراثيا<em&gt; حيدرة</em&gt; من جانب الأجنة حقن مكروي

Summary

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Abstract

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Introduction

وقد استخدمت هيدرا لدراسة التجديد، وتشكيل نمط، والخلايا الجذعية لحوالي 250 سنة ² هيدرا لديها خطة هيئة بسيطة تتألف من ثلاثة الأنساب الخلية: الظهارية الأديمي الظاهر، الأديم الباطن الظهارية، وفراغي. يتكون الجسم أنبوبي من الأدمة والأنساب الظهارية الأديم الباطن، كل منها عبارة عن طبقة خلية واحدة. كافة الخلايا الظهارية في عمود الجسم هي الإنقسامية. عندما نزحوا الخلايا الظهارية في الأطراف ^3، ورئيس (الفم ومخالب) في نهاية شفوية أو القدم (القرص القاعدية) في نهاية مجافي الفم، فإنها تعتقل في المرحلة G2 من دورة الخلية وتغيير مصير الخلايا ^4. خلايا النسب الخلالي يقيمون داخل الفجوات بين الخلايا الظهارية. ويدعم هذا النسب من الخلايا الجذعية متعددة القدرات الموجودة في طبقة الأدمة الظهارية العمود الجسم ^5. الخلايا الجذعية الخلالي تؤدي إلى ثلاثة سل الجسديةأنواع ل (الأعصاب، وخلايا الغدة، وnematocytes) والخلايا الجرثومية ^6،7.

كعضو في بعائلة القراصات، مجموعة شقيقة لجميع bilaterians، يمكن هيدرا تسليط الضوء على العمليات البيولوجية الأساسية المشتركة بين الحيوانات المتعددة الخلايا. حتى وقت قريب، تم عرقلة هذه الجهود من خلال عدم وجود طرق موثوقة لاضطراب في وظيفة الجين. ومع ذلك، مع تطوير منهجية المعدلة وراثيا ^1، ونحن الآن قادرون على الاستفادة الكاملة من هيدرا للحصول على فهم أفضل للآليات الأساسية المشتركة بين الحيوانات متعددة الخلايا، مثل وظيفة الخلايا الجذعية، تجديد، والزخرفة. يتم إنشاء خطوط المعدلة وراثيا هيدرا عن طريق الحقن من DNA البلازميد إلى الأجنة، الأمر الذي يؤدي إلى تكامل عشوائي والتعبير خيالية في تردد كبير من سلحفاة صغيرة. يمكن إنشاء خط مع التعبير موحد في نسب معين عن طريق الإكثار اللاجنسي. القدرة على نشر clonally transgشبكة naric هيدرا خطوط هي ميزة على معظم النماذج الحيوانية، والتي يمكن نشرها إلا عن طريق التكاثر الجنسي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تتبع الخلايا المعدلة وراثيا بسهولة في الجسم الحي بسبب شفافية الحيوان وغياب البروتينات الفلورية الذاتية ^8.

في سبع سنوات منذ أول خطوط هيدرا المعدلة وراثيا تم إجراؤها ^1، وقد تم استخدام هذه الخطوط لمجموعة متنوعة من التطبيقات. جعلت التعبير عن البروتينات الفلورية في أنواع مختلفة من الخلايا من الممكن لتتبع حركة الخلية، ومراقبة التغيرات في شكل الخلية، وتتبع مصائر خلية في كل الظروف نوع البرية وبعد اضطراب كيميائي ^1،5،9-12. بالإضافة إلى ذلك، التعبير عن البروتينات الفلورية مختلفة في مختلف الأنساب يسمح لنظام مراقبة الأصول الميدانية عزل السكان خلية معينة. وقد استخدمت هذه التقنية لتسلسل من mRNAs محددة الخلايا الجذعية ونسب محددة الرنا ^13،14 صغيرة. بينما مروجيواحد من اثنين هيدرا الجينات الأكتين وقد استخدم على نطاق واسع، وقد تم تحديد عدد قليل خلية من نوع المروجين محددة وتستخدم لدفع التعبير عن GFP المعدلة وراثيا في هيدرا ^{9،11،15،16.} في المستقبل، سوف المروجين الخلية من نوع معين يسمح لمراقبة وجمع أي نوع من الخلايا المحددة. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام نهج المعدلة وراثيا بنجاح لتحديد العناصر التنظيمية رابطة الدول المستقلة تعمل من المروج Wnt3 ^17.

