Создание трансгенных<em&gt; Hydra</em&gt; По эмбрионов микроинъекции

Резюме

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Аннотация

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Введение

Hydra был использован для изучения регенерации, образование паттерна, и стволовые клетки в течение примерно 250 лет ² Hydra имеет простой план тела, состоящий из трех линиях клеток:. Эктодермального эпителиальные, эндодермального эпителиальных и интерстициальных. Трубчатый корпус образован эктодермального и энтодермальных эпителиальных линий, каждая из которых представляет собой один слой клеток. Все эпителиальных клеток в колонке тела являются митотический. Когда эпителиальные клетки смещаются в конечностях ^3, глава (рот и щупальца) в полости рта конца или ноги (базальной) диска на спинной конце концов, они задержать в G2-фазе клеточного цикла и изменить судьбу клетки ^4. Клетки линии интерстициального находятся в промежутках между эпителиальными клетками. Эта линия поддерживается мультипотентных стволовых клеток, которые расположены в эктодермальном эпителиального пласта колонны тела ^5. Промежуточные стволовые клетки дают начало трем соматической сотовыхтипы л (нервы, железы клетки и nematocytes) и половые клетки ^6,7.

Как член филюма Cnidaria, сестра группа для всех bilaterians, Гидра может пролить свет на фундаментальные биологические процессы разделены среди многоклеточных животных. До недавнего времени эти усилия не были препятствует отсутствие надежных методов возмущения функции гена. Тем не менее, с развитием трансгенных методологии ^1, мы теперь в состоянии в полной мере воспользоваться Hydra, чтобы получить лучшее понимание основных механизмов, общих для многоклеточных животных, таких как функции стволовых клеток, регенерации, и кучность стрельбы. Трансгенные линии Hydra установлены путем инъекции плазмидной ДНК в эмбрионы, что приводит к случайной интеграции и экспрессии химерного в значительной частотой птенцов. Линии с равномерным экспрессии в конкретной линии может быть установлен бесполым распространения. Возможность клонально распространяться transgЕНИК Hydra линии является преимуществом по сравнению с большинством моделей животных, которые могут быть распространены только полового размножения. Кроме того, трансгенные клетки могут быть легко отслеживаются в естественных вследствие прозрачности животного и отсутствие эндогенного флуоресцирующих белков ^8.

За семь лет с момента первых трансгенных линий Hydra были сделаны ^1, такие линии были использованы для различных применений. Выражение флуоресцентных белков в различных типах клеток позволило отслеживать движение клетки, наблюдать за изменениями в форме клеток, а также отслеживать клеточные судьбы как в диких условиях типа и после химической возмущения ^1,5,9-12. Кроме того, выражение различных флуоресцентных белков в различных линий позволяет FACS изоляции конкретных клеточных популяций. Эта техника была использована для секвенирования специфических мРНК стволовых клеток и клон-специфических малых РНК ^13,14. В то время как промоутеродин из двух генов актина Hydra была наиболее широко используемым, а некоторые промоторы клеток типа были идентифицированы и использованы для управления экспрессией GFP в трансгенных Hydra ^9,11,15,16. В будущем, промоторы клеток типа позволит для наблюдения и сбора любого конкретного типа клеток. Кроме того, трансгенные подход был успешно использован для определения цис-действующие регуляторные элементы промотора Wnt3 ^17.

Развитие трансгенных методов в Hydra обеспечивает надежную подход для проверки функции генов с помощью эктопической экспрессии, избыточная экспрессия и нокдаун. Трансгенные животные были сделаны, что выразить флуоресцентно-меченных белков с целью изучения как функцию и клеточную локализацию ^18-20. Кроме того, выражение РНК шпильки в 3'-UTR о GFP трансгена приводит к нокдауна генов-мишеней ^21,22. В этих подходов GFP, требуется, чтобы идентифицироватьи отслеживать трансгенной ткани при создании трансгенной линии. Тем не менее, вполне вероятно, что в некоторых случаях молекулы GFP будет мешать функции меченого белка. Недавнее исследование показывает, что Hydra гены могут быть расположены в конфигурации оперона, т.е. полицистронного транскрипты сделаны, которые затем разделяются транс-сплайсинга лидера того и переведены в отдельности ^23. Размещая ген, кодирующий белок или РНК шпильку в верхнем положении оперона, и ген флуоресцентного белка в нижнем положении, то можно отслеживать трансгенной ткани без того, чтобы пометить гена, кодирующего белок или РНК шпильку. Этот метод был использован, чтобы выразить РНК шпильку в конфигурации оперона с DsRed2 для достижения ген нокдаун ^14.