يوفر تطوير أساليب المعدلة وراثيا في هيدرا نهج قوي لاختبار وظيفة الجينات التي التعبير خارج الرحم، overexpression، وضربة قاضية. وقد بذلت الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الموسومة fluorescently، من أجل دراسة كل وظيفة وتوطين الخلوية ^18-20. وبالإضافة إلى ذلك، والتعبير عن دبابيس الشعر RNA في 3'UTR من التحوير GFP يؤدي الى ضربة قاضية من الجينات المستهدفة ^21،22. في هذه النهج مطلوب لتحديد GFPوتتبع أنسجة معدلة وراثيا أثناء إنشاء خط المعدلة وراثيا. ومع ذلك، فمن المرجح أن جزيء GFP أن تتدخل في بعض الحالات مع وظيفة البروتين الموسومة. توضح دراسة حديثة أن الجينات هيدرا يمكن ترتيب في تكوين الاوبرون، أي مصنوعة النصوص متعدد المقارين، والتي يتم فصلها بواسطة المهدرجة تقسم بالإضافة زعيم وترجمتها على حدة ^23. عن طريق وضع الجينات ترميز البروتين أو دبوس RNA في موقف المنبع من الاوبرون والجين ببروتين في موقف المصب، يمكن للمرء أن تتبع الأنسجة المعدلة وراثيا دون الحاجة لوضع علامة على الجينات التي تشفر البروتين أو RNA القاسي. وقد استخدم هذا الأسلوب لإبداء دبوس RNA في تكوين الاوبرون مع DsRed2 من أجل تحقيق ضربة قاضية الجين ^14.

Protocol

1. إعداد DNA البلازميد، إبر، وأطباق حقن

1. إعداد DNA البلازميد باستخدام طقم ماكسي عالية السرعة أو ميدي وتركيز الحمض النووي إلى 2.5 ملغ / مل باستخدام الإيثانول هطول الأمطار. يجب حل بيليه الحمض النووي في nuclease خالية من الماء منزوع الأيونات. تخزين الحمض النووي في 10-20 مكل في -20 درجة مئوية. (انظر الجدول التكميلي 1 للحصول على قائمة من ناقلات المتاحة)
2. جعل طبق الحقن باستخدام الاغاروز لبناء حوض لعقد الأجنة في 100 × 15 مم طبق بتري.
   1. وضع المجهر الشريحة 75 × 50 الزجاج إلى 100 × 15 مم طبق بتري في زاوية. صب حوالي 50 مل من 2٪ الاغاروز ذاب في حيدرة المتوسطة ²⁴ في طبق بيتري. بدلا من ذلك، صب الاغاروز في طبق أولا وتعويم "القالب حقن مكروي الأسماك" على القمة.
   2. بعد أن عززت agarose، إزالة شريحة زجاجية أو القالب. إذا تم استخدام شريحة زجاجية، وقطع بعيدا الاغاروز الزائد مع بلوخ الحلاقةدي لتشكيل الجدار. صب هيدرا المتوسطة في طبق واستخدامه فورا أو تخزينها في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. يمكن إعادة استخدام الأطباق حقن إذا المخزنة في 4 درجات مئوية بين الاستخدامات: مذكرة.
3. سحب الإبر من الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مع خيوط على مجتذب micropipette باستخدام الشروط التالية: حرارة 525، وسحب 75، سرعة 100، والوقت 50. مخزن الإبر عن طريق الضغط عليها في شريط ضيق من الطين في طبق بتري بحيث أنها الموازية التي عقدت في قاع الطبق.
4. لتحضير محلول الحقن، والجمع بين 3 ميكرولتر من 2.5 ملغ / مل حل DNA البلازميد مع 2 ميكرولتر من 10٪ الفينول الأحمر. دوامة الحل لفترة قصيرة ثم تدور لمدة 10 دقيقة في السرعة القصوى في microcentrifuge لإزالة أي الجزيئات التي قد تسد إبرة.
5. تحت المجهر تشريح، مقطع الإبرة بضعة ملليمترات من غيض مع ملقط لإنشاء فتحة صغيرة. ملاحظة: هناك بعض المرونة في الحجم المناسب للمفتوحاجي لأن الضغط يمكن تعديلها في الخطوة 3.3 لاستيعاب هذا الاختلاف.
6. وضع طبق بتري بحيث انها تحتجز الإبرة في وضع عمودي مع أسفل الحافة. تحميل إبرة مع ما يقرب من 0.5 ميكرولتر من محلول الحقن بواسطة pipetting السائل في نهاية الجزء الخلفي من الإبرة. السماح للعمل شعري لسحب الحل في رأس الإبرة.

2. إعداد الأجنة للحقن

1. على أساس يومي مسح الثقافة سلالة هيدرا AEP عن الاورام الحميدة إنتاج البيض. جمع هذه الاورام الحميدة وتضعها جانبا في طبق منفصل الثقافة. مراعاة هذه الاورام الحميدة كل بضع ساعات خلال اليوم لرصد التقدم المحرز في تشكيل البيض. عندما كسر البيض من خلال الأديم الظاهر والجلوس على حلقة من خلايا الأدمة تراجع انهم مستعدون للحقن ^25. ضع هذه الاورام الحميدة في طبق مع عدة هيدرا التي لها الخصيتين لا يقل عن 1 ساعة قبل حقن للسماح للإخصاب. هيدرا </ EM> الذكور ستفرج الحيوانات المنوية دون أي تلاعب خاص.
2. إذا تم العثور على الإناث في مستعمرة AEP مع البيض تشكيلها بالكامل، والتي هي حوالي 400 ميكرون في القطر ^25، أو 1- إلى 8 خلايا الأجنة المرحلة، أيضا جمع هذه للحقن. حقن فورا الأجنة التي بدأت الانفطار. ملاحظة: ليس من الممكن ان نقول للفرق بين البيض تشكيلها بالكامل وبيضات ملقحة وحيدة الخلية، وبالتالي يجب حضنت هذه مع الذكور قبل الحقن.
3. قبل الحقن، وإزالة معظم الأنسجة الأبوية فوق وتحت الجنين باستخدام مشرط بشفرة # 15. ترك فقط الجنين مع قطعة صغيرة من العمود الجسم المرفقة، لاستخدامها لمعالجة الجنين بالملقط إذا لزم الأمر. ملاحظة: الأنسجة التي يتم تشريح بعيدا عن الجنين وتجديد ويجب حفظ لضمان أن الإناث تبقى في مستعمرة هيدرا.
4. باستخدام ماصة باستور، نقل الأجنة إلى طبق الحقن، وترتيبها موازية لجدارحوض الاغاروز.