протокол

1 Получение ДНК плазмиды, иглы и инъекции Блюда

1. Подготовьте плазмидной ДНК с использованием набора High Speed ​​Maxi или Midi и концентрируют ДНК до 2,5 мг / мл с помощью осаждением этанолом. Осадок ДНК должны быть растворены в нуклеазы без деионизированной воды. Хранить ДНК в 10-20 мкл аликвотах при -20 ° C. (Смотрите дополнительную таблицу 1 для списка доступных векторов)
2. Согласовать впрыска блюдо с использованием агарозы построить желоб для проведения эмбрионов в 100 х 15 мм чашки Петри.
   1. Поместите 75 х 50 стеклышко в 100 х 15 мм чашки Петри под углом. Налейте примерно 50 мл 2% агарозном расплавленные в Hydra среды ²⁴ в чашке Петри. Кроме того, залить агарозы в сосуде первый и плавать "Микроинъекция Fish Mold" на вершине.
   2. После агарозном укрепил, снимите стеклянную слайд или плесень. Если был использован предметное стекло, срезать лишний агарозы с бритвой бладе чтобы сформировать стенку. Налейте Hydra среды в блюдо и сразу же использовать его или хранить его при температуре 4 ° С до использования. Примечание: Инъекции блюда могут быть повторно использованы, если хранится при температуре 4 ° С между использованием.
3. Потяните иглы из боросиликатного стекла капилляров с нити на пипетки съемник, используя следующие условия: тепло 525, тянуть 75, скорости 100, время 50.-магазин иглы, нажав их в узкой полосе глины в чашке Петри, такие, что они параллельная нижней части блюда.
4. Для приготовления раствора для инъекций, объединить 3 мкл 2,5 мг / мл раствора плазмидной ДНК с 2 мкл 10% фенолового красного. Вихревой раствор кратко, а затем вращать ее в течение 10 мин при максимальной скорости в микроцентрифуге, чтобы удалить любые частицы, которые могут засорить иглу.
5. Под микроскопом рассекает, клип иглу на несколько миллиметров от кончика щипцами, чтобы создать небольшое отверстие. Примечание: Существует некоторая гибкость в соответствующем размере открытчисле, потому что давление может быть отрегулировано на шаге 3.3, чтобы приспособить этот вариант.
6. Поместите чашку Петри таким образом, чтобы он удерживает иглу в вертикальном положении с наконечником вниз. Загрузить иглу приблизительно 0,5 мкл инъекционного раствора с помощью пипетки жидкость в задней части иглы. Разрешить капиллярного действия, чтобы вытащить раствора в кончике иглы.

2 Получение эмбрионов для инъекций

1. На ежедневной основе сканирования штамм культуры Hydra AEP для полипов, производящих яйца. Соберите эти полипы и отложите их в отдельном блюдо культуры. Соблюдайте эти полипы каждые несколько часов в течение дня, чтобы следить за ходом формирования яйца. Когда яйца прорвать эктодермы и сидеть на ринге отведенным эктодермальных клеток они готовы для инъекций ^25. Поместите эти полипы в блюдо с несколькими Hydra, которые имеют яички, по крайней мере 1 час до инъекции, чтобы позволить для оплодотворения. Hydra </ EM> мужчины выпустит сперму без специальной манипуляции.
2. Если самки находятся в колонии AEP с полностью сформированных яиц, которые примерно 400 мкм в диаметре ^25, или от 1 до эмбрионов 8-клеточных стадии, также собирают их для инъекций. Сразу вводить эмбрионы, которые начали раскалывания. Примечание: Это не возможно отличить полностью сформированных яиц и одноклеточных зиготы, таким образом, они должны быть выведены с мужчинами перед инъекцией.
3. Перед инъекцией, удаляя большую часть родителей ткани выше и ниже эмбриона с помощью скальпеля с # 15 лезвия. Оставьте только эмбрион с небольшим куском колонке байонета, чтобы быть использованы для манипулирования эмбрион щипцами при необходимости. Примечание: ткань, которая отсечен от эмбриона будет восстанавливаться и должен быть сохранен для того, чтобы женщины остаются в колонии Hydra.
4. С помощью пипетки Пастера, двигаться эмбрионов впрыска блюдо, устраивая их параллельно стенеагарозном корыта.