3. Microinjection من البلازميد DNA

1. تركيب microinjector على الوقوف المغناطيسي الذي يجلس على صفيحة الحديد. جبل حامل الحقن، وهو جزء من microinjector الذي يحمل الإبرة، على micromanipulator عصا التحكم. تركيب مناور عصا التحكم على لوحة الحديد، مع الوقوف المغناطيسي. ضع هذا كله مجموعة المتابعة على الجانب الأيمن من مجهر تشريح ووضع حامل حقن بحيث كان مرئيا في مجال المراقبة.
2. وضع الطبق مع حقن الأجنة تحت المجهر تشريح، الموجهة مثل أن الجدار الرأسي للحوض الاغاروز هو اليسار. ادخال الإبرة في حامل الحقن وخفض رأس الإبرة في المتوسط ​​هيدرا في الطبق.
3. تتحول ببطء مقبض من الحقنة في اتجاه عقارب الساعة حتى تملأ الزيوت المعدنية أعلى الإبرة وجود تدفق مستمر من محلول الحقن لوحظ خروج الإبرة في HYDRوسيلة. إذا كان تيار قوي جدا، وانخفاض الضغط من خلال تحويل مقبض عكس عقارب الساعة. ممارسة هذه الخطوة بشكل روتيني للحصول على ضغط مناسب، والذي يعتمد على حجم الفتحة إبرة (أي كيف كان يثقب الإبرة في الخطوة 1.5). ملاحظة: إذا كان تيار قوي جدا، فإن الجنين لم تنج من الحقن.
4. أثناء عرض من خلال مجهر تشريح، حرك طبق حقن بحيث الجنين الأول في وسط الميدان. تحريك الإبرة بحيث أنه لمس أن الجنين. استخدام مياداة مجهرية لاختراق الجنين مع الإبرة. ملاحظة: ستكون الجدار الرأسي للحوض الاغاروز حفاظ على الجنين من يتم دفعها جانبا الإبرة.
5. يسمح الحل الحقن لتتدفق الجنين 1 أو 2 ثانية ثم قم بإزالة الإبرة بسرعة. إذا كان الجنين لديه أكثر من خلية واحدة، وضخ كل خلية على حدة. استخدام ملقط لإعادة توجيه الجنين لمحاذاة الخلية التالية مع رأس الإبرة.
6. بعد امبري الأوليتم حقن س، نقل الطبق بحيث الجنين القادم في موضع الحقن وكرر الإجراء. تستمر حتى تم حقن جميع الأجنة.

4. التثقيف والتفقيس من الأجنة

1. نقل كل من الأجنة المحقونة في صحن مع قليل من هيدرا التي لها الخصيتين (وهذا هو لضمان أن جميع الأجنة المخصبة). احتضان الأجنة في 18 ° C حاضنة في حين أنها لا تزال مرحلة التطور الجنيني.
2. مرة واحدة يتم الوصول إلى مرحلة بشرة، نقل كل الأجنة لحقن بئر الفردي من 24 لوحة جيدا مليئة هيدرا المتوسطة.
3. احتضان الأجنة المحقونة لمدة 2 أسابيع في الظلام في 18 ° C.
4. بعد فترة الحضانة 2 الاسبوع، والتحقق من كل حقن الجنين تحت المجهر تشريح. ملاحظة أي الحالات التي فصل الجنين مرحلة بشرة من قطعة صغيرة من الأنسجة الأبوية وإعادة إحياء النسيج الأبوية. إزالة هذا سليلة مجدد فورا حتى أنه لا ميstaken لفقس البيض الجديد.
5. نقل طبق من الأجنة المحقونة تحت ضوء حوض السمك في RT. تحقق لوحات كل يوم، وجمع سلحفاة صغيرة. سلحفاة صغيرة جديدة سوف تكون بيضاء لأن اللون الوردي نموذجية من الاورام الحميدة هيدرا يأتي من الأرتيميا يأكلون.
6. مراقبة سلحفاة صغيرة تحت المجهر مضان للكشف عن التحوير التعبير.

النتائج

إنشاء خطوط هيدرا المعدلة وراثيا

تغذية سلحفاة صغيرة المعدلة وراثيا كل 2-3 أيام مع يرقات الأرتيميا. سلحفاة صغيرة أحيانا لا تأكل لمدة يوم أو اثنين بعد الفقس. فإن بعض سلحفاة صغيرة جديدة تأكل أبدا، وبالتالي لن البقاء على قيد ال?...

Discussion

هيدرا يستنسخ بشكل روتيني لاجنسيا، ولكنها تتطلب محفزات البيئية للبدء في إنتاج الأمشاج. لا تعرف جيدا هذه المحفزات لمعظم الأنواع وهيدرا قد تختلف من سلالة إلى سلالة. وهناك عقبة كبيرة في إنتاج المعدلة وراثيا هيدرا هو الحصول على الأجنة على أساس منتظم لأنه ق?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEP Hydra Strain			Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151