3 Микроинъекции ДНК плазмиды

1. Установите microinjector на магнитной подставке, который сидит на железной плите. Установите держатель инъекция, которая является частью microinjector который держит иглу, на джойстик микроманипулятором. Установите джойстик манипулятора к железной пластине, с магнитной подставке. Разместите эту всю настройку на правой стороне вскрытии микроскопом и расположите держатель впрыска так, чтобы видно в области наблюдения.
2. Поместите впрыска блюдо с эмбрионами под микроскопом рассекает, ориентированы таким образом, что вертикальная стенка желоба агарозном находится слева. Вставьте иглу в держатель впрыска и опустите кончик иглы в среду Hydra в блюдо.
3. Медленно поверните ручку шприца по часовой стрелке, пока минеральное масло не заполняет верхнюю часть иглы и устойчивый поток раствора для инъекций наблюдается выход иглу в Гидравлсреда. Если поток слишком силен, понизить давление, повернув против часовой стрелки. Практика этот шаг, чтобы регулярно получать необходимого давления, которое зависит от размера отверстия иглы (т.е., как игла был взят на стадии 1.5). Примечание: Если поток слишком силен, эмбрион не выживет инъекции.
4. При просмотре через вскрытии микроскопом, переместить впрыска блюдо так, чтобы первый эмбрион находится в центре поля. Перемещение иглы так, чтобы она касалась, что эмбрион. Используйте микроманипулятор проколоть эмбриона с иглы. Примечание: Вертикальная стенка желоба агарозном будет держать эмбрион от быть отодвинуты от иглы.
5. Разрешить решение впрыска течь в эмбриона 1 или 2 сек, а затем снимите иглу быстро. Если эмбрион имеет более одной ячейки, вводят каждую ячейку отдельно. С помощью пинцета, чтобы переориентировать эмбриона, чтобы выровнять следующую ячейку с кончиком иглы.
6. После первого Эмбрио впрыскивается, перемещать антенну так, чтобы на следующий эмбрион находится в положении впрыска и повторите процедуру; продолжаться, пока все эмбрионы не были введены.

4 Культивирование и вылупления эмбрионов

1. Переместить все инжектированных эмбрионов в блюдо с несколькими Hydra, которые имеют яички (это для того, чтобы все эмбрионы оплодотворяются). Выдержите эмбрионов в 18 ° С инкубатор в то время как они продолжают эмбриогенеза.
2. После того, как этап кутикулы достигается, переместить каждый эмбрион вводят в индивидуальной лунку 24-луночного планшета, заполненной Hydra среды.
3. Выдержите инжектированные эмбрионов в течение 2 недель в темноте при 18 ° С.
4. После 2-недельного периода инкубации, проверять каждый введенный эмбриона под микроскопом рассекает. Обратите внимание на любые случаи, в которых кутикула стадии эмбрион отделен от небольшой кусок родителей ткани и родительская ткань регенерировать. Удалить эту регенерированного полип сразу так, что это не милиstaken для нового детеныша.
5. Переместите тарелку вводимых эмбрионов под аквариуме света при комнатной температуре. Проверьте пластины каждый день, и собрать птенцов. Новые птенцов будет белым, потому что типичный розовый цвет Hydra полипов происходит от артемии они едят.
6. Соблюдайте птенцов под флуоресцентным микроскопом, чтобы обнаружить экспрессию трансгена.

Результаты

Создание трансгенных линий Hydra

Поток трансгенных птенцов каждые 2-3 дня с артемии науплии. Детеныши иногда не едят в течение дня или два после вылупления. Некоторые новые птенцы никогда не буду есть, и, таким образом, не выживет. Если птенец является трансгенным в л...

Обсуждение

Гидра постоянно воспроизводит бесполым, но требует внешних стимулов, чтобы начать производить гаметы. Эти стимулы не хорошо определены для большинства видов Hydra и могут отличаться от штамма к штамму. Существенным препятствием к производству трансгенных Hydra является пол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEP Hydra Strain			Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